Проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов

Проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки США № 60/975104, поданной 25 сентября 2007, заявки США № 60/989840, поданной 22 ноября 2007 и заявки США № 60/989841, поданной 22 ноября 2007, содержание каждой из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям и способам доставки ингибирующих молекул в микробные клетки, в частности метанопродуцирующие клетки. В особенности, настоящее изобретение относится к сигнальным пептидам и полипептидам, содержащим эти пептиды, а также полинуклеотидам, которые кодируют эти пептиды или полипептиды. Настоящее изобретение также относится к векторам экспрессии и клеткам-хозяевам для получения этих пептидов или полипептидов. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам определения, направленной доставки, проникновения и ингибирования микробных клеток, в особенности, метанопродуцирующих клеток, с использованием описанных пептидов или полипептидов, полинуклеотидов, векторов экспрессии и клеток-хозяев.

Предпосылки к созданию изобретения

В Новой Зеландии сельскохозяйственная деятельность является причиной большинства выбросов парниковых газов. Следовательно, уменьшение сельскохозяйственного выброса парниковых газов является важным для соблюдения обязательств Новой Зеландией Киотского протокола. В соответствии с этим протоколом требуется сократить парниковые газы до уровней 1990 к концу первого периода обязательства (2008-2012). К концу этого срока группы аграрного сектора и правительство Новой Зеландии утвердили исследовательский консорциум по парниковым газам (Pastoral Greenhouse Gas Research Consortium (PGGRC)) для установления способов уменьшения выбросов парниковых газов сельского хозяйства Новой Зеландии.

Важной частью деятельности PGGRC было исследование в отношении уменьшения выбросов метана с новозеландских пастбищ. Уменьшение выбросов метана от жвачных животных представляет коммерческий интерес по двум причинам. Во-первых, несоблюдение обязательств по Киотскому протоколу заставит правительство приобретать квоты на выброс углерода. В настоящее время стоимость этого оценивается в $350 миллионов. Во-вторых, образование метана приводит к потере 8-12% общей энергии, производимой в рубце. Эта энергия могла быть использована, вместо этого, для улучшения продуктивности жвачного животного.

Метан продуцируется в рубце микроорганизмами, называемыми метанопродуцентами, которые являются частью таксономического типа Euryarchaeota в царстве Archaea. Большинство метаногенов растут в CO₂ и H₂, как единственных источниках энергии, но некоторые могут использовать для роста ацетат или метильные соединения. В рубце существует несколько различных родов метанопродуцентов archaea, но виды рода Methanobrevibacter, в особенности, M. ruminantium и M. smithii считаются преобладающими метанопродуцентами у жвачных животных Новой Зеландии. M. ruminantium в настоящее время является предметом проекта секвенирования генома, финансируемого PGGRC. Этот проект представляет собой первое секвенирование генома метанопродуцентов рубца, и его целью является улучшение понимания биологии Methanobrevibacter для обнаружения мишеней для ингибирования образования метана.

Для уменьшения продукции метана в рубце требуется ингибирование метанопродуцентов или инактивация их пути образования метана. Способом ингибирования образования метана является доставка специфических ингибирующих молекул в клетки метанопродуцентов. Это может достигаться, например, соединением ингибирующих молекул с проникающими в клетку пептидами. В микробных клетках сигнальные пептиды опосредуют транслокацию внеклеточных белков из внутренней среды клетки во внешнюю, и подходят для переноса ингибирующих молекул. Следовательно, было бы полезным идентифицировать сигнальные пептиды, которые обладают способностью проникать в клетки метанопродуцентов и доставлять ингибиторы.

Сигнальные пептиды, или сигнальные последовательности, обычно включены в белки-предшественники, секретируемые из прокариотических и эукариотических клеток. Сигнальные пептиды являются частью проникающего в клетку удлинения на N-конце предшественника. Первичная аминокислотная последовательность сигнальных пептидов не является консервативной, за исключением сайта расщепления для сигнальной пептидазы (von Heijne, 1985). Кроме того, сигнальные пептиды обладают структурными сходствами. Сигнальные пептиды обычно включают от одного до пяти положительно заряженных N-концевых аминокислотных остатков (n-область) за которыми следуют от 10 до 15 гидрофобных аминокислотных остатков (h-область). Остаток глицина или пролина обычно расположен в пределах гидрофобного домена, а остаток (остатки) треонина и/или серина образуют полярный домен (c-область) рядом с сайтом расщепления (Inouye and Halegoua, 1980; Vlasuk et al., 1983, von Heijne, 1985).

Была предложена петлевая модель транслокации сигнального пептида (Inouye et al., 1977; Inouye and Halagoua, 1980) посредством которой положительно заряженный N-конец сигнального пептида взаимодействует с отрицательно заряженной внутренней поверхностью клеточной мембраны. Гидрофобный домен затем погружается в гидрофобный липидный бислой мембраны путем образования петли. Эта петля в конечном итоге включает сайт расщепления, который подвергается воздействию сигнальной пептидазы для удаления сигнального пептида. Одним из препятствий для ингибирования или ограничения образования метана является способность доставлять ингибирующие компоненты в клетки метанопродуцентов. Таким образом, существует необходимость в идентификации сигнальных пептидов, которые способны присоединяться к клеточным мембранам и переносить молекулы через липидный бислой, в подходящих носителях для ингибиторов клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к выделенному сигнальному пептиду или полипептиду, содержащему этот пептид, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172. В отдельном аспекте, этот пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность KKLIIILLLLILLLSI последовательности SEQ ID NO:117, или по меньшей мере одну аминокислотную последовательность KKIIIILLLLILLLISI последовательности SEQ ID NO:119. В другом аспекте, этот пептид или полипептид содержит фрагмент, например, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 3-14, 3-16, или 2-16 последовательности SEQ ID NO:117, или по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 3-15, 3-17, или 2-17 последовательности SEQ ID NO:119. В дополнительном аспекте, этот пептид или полипептид содержит фрагмент, содержащий по меньшей мере одну консервативную коровую последовательность последовательности SEQ ID NO:1-172, описанной в настоящей заявке. Еще в одном дополнительном аспекте, этот пептид или полипептид кодируется по меньшей мере фрагментом полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:173-341 или SEQ ID NO:342-533.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему кодирующую последовательность по меньшей мере одного сигнального пептида или полипептида, содержащего этого пептид. В одном аспекте, этот полинуклеотид содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172. В особом аспекте, полинуклеотид содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности KKLIIILLLLILLLSI последовательности SEQ ID NO:117, или кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности KKIIIILLLLILLLISI последовательности SEQ ID NO:119. В другом аспекте, полинуклеотид содержит фрагмент кодирующей последовательности, например, кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты 3-14, 3-16, или 2-16 последовательности SEQ ID NO:117, или кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты 3-15, 3-17, или 2-17 последовательности SEQ ID NO:119. В дополнительном аспекте, полинуклеотид содержит фрагмент кодирующей последовательности, например, нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере одну консервативную коровую последовательность, описанной в настоящей заявке последовательности SEQ ID NO:1-172.

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:173-341 или SEQ ID NO:342-533. В особом аспекте, этот полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:531, 532 или 533. В другом аспекте, полинуклеотид представляет собой фрагмент или олигонуклеотид, например, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, протяженностью от нуклеотидов 7-42, 7-48 или 4-48 последовательности SEQ ID NO:531, 532 или 533. Кроме того, изобретение охватывает выделенный полинуклеотид или его фрагмент, который гибридизируется с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:173-341 или SEQ ID NO:342-533. Настоящее изобретение дополнительно охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий комплементарную, обратно комплементарную, обратную последовательность или их фрагменты, любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих сигнальный пептид или полипептид, содержащий этот пептид.

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одного сигнального пептида или полипептида, содержащего этот пептид. В одном аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-172. В особом аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности KKLIIILLLLILLLSI последовательности SEQ ID NO:117, или кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности KKIIIILLLLILLLISI последовательности SEQ ID NO:119. В другом аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, протяженностью от аминокислот 3-14, 3-16 или 2-16 последовательности SEQ ID NO:117, или кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, содержащей аминокислоты 3-15, 3-17, или 2-17 последовательности SEQ ID NO:119. Еще в одном аспекте, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, например, микробной клетке-хозяину, содержащей по меньшей мере один вектор экспрессии.

Настоящее изобретение в частности относится к антителу, направленному на пептид, полипептид, или полинуклеотид, описанный в настоящей заявке. В определенных аспектах, это антитело направлено по меньшей мере на одну последовательность сигнального пептида, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172, или его модифицированную последовательность. В альтернативных аспектах, антитело направлено по меньшей мере на фрагмент последовательности сигнального пептида, например, консервативную коровую последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172. В дополнительном аспекте, это антитело связывается с полипептидом, содержащим последовательность сигнального пептида любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-172. В альтернативных аспектах, это антитело направлено по меньшей мере на фрагмент полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:173-341 или SEQ ID NO:342-533, или его комплементарную или модифицированную последовательность. В другом аспекте, антитело содержит одно или несколько слияний или конъюгатов по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например, соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими ферментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, антимикробными пептидами и другими антибиотиками, описанными подробно в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к модифицированным сигнальным пептидам и полипептидам, содержащим эти пептиды, и антителам, направленным на эти пептиды или полипептиды, включая биологически активные изменения, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящей заявке. Также описаны полинуклеотиды, кодирующие эти модифицированные пептиды или полипептиды, а также изменения, фрагменты, варианты и производные описанных полинуклеотидов, векторов экспрессии, содержащих эти последовательности нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, содержащие эти векторы. В особых аспектах, в композициях и способах по изобретению используются эти модифицированные полинуклеотиды, полипептиды или антитела, или соответствующие векторы экспрессии или клетки-хозяева. В конкретных аспектах, пептиды или полипептиды получены в виде слияний или конъюгатов по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например, соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими ферментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, антимикробными пептидами и другими антибиотиками, описанными подробно в настоящей заявке.

Изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей выделенный сигнальный пептид (например, по меньшей мере один из SEQ ID NO:1-172, или их модифицированную последовательность) или полипептид, содержащий этот пептид, или антитело, направленное на этот пептид или полипептид. Также описана композиция, содержащая выделенный полинуклеотид (например, по меньшей мере один из SEQ ID NO:173-341 или SEQ ID NO:342-533, или их комплементарную или модифицированную последовательность). Дополнительно описана композиция, которая содержит вектор экспрессии, или клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, в соответствии с настоящим изобретением. Композиция может содержать любые биологически активные изменения, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящей заявке. Композиции дополнительно могут содержать по меньшей мере один клеточный ингибитор, и могут быть получены, например, в виде фармацевтических композиций или в виде добавок к пище, в частности, компонентов кормов для жвачных животных.

В особом аспекте, изобретение относится к композиции по изобретению как части набора для определения и/или измерения, или направленной доставки, проникновения и/или ингибирования микробных клеток, в особенности, клеток метанопродуцентов, в соответствии с описанными способами. Эти наборы содержат: a) по меньшей мере одну композицию, описанную в настоящей заявке; и b) необязательно, инструкции по применению, например, по направленной доставке или проникновению в клетки или ингибированию клеточного роста, или репликации для метанопродуцентов или других микроорганизмов. В особых аспектах, пептид или полипептид, содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172, или ее модифицированную последовательность.

Настоящее изобретение относится к способу получения сигнального пептида или полипептида, содержащего этот пептид, указанный способ предусматривает: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, который содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одного сигнального пептида или полипептида, содержащего этот пептид в условиях, подходящих для экспрессии этого пептида или полипептида; и b) извлечение пептида или полипептида из культуры. Также описаны способы получения описанных композиций. В особых аспектах, пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172, или ее модифицированную последовательность.

Настоящее изобретение также относится к способу получения сигнального пептида или полипептида, содержащего этот пептид, который содержит слияние или конъюгат по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например, соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими ферментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, противомикробными пептидами и другими антибиотиками, подробно описанными в настоящей заявке. Такой способ предусматривает: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, который содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одного пептида или полипептида в условиях, подходящих для экспрессии пептида или полипептида; b) образования слияния или конъюгата (например, путем экспрессии слитой последовательности или химического конъюгата с клеточным ингибитором); и c) извлечение слияния или конъюгата. В особых аспектах, сигнальный пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172, или ее модифицированную последовательность.

Настоящее изобретение относится к способу проникновения в микробную клетку, в частности, клетку метанопродуцент, предусматривающему: a) необязательно, получение или выделение по меньшей мере одного сигнально пептида или полипептида, содержащего этот пептид; и b) контактирование клетки с сигнальными пептидом или полипептидом. В особом аспекте, пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-172, или ее модифицированную последовательность. В дополнительных аспектах, пептид или полипептид содержит слияние или конъюгат по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например, одним или несколькими соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими фрагментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, антимикробными пептидами или другими антибиотиками, описанными подробно в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования микробной клетки (например, ингибирования роста или репликации), в частности, клетки метанопродуцентов, предусматривающему: a) необязательно, получение или выделение по меньшей мере сигнального пептида или полипептида, содержащего этот пептид, который дополнительно содержит по меньшей мере один клеточный ингибитор; и b) контактирование клетки с сигнальным пептидом или полипептидом. В особом аспекте, пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-172, или ее модифицированную последовательность. В дополнительном аспекте клеточный ингибитор выбран из соединений против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислоты), антител и фрагментов антител, литических ферментов, пептид-нуклеиновых кислот, антимикробных пептидов и других антибиотиков, подробно описанных в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования микробной клетки (например, ингибирования роста или репликации), в частности, клетки метанопродуцента, предусматривающему: a) необязательно, получение или выделение по меньшей мере одного сигнального пептида или полипептида, содержащего этот пептид, который дополнительно содержит по меньшей мере один клеточный ингибитор; и b) контактирование клетки с сигнальным пептидом или полипептидом. В особом аспекте, пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-172, или их модифицированных последовательностей. В дополнительном аспекте, клеточный ингибитор выбран из соединений против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислоты), антител и фрагментов антител, литических ферментов, пептид-нуклеиновых кислот, антимикробных пептидов и других антибиотиков, подробно описанных в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к способу определения и/или измерения уровней сигнального пептида или соответствующего полипептида или полинуклеотида, предусматривающему: 1) контактирование образца, полученного от индивида, с антителом, направленным на сигнальный пептид (например, по меньшей мере, одного из SEQ ID NO:1-172, или их модифицированных последовательностей) или соответствующий полипептид или полинуклеотид; и 2) определение наличия или уровней антительного комплекса, образованного с сигнальным пептидом или соответствующим полипептидом или полинуклеотидом в образце. Такие способы также могут быть использованы для определения и/или измерения уровней микробных клеток, в частности, клеток метанопродуцентов.

Настоящее изобретение также относится к способу определения и/или измерения уровней сигнальной последовательности полинуклеотида (например, кодирующей последовательности сигнального пептида, или соответствующей кодирующей последовательности полипептида), предусматривающему: 1) контактирование образца, полученного от индивида, с комплементарным полинуклеотидом (например, последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:173-341, или их модифицированным последовательностям); и 2) определение наличия или уровней гибридизационного комплекса, образованного с сигнальной последовательностью полинуклеотида в этом образце. Такие способы также могут быть использованы для определения и/или измерения уровней микробных клеток, в частности, клеток метанопродуцентов.

В особых аспектах, в способах по изобретению используются in vivo или in vitro компоненты экспрессии. В других аспектах, в способах используются пептиды или полипептиды, продуцируемые рекомбинантными, синтетическими или полусинтетическими способами, или пептиды или полипептиды, продуцируемые эндогенными способами.

Другие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже.

Краткое описание чертежей

Настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления и со ссылкой на чертежи.

ФИГ. 1A-1C: Сравнение геномов метанобактерий (ФИГ. 1A); статистика генома M. ruminantium (ФИГ. 1B); гены, предположительно вовлеченные в образование метана у видов метанобактерий (ФИГ. 1C).

ФИГ. 2: Выравнивание сигнального пептида Methanobrevibacter ruminantium. Коровая консервативная область каждого пептида показана жирным шрифтом.

ФИГ. 3A: Белковая последовательность logo из 102 последовательностей, созданная с использованием LogoBar. ФИГ. 3B: Белковая последовательность logo из 102 последовательностей, созданная с использованием LogoBar, показывающая наиболее консервативные аминокислотные остатки. ФИГ. 3C: Коровая консенсусная последовательность сигнального белка для M. ruminantium. ФИГ. 3D: Аминокислотная последовательность M. ruminantium проникающего в клетку пептида с добавлением N-концевого лизин-флуоресцеина.

ФИГ. 4: Проницаемость в клетки M. ruminantium пептида, меченого флуоресцином.

ФИГ. 5: Диаграмма Венна, показывающая предварительные определения сигнального пептида SignalP 3.0-HMM, с использованием трех различных моделей для M. ruminantium сигнальной последовательности M1093 ORFеомы.

ФИГ. 6: Гены M. ruminantium и соответствующие показатели сигнальных пептидов.

ФИГ. 7: Гены M. ruminantium и соответствующие сигнальные пептиды.

ФИГ. 8: Кодирующие последовательности сигнальных пептидов с ФИГ. 7.

ФИГ. 9: Кодирующие последовательности сигнальных пептидов с ФИГ. 7, с кодонами, оптимизированными для экспрессии в E. coli.

Подробное описание изобретения

Определения

«Измененные» последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие сигнальные пептиды, в контексте настоящего изобретения, включают последовательности с делециями, вставками или заменами различных нуклеотидов, приводящие в результате к полинуклеотиду, который кодирует те же или функционально эквивалентные пептиды. Кодируемый пептид также может быть «измененным» и содержать делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые дают молчащее изменение и приводят к функционально эквивалентному пептиду. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности, и/или амфипатической природы остатков, при условии сохранения биологической активности (например, ассоциации с клеткой или проникновения в клетку), или иммуногенной активности этого пептида. Например, отрицательно заряженные аминокислоты могут включать аспарагиновую и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты могут включать лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, имеющими сходные значения гидрофобности, могут включать лейцин, изолейцин и валин, глицин и аланин, аспарагин и глутамин, серин и треонин, и фенилаланин и тирозин.

«Аминокислотная последовательность» в контексте настоящего изобретения, относится к олигопептиду, пептиду, полипептиду или белковой последовательности, или их фрагментам, и к природным, рекомбинантным, синтетическим или полусинтетическим молекулам. Последовательности по изобретению (например, SEQ ID NO:1-172) содержат по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 17, 19, или 22 аминокислоты, предпочтительно, по меньшей мере 5-10, 5-15, 10-15, 12-15, 15-17, 17-19 или 17-22 аминокислот, и, предпочтительно, сохраняют биологическую активность (например ассоциацию с клеткой или проникновение в клетку) или иммунологическую активность (например, по меньшей мере один сайт связывания с антителом) исходной последовательности. В тех случаях, когда «аминокислотная последовательность», цитируемая в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности молекулы природного пептида или полипептида, считается, что аминокислотная последовательность и подобные термины не ограничивают аминокислотную последовательность до полной, природной аминокислотной последовательности, связанной с полноразмерной молекулой.

«Амплификация» в контексте настоящего изобретения, относится к получению дополнительных копий последовательности нуклеиновой кислоты и в основном проводится с помощью методик полимеразной цепной реакции (ПЦР), хорошо известных из уровня техники (Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).

Термин «антитело» следует понимать в самом широком смысле и предполагается включение интактных моноклональных антител и поликлональных антител. Этот термин также охватывает фрагменты и производные антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность. Антитела охватывают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов (Ig), т.е., молекулы, которые содержат антиген-связывающий сайт, который специфически связывается (иммунологически взаимодействует) с антигеном. Антитела включают, но не только, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, Fc, Fab, Fab', и Fab₂ фрагменты и экспрессионную библиотеку Fab.

Молекулы антитела относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA, IgE, и IgD, которые отличаются друг от друга природой тяжелой цепи, находящейся в молекуле. Эти молекулы также включают подклассы, такие как IgG1, IgG2, и другие. Легкая цепь может представлять собой каппа цепь или лямбда цепь. Ссылка в настоящем описании на антитела включает ссылку на все классы, подклассы и типы. Также включены химерные антитела, например, моноклональные антитела или их фрагменты, которые специфичны более чем к одному источнику, например, одной или более, последовательностям мыши, человека или жвачного животного. Дополнительно включены антитела верблюдовых или нанотела. Будет понятно, что каждая ссылка на «антитела» или любой подобный термин, в настоящем описании включает интактные антитела, а также любые их фрагменты, измерения, производные или варианты.

Термины «биологически активный» или «функциональный», в контексте настоящего описания, относится к пептиду или полипептиду, сохраняющему одну или несколько структурных, иммуногенных или биохимических функций (например, ассоциацию с клеткой или проникновение в клетку) природной последовательности. В качестве одного примера, функциональная последовательность включает по меньшей мере одну из коровых консервативных областей, описанных в настоящей заявке.

Термины «клеточный ингибитор» или «ингибитор», в контексте настоящего писания, относится к средствам, которые снижают или блокируют рост или репликацию микробных клеток, в особенности клеток метанопродуцентов. Клеточный ингибитор может действовать для снижения или блокировки, например, клеточного деления. Ингибитор может снижать или блокировать, например, синтез ДНК, синтез РНК, синтез белка, или пост-трансляционные модификации. Ингибитор также может снижать или блокировать активность ферментов, вовлеченных в каскад образования метана. Ингибитор может делать мишенью клетку для распознавания компонентами иммунной системы. Ингибирование клетки также включает уничтожение клетки и клеточную гибель, например, в результате лизиса, апоптоза, некроза, и т.д. Подходящие ингибиторы включают, но не только, соединения против образования метана (например, бромэтансульфоновую кислоту), антитела и фрагменты антител, литические ферменты, пептид-нуклеиновые кислоты, антимикробные пептиды и другие антибиотики, подробно описанные в настоящей заявке.

Термины «комплементарный» или «комплементарность», в контексте настоящего изобретения, относится к природному связыванию полинуклеотидов в пермиссивных солевых и температурных условиях путем спаривания оснований. Для последовательности A-G-T, комплементарной последовательностью является T-C-A, обратно комплементарная последовательность представляет собой A-C-T, и обратная последовательность представляет собой T-G-A. Комплементарность между двумя одноцепочечными молекулами может быть частичной, при которой только некоторые из нуклеиновых кислот связываются, или может быть полной, когда существует абсолютная комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновых кислот оказывает существенные воздействия на эффективность и прочность гибридизации между цепями нуклеиновых кислот. Это имеет особое значение в реакциях амплификации, которые зависят от связывания между цепями нуклеиновых кислот и в создании и применении молекул РНК.

Термин «производное» в контексте настоящего изобретения относится к химической модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид, или нуклеиновой кислоты, комплементарной ей. Такие модификации включают, например, замену водорода алкилом, ацилом, или аминогруппой. В предпочтительных аспектах, производное нуклеиновой кислоты кодирует пептид, который сохраняет биологическую или иммунологическую функцию природной молекулы. Производный пептид представляет собой пептид, который модифицирован путем гликозилирования, пэгилирования или любым аналогичным способом, который сохраняет одну или несколько биологических функций (например, ассоциацию с клеткой или проникновение в клетку) или иммуногенную функцию последовательности, производным которой он является.

Термин «гомология» в контексте настоящего изобретения относится к степени комплементарности. Гомология может быть частичной (т.е. идентичность менее 100%) или полной (т.е. 100% идентичность). Частично комплементарную последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию идентичной последовательности с целевой нуклеиновой кислотой, называют с использованием функционального термина «по существу гомологичная». Ингибирование гибридизации полностью комплементарной последовательности с целевой последовательностью может быть исследовано с помощью гибридизационного анализа (Саузерн или нозерн блот, гибридизация в растворе и подобное) в условиях низкой жесткости. По существу гомологичная последовательность или гибридизационный зонд будет конкурировать за связывание или ингибировать связывание полностью гомологичной последовательности с целевой последовательностью в условиях низкой жесткости. Нельзя сказать, что условия низкой жесткости таковы, что допускается неспецифическое связывание; условия низкой жесткости требуют, чтобы связывание двух последовательностей друг с другом было специфичным (т.е. селективным) взаимодействием.

Термин «гибридизация» в контексте настоящего изобретения относится к любому процессу, посредством которого цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью посредством спаривания оснований.

«Вставка» или «добавление» в контексте настоящего изобретения относится к изменению в аминокислотной или нуклеотидной последовательности, приводящему к добавлению одного или нескольких аминокислотных остатков или нуклеотидов, соответственно, по сравнению с природной молекулой.

«Метанопродуцент» в контексте настоящего изобретения относится к микроорганизмам, которые продуцируют газ метан, которые включают Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium, и Methanosarcina. Характерные метанопродуценты включают, но не только, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicicum, Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicrobium mobile, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanococcoides burtonii, и Methanolobus taylorii. Все рода и виды метанопродуцентов охватываются этим термином.

«Микробные» клетки в контексте настоящего изобретения относятся к природным или генетически модифицированным микробным клеткам, в том числе архебактериям, таким как метанопродуценты, галофилы и термоацидофилы, и эубактериям, таким как цианобактерии, спирохеты, протеобактерии, а также грамположительным и грамотрицательным бактериям.

Термин «модифицированная» относится к измененным последовательностям и к фрагментам, вариантам и производным последовательностей, описанных в настоящем изобретении.

«Последовательность нуклеиновой кислоты» или «нуклеотидная последовательность» в контексте настоящего изобретения относится к последовательности полинуклеотида, олигонуклеотида или их фрагментам, и к ДНК или РНК природного, рекомбинантного, синтетического или полусинтетического происхождения, которая может быть односпиральной или двухспиральной, и может представлять смысловую или антисмысловую цепь, и кодирующие или некодирующие области. Последовательности по настоящему изобретению наиболее предпочтительно включают последовательности, кодирующие полипептид (например, SEQ ID NO:173-341 или 342-533, или их комплементарные или модифицированные последовательности), которые содержат по меньшей мере 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 45, 51, 57 или 66 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере от 15 до 30, от 15 до 45, от 30 до 45, от 36 до 45, от 45 до 51, от 51 до 57, или от 51 до 66 нуклеотидов, или по меньшей мере 100 нуклеотидов, или по меньшей мере 1000 нуклеотидов. Будет понятно, что каждая ссылка на «последовательность нуклеиновой кислоты» или «нуклеотидную последовательность» в настоящем изобретении будет включать нативную полноразмерную последовательность (например, SEQ ID NO:173-341 или 342-533), а также любые ее комплементнарные последовательности, фрагменты, изменения, производные или варианты.

Термин «олигонуклеотид» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 25, 27, 30 или 36 нуклеотидов, или по меньшей мере от 12 до 36 нуклеотидов, или по меньшей мере от 15 до 30 нуклеотидов (например, по меньшей мере фрагмент последовательностей SEQ ID NO:173-341 или 342-533, или их комплементарная последовательность), которая может быть использована в ПЦР амплификации, секвенировании или гибридизационных анализах. В контексте настоящего изобретения олигонуклеотид по существу является эквивалентным терминам «амплимеры», «праймеры», «олигомеры», «олиги» и «зонды», как обычно определено в данной области.

Термин «полинуклеотид», используемый в единственном или множественном числе, в основном относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, например, любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые могут пр