Варианты альфа-амилазы ts-23 с измененными свойствами

Варианты альфа-амилазы ts-23 с измененными свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИОРИТЕТ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительным патентным заявкам США с номерами 61/026056, поданной 4 февраля 2008 года; и 61/059403, поданной 6 июня 2008 года, которые включены в настоящий документ в виде ссылок в полном объеме.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ

Описаны композиции и способы, связанные с вариантами α-амилазы TS-23 (α-амилазы), причем варианты обладают измененными биохимическими свойствами и преимущественными эксплуатационными характеристиками относительно исходной амилазы. Варианты пригодны для применения, например, для переработки крахмала, продукции этанола, стирки, мытья посуды, очистки твердых поверхностей, расшлихтовки тканей и/или продукции подсластителей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Крахмал состоит из смеси амилозы (15-30% масс./масс.) и амилопектина (70-85% масс./масс.). Амилоза состоит из линейных цепей α-1,4-связанных элементов глюкозы, имеющих молекулярную массу (ММ) от приблизительно 60000 до приблизительно 800000. Амилопектин представляет собой разветвленный полимер, содержащий α-1,6-точки ветвления на каждые 24-30 элементов глюкозы; его ММ может составлять до 100 миллионов.

Сахара из крахмала в форме концентрированных декстрозных сиропов в настоящее время получают посредством катализируемого ферментом процесса, включающего: (1) разжижение (или плавление) твердого крахмала α-амилазой до декстринов, имеющих среднюю степень полимеризации приблизительно 7-10; и (2) осахаривание полученного разжиженного крахмала (т.е. гидролизата крахмала) с помощью амилоглюкозидазы (также называемой глюкоамилазой или GA). Полученный сироп имеет высокое содержание глюкозы. Большую часть сиропа глюкозы, который получают коммерчески, впоследствии подвергают ферментативной изомеризации до смеси декстроза/фруктоза, известной как изосироп.

Альфа-(α)-амилазы (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролазы, EC 3.2.1.1) представляют собой группу ферментов, которые гидролизуют крахмал, гликоген и сходные полисахариды расщеплением внутренних α-1,4-глюкозидных связей случайным образом. Этот класс ферментов имеет ряд важных коммерческих применений, например, на начальных стадиях переработки (при разжижении) крахмала, при расшлихтовке тканей, удалении краски из макулатуры, модификации крахмала в бумажной и целлюлозной промышленности, для влажного измельчения кукурузы, для продукции алкоголя, для изготовления подсластителей (т.е. сахара), в промышленности напитков, в пивоварении, в нефтяном промысле, в кормах для животных и в моющих средствах в детергентных матрицах. Например, эти ферменты можно использовать для удаления крахмальных пятен в процессе мытья посуды и стирки.

α-Амилазы выделяют из широкого множества бактерий, грибов, растений и животных. В промышленности многие важные α-амилазы представляют собой α-амилазы, выделенные из Bacilli. Одной из охарактеризованных α-амилаз является α-амилаза штамма TS-23 алкалофильных Bacillus sp., который продуцирует по меньшей мере пять типов ферментов, проявляющих активность гидролиза крахмала (Lin et al., 1998, "Production and properties of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23", Biotechnol. Appl. Biochem. 28: 61-68). α-Амилаза Bacillus sp. no. TS-23 имеет оптимум pH 9, хотя она является стабильной в широком диапазоне pH (т.е. pH от 4,7 до 10,8). Ее температурный оптимум составляет 45°C, хотя фермент обладает активностью и при более низких температурах, например 15-20°C. Остается необходимость в варианте α-амилазы, которая обладает измененными биохимическими характеристиками и предоставляет улучшенные реализации при промышленном применении.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описаны варианты (мутанты) α-амилазы TS-23, которые обладают измененными свойствами, которые являются преимущественными в отношении различных промышленных процессов, таких как переработка крахмала (например, разжижение, осахаривание крахмала и т.п.), в текстильной промышленности (например, для расшлихтовки) и в качестве добавок к детергентам (например, для очистки пятен крахмала).

Изменения включают, но не ограничиваются ими, изменения удельной активности, специфичности к субстрату, связывания субстрата, характера расщепления субстрата, термической стабильности, устойчивости к окислению, зависимости от Ca²⁺, профиля pH/активности, профиля pH/стабильности и других представляющих интерес свойств. Иллюстративным измененным профилем pH/стабильности является повышенная стабильность при низких pH (например, pH<6 и даже pH<5) и/или повышенная стабильность при высоких pH (например, pH>9).

В одном аспекте предусмотрен вариант исходной α-амилазы AmyTS23, который имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже 99% идентичностью исходной α-амилазе и содержит по меньшей мере два из следующих: (a) укорочение C-конца, (b) замена аминокислоты 201 или (c) делеция остатков R180 и S181, и где вариант обладает активностью α-амилазы (при использовании SEQ ID NO:1 для нумерации). В некоторых вариантах осуществления исходная α-амилаза представляет собой SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления исходная α-амилаза имеет определенную гомологию с SEQ ID NO:1.

Другой аспект предусматривает композицию для ручного или автоматического мытья посуды, содержащую α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 или ее вариант. Кроме того, композиция может содержать одно или несколько из поверхностно-активного вещества, моющего компонента детергента, комплексообразующего вещества, полимера, системы для отбеливания, стабилизатора, пенообразователя, пеногасителя, антикоррозионного вещества, суспендирующего грязь вещества, вещества против повторного осаждения грязи, красителя, бактерицидного вещества, гидротропного вещества, ингибитора потускнения и отдушки. Композиции для мытья посуды могут представлять собой композиции, используемые для ручного или автоматического мытья посуды.

Сходный аспект предусматривает детергентную добавку для стирки, содержащую α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 или ее вариант. Как указано выше, композиция может дополнительно содержать одно или несколько из поверхностно-активного вещества, моющего компонента детергента, комплексообразующего вещества, полимера, системы для отбеливания, стабилизатора, пенообразователя, пеногасителя, антикоррозионного вещества, суспендирующего грязь вещества, вещества против повторного осаждения грязи, красителя, бактерицидного вещества, гидротропного вещества, ингибитора потускнения и отдушки. Композиция также может содержать одно или несколько из поверхностно-активного вещества, моющего компонента детергента, комплексообразующего вещества, полимера, системы для отбеливания, стабилизатора, пенообразователя, пеногасителя, антикоррозионного вещества, суспендирующего грязь вещества, вещества против повторного осаждения грязи, красителя, бактерицидного вещества, гидротропного вещества, оптического отбеливателя, кондиционера для тканей и отдушки.

Следующий аспект относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей описанные варианты, и к векторам, содержащим такие нуклеиновые кислоты. Также предусматриваются клетки, в которые такие нуклеиновые кислоты введены, например, с помощью вектора, фага или вируса. Выделенная клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм, например бактерию или гриб. Бактерия может представлять собой грамположительную бактерию, выбранную из группы, состоящей из Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, G. stearothermophilus (ранее называемую B. stearothermophilus), B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans или S. murinus; или грамотрицательную бактерию, где указанная грамотрицательная бактерия представляет собой Escherichia coli или вид Pseudomonas.

Другие аспекты относятся к способу получения полипептидных вариантов и к применению полипептидных вариантов, отдельно или в сочетании с другими ферментами, включая α-амилолитические ферменты, в различных промышленных процессах, таких как разжижение крахмала. Некоторые аспекты предусматривают применение полипептидных вариантов для стирки и/или мытья посуды. Также предусмотрены способы очистки тканей и/или других твердых поверхностей с использованием полипептидных вариантов. Другой аспект предусматривает применение α-амилазы, описанной в настоящем документе, и любых из вариантов α-амилаз в композиции для расшлихтовки тканей, например, где композиция представляет собой водный раствор. Также предусматриваются способы расшлихтовки тканей с использованием указанных композиций.

Полипептидные варианты необязательно могут находиться в форме непылящего гранулята, микрогранулята, стабилизированной жидкости или защищенного фермента. Другой аспект предусматривает, что детергентная добавка или детергентная композиция дополнительно содержит фермент, выбранный из группы, состоящей из целлюлазы, протеазы, ацилтрансферазы, аминопептидазы, амилазы, карбогидразы, карбоксипептидазы, каталазы, хитиназы, кутиназы, циклодекстрингликотрансферазы, дезоксирибонуклеазы, эстеразы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, галопероксидазы, инвертазы, лакказы, липазы, маннозидазы, оксидазы, пектинолитического фермента, пептидоглутаминазы, пероксидазы, фитазы, полифенолоксидазы, протеолитического фермента, рибонуклеазы, трансглутаминазы, ксиланазы, пуллуланазы, изоамилазы, каррагеназы или любого сочетания этих ферментов. Другие амилазы, предусмотренные для применения в композиции, включают две или более других α-амилаз, β-амилазу, изоамилазу или глюкоамилазу.

Некоторые аспекты предусматривают композицию для переработки крахмала, содержащую α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 или ее варианты, в водном растворе. Также предусматривается способ применения такой композиции для переработки крахмала. Способ и композиция могут дополнительно включать глюкоамилазу, изоамилазу, пуллуланазу, фитазу или их комбинацию. Другой аспект предусматривает композицию для деградации (например, гидролиза) биопленки, содержащую α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 или ее вариант в растворе или геле и необязательно дополнительно содержащую целлюлазу, гемицеллюлазу, ксиланазу, липазу, протеазу, пектиназу, противомикробное средство или любое их сочетание. Также предусматриваются способы гидролиза биопленок с использованием указанных композиций.

Другой предусмотренный аспект представляет собой композицию для осахаривания крахмала, содержащую α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 или ее вариант в растворе. Таким образом, также предусмотрен способ осахаривания крахмала, включающий применение композиции в течение периода, достаточного для осахаривания указанного крахмала.

Другой предусмотренный вариант осуществления представляет собой композицию для разжижения крахмала, содержащую α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 или ее вариант в растворе. Также предусмотрен способ разжижения крахмала, включающий применение композиции с использованием указанной композиции в течение периода, достаточного для разжижения указанного крахмала.

Некоторые конкретные аспекты композиций и способа описаны ниже.

В одном аспекте предусматривается вариант исходной α-амилазы AmyTS23, где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью исходной α-амилазе и содержит по меньшей мере два из следующих:

(a) укорочение C-конца,

(b) замена остатка 201 или

(c) делеция остатков R180 и S181, где указанные аминокислотные остатки относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления вариант обладает активностью α-амилазы.

В некоторых вариантах осуществления вариант обладает по меньшей мере 90% идентичностью исходной α-амилазе. В некоторых вариантах осуществления вариант обладает по меньшей мере 95% идентичностью исходной α-амилазе. В конкретных вариантах осуществления исходная α-амилаза обладает аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах осуществления вариант дополнительно содержит замену в одном или нескольких остатках, выбранных из группы, состоящей из остатка 87, остатка 225, остатка 272 и остатка 282.

В другом аспекте предусматривается вариант исходной α-амилазы AmyTS23, где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 85% идентичностью исходной α-амилазе и содержит укорочение C-конца. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Вариант может обладать повышенной активностью очистки крахмальных пятен в холодной воде по сравнению с исходной амилазой.

В некоторых вариантах осуществления вариант дополнительно содержит делецию остатков в положении R180 и S181, где положения аминокислотных остатков относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Вариант может обладать повышенной детергентной стабильностью по сравнению с исходной амилазой.

В некоторых вариантах осуществления вариант дополнительно содержит замену остатка в положении 201, где положение аминокислотного остатка относится к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Вариант может обладать повышенной окислительной стабильностью по сравнению с исходной амилазой. Вариант может иметь замену M201L.

Любой из вариантов может дополнительно содержать замену в одном или нескольких остатках, выбранных из группы, состоящей из остатка 87, остатка 225, остатка 272 и остатка 282, где положение аминокислотного остатка относится к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.

В сходном аспекте предусматривается нуклеиновая кислота, кодирующая вариант, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предусматривается экспрессирующий вектор, содержащий эту нуклеиновую кислоту, под контролем пригодного промотора. В некоторых вариантах осуществления предусматривается клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор.

В сходном аспекте предусматривается композиция для ручного или автоматического мытья посуды, содержащая вариант, описанный в настоящем документе, и одно или несколько из: поверхностно-активного вещества, моющего компонента детергента, комплексообразующего вещества, полимера, системы для отбеливания, стабилизатора, пенообразователя, пеногасителя, антикоррозионного вещества, суспендирующего грязь вещества, вещества против повторного осаждения грязи, красителя, бактерицидного вещества, гидротропного вещества, ингибитора потускнения и отдушки.

В сходном аспекте предусмотрена детергентная добавка для стирки, содержащая вариант, как описано в настоящем документе, и одно или несколько из поверхностно-активного вещества, моющего компонента детергента, комплексообразующего вещества, полимера, системы для отбеливания, стабилизатора, пенообразователя, пеногасителя, антикоррозионного вещества, суспендирующего грязь вещества, вещества против повторного осаждения грязи, красителя, бактерицидного вещества, гидротропного вещества, оптического отбеливателя, кондиционера для ткани и отдушки.

В другом аспекте предусматривается способ удаления крахмала из тканей, включающий инкубацию тканей в присутствии варианта исходной α-амилазы AmyTS23, где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью исходной α-амилазе и содержит по меньшей мере два из следующих:

(a) укорочение C-конца,

(b) замена остатка 201 или

(c) делеция остатков R180 и S181, где указанные аминокислотные остатки относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и где указанная инкубация удаляет крахмал из ткани.

В сходном аспекте предусматривается способ переработки крахмала, включающий инкубацию ткани в присутствии варианта исходной α-амилазы AmyTS23, где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью исходной α-амилазе и содержит по меньшей мере два из следующих:

(a) укорочение C-конца,

(b) замена остатка 201 или

(c) делеция остатков R180 и S181, где указанные аминокислотные остатки относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и где указанная инкубация гидролизует крахмал.

Эти и другие аспекты и варианты осуществления композиций и способа по настоящему изобретению станут понятными с помощью описания и фигур.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность исходной амилазы AmyTS23 (полноразмерная, зрелая; SEQ ID NO:1).

На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность укороченного полипептида AmyTS23t (зрелая, SEQ ID NO:2). Полужирным и подчеркнутым текстом указаны аминокислотные остатки R180, S181 и M201.

На фиг.3 представлена последовательность ДНК оптимизированного гена amyTS23 (SEQ ID NO:3).

На фиг.4 представлена последовательность ДНК оптимизированного гена amyTS23t (SEQ ID NO:4).

На фиг.5 представлена экспрессирующая кассета для AmyTS23 и AmyTS23t.

На фиг.6 представлен график, на котором показаны результаты анализа очистки образца ткани c помощью полноразмерной амилазы AmyTS23 (AmyTS23fl) и контроля OxAm.

На фиг.7 представлен график, на котором показаны результаты анализа очистки образцов амилазой AmyTS23fl и контролем OxAm.

На фиг.8 представлен график, на котором показаны результаты анализа очистки образца ткани амилазой AmyTS23t и контролем OxAm.

На фиг.9 представлен график, на котором показаны результаты анализа очистки образца AmyTS23t и контролем OxAm.

На фиг.10 представлен график, на котором показано ускоренное исследование стабильности с AmyTS23t и AmyTS23tΔRS в двух различных составах детергента для стирки.

На фиг.11 представлен график, на котором показана окислительная стабильность AmyTS23t, AmyTS23tΔRS и AmyTS23t(M201L+ΔRS).

На фиг.12 представлен график, на котором показаны характеристики AmyTS23tΔRS в жидком детергенте на образцах с рисовым крахмалом.

На фиг.13 представлен график, на котором показана остаточная активность в качестве функции изменения заряда.

На фиг.14 представлены дополнительные аминокислотные и нуклеотидные последовательности, указанные в описании.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Описаны композиции и способы, включающие α-амилазу Bacillus sp. no. TS-23 и ее варианты. Варианты TS-23 обладают измененными биохимическими характеристиками и демонстрируют высокую эффективность, например, в применениях, связанных со стиркой и мытьем посуды. Эти и другие признаки вариантов, а также применения с использованием вариантов подробно описаны.

1. Сокращения и определения

Применяются следующие сокращения и определения. Формы единственного числа включают множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, указание на "фермент" включает множество таких ферментов, а указание на "состав" включает указание на один или несколько составов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д.

Если в настоящем документе не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в области. В Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) предоставлены для специалиста в данной области словари многих из терминов, использованных в настоящем документе.

Некоторые аспекты композиций и способов основываются на общепринятых технологиях и способах, используемых в области генетической инженерии и молекулярной биологии. Следующие источники включают описания общей технологии, пригодной в соответствии с композициями и способами по настоящему изобретению: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL (2nd Ed., 1989), Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL (1990) и Ausubel et al., Eds CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994). В этих общих ссылках предоставлены определения и способы, известные специалистам в данной области. Однако не подразумевается, что композиции и способы ограничиваются какими-либо конкретными описанными способами, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьировать. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, можно использовать на практике или при тестировании композиций и способов по настоящему изобретению, предпочтительные способы и материалы описаны.

При описании белков и генов, которые кодируют их, название гена, как правило, указано курсивом и непрописными буквами, в то время как название белка, как правило, не указано курсивом, и первая буква является прописной.

Все патенты и публикации, указанные в настоящем документе, включая все последовательности, описанные в таких патентах и публикациях, полностью включены в виде ссылок.

1.1 Определения

Как используют в настоящем документе, термин "крахмал" относится к любому материалу, состоящему из комплексных полисахаридных углеводов растений, состоящих из амилозы и амилопектина с формулой (C₆H₁₀O₅)_x, где "X" может представлять собой любое число. В частности, термин относится к любому растительному материалу, включая, но не ограничиваясь ими, зерна, травы, клубни и корни, более конкретно, пшеницу, ячмень, кукурузу, рожь, рис, сорго, отруби, маниоку, просо, картофель, сладкий картофель и тапиоку.

Как используют в настоящем документе, "амилаза" представляет собой фермент, способный катализировать деградацию крахмала. Амилазы представляют собой гидролазы, которые расщепляют α-D-(1→4) O-гликозидные связи в крахмале. Как правило, α-амилазы (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-глюканглюканогидролазы) определяют как эндо-действующие ферменты, расщепляющие α-D-(1→4)-O-гликозидные связи в молекуле крахмала случайным образом. В противоположность этому, экзо-действующие амилолитические ферменты, такие как β-амилазы (EC 3.2.1.2; α-D-(1→4)-глюканмальтогидролаза) и некоторые продукт-специфические амилазы, такие как мальтогенная α-амилаза (EC 3.2.1.133), расщепляют молекулу крахмала с невосстанавливающего конца субстрата. β-Амилазы, α-глюкозидазы (EC 3.2.1.20; α-D-глюкозидглюкогидролаза), глюкоамилазы (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-глюканглюкогидролаза) и продукт-специфические амилазы могут продуцировать из крахмала мальтоолигосахариды определенной длины. Как используют в настоящем документе, амилазы включают любые/все амилазы, включая глюкоамилазы, α-амилазы, β-амилазы и α-амилазы дикого типа, такие как амилазы Bacillus sp., например B. lichemformis и B. subtilis.

Как используют в настоящем документе, "α-амилаза штамма TS-23 Bacillus sp." и сходные выражения относятся к α-амилазе из штамма TS-23 Bacillus sp. Ген, кодирующий α-амилазу, может представлять собой ген дикого типа или кодон-оптимизированный полинуклеотид, который кодирует α-амилазу. Зрелая α-амилаза штамма TS-23 Bacillus sp. представляет собой (в ориентации от N к С) (SEQ ID NO:1, фиг.1):

Как используют в настоящем документе, "варианты α-амилазы штамма TS-23 Bacillus sp." и сходные выражения относятся к вариантам/мутантам α-амилазы дикого типа штамма TS-23 Bacillus sp., который включает аминокислотную замену, вставку или делецию относительно аминокислотной последовательности исходной (дикого типа) амилазы штамма TS-23 Bacillus sp. Термин "вариант" используют взаимозаменяемо с термином "мутант". Вариант α-амилазы Bacillus sp. штамма TS-23 может включать мутации в сигнальной последовательности относительно исходной сигнальной последовательности. Кроме того, вариант α-амилазы Bacillus sp. штамма TS-23 может находиться в форме слитого белка, содержащего гетерологичную сигнальную последовательность α-амилазы, например, из B. licheniformis (LAT).

Как используют в настоящем документе, выражения "исходная α-амилаза Bacillus sp. штамма TS-23", "α-амилаза Bacillus sp. штамма TS-23 дикого типа", "эталонная α-амилаза Bacillus sp. штамма TS-23" и сходные выражения относятся к полипептиду Bacillus sp. штамма TS-23. Термин может быть сокращен как "исходный фермент", "фермент дикого типа", "исходный полипептид", "эталонный полипептид" или сходные с ними, для удобства. Исходная α-амилаза Bacillus sp. штамма TS-23 может включать мутации в сигнальной последовательности исходного полипептида. Кроме того, исходная α-амилаза штамма TS-23 Bacillus sp. может находиться в форме слитого белка, содержащего гетерологичную сигнальную последовательность α-амилазы, например, из B. licheniformis (LAT).

"Исходная нуклеиновая кислота/полинуклеотид", "нуклеиновая кислота/полинуклеотид дикого типа" или "эталонная нуклеиновая кислота/полинуклеотид" относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный полипептид, и к нуклеиновой кислоте, комплементарной ей.

"Вариант нуклеиновой кислоты/полинуклеотида" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидный вариант или нуклеиновую кислоту, комплементарную ей, или к полинуклеотидной последовательности, имеющей замену, вставку или делецию по меньшей мере одного основания, относительно последовательности исходного полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, комплементарной ему. Когда указано, такие нуклеиновые кислоты могут включать нуклеиновые кислоты, имеющие определенную степень гомологии с эталонной последовательностью или способные гибридизоваться с эталонной последовательностью, например, в строгих условиях [например, 50°С и 0,2X SSC (1X SSC=0,15M NaCl, 0,015M Na₃-цитрат, pH 7,0)] или в высоко строгих условиях [например, 65°С и 0,1X SSC (1X SSC=0,15M NaCl, 0,015M Na₃-цитрат, pH 7,0)]. Вариант нуклеиновой кислоты может быть оптимизирован для того, чтобы отражать предпочтительное использование кодона для определенных организмов-хозяев, таких как метилотрофные дрожжи (например, Pichia, Hansenula, и т.д.) или нитчатые грибы (например, Trichoderma (например, T. Reesei) и т.д.) или другие экспрессирующие хозяева (например, Bacillus, Streptomyces и т.п.).

Термин "рекомбинантный" при использовании в отношении рассматриваемой клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы введением гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменением нативной нуклеиновой кислоты или белка или что клетка происходит из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае аномально экспрессируются, сверхэкспрессируются или не экспрессируются совсем.

Термины "извлеченный", "выделенный" и "отделенный" относятся к соединению, белку, клетке, нуклеиновой кислоте или аминокислоте, которые удалены по меньшей мере из одного компонента, с которым они естественным образом ассоциированы и встречаются в природе.

Как используют в настоящем документе, "очищенный" относится к материалу (например, к выделенному полипептиду или полинуклеотиду), который находится в его относительно чистом состоянии, например он является по меньшей мере приблизительно на 90% чистым, или по меньшей мере приблизительно на 95% чистым, по меньшей мере приблизительно на 98% чистым или по меньшей мере приблизительно на 99% чистым.

Термины "термостабильный" и "термостабильность" относятся к способности фермента сохранять активность после воздействия повышенных температур. Термическую стабильность фермента, такого как ферменты α-амилазы, определяют по его времени полужизни (t_1/2), приводимому в минутах, часах или сутках, в ходе которого утрачивается половина активности фермента в определенных условиях. Время полужизни вычисляют посредством измерения остаточной активности α-амилазы после воздействия (т.е. нагрузки) повышенной температуры.

"Диапазон pH" относится к диапазону значений pH, при которых фермент проявляет каталитическую активность.

Как используют в настоящем документе, термины "pH-стабильный" и "pH-стабильность" относятся к способности фермента сохранять активность на протяжении широкого диапазона pH в течение заданного периода времени (например, 15 мин, 30 мин, 1 час и т.п.).

Как используют в настоящем документе, "аминокислотная последовательность" является синонимом терминов "полипептид", "белок" и "пептид", и их используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Когда такая аминокислотная последовательность проявляет активность, она может называться "ферментом". В настоящем документе используют общепринятый однобуквенный или трехбуквенный код для аминокислотных остатков.

Термин "нуклеиновая кислота" охватывает ДНК, РНК, гетеродуплексы и синтетические молекулы, способные кодировать полипептид. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой их химические модификации. Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" используют взаимозаменяемо. Поскольку генетический код является вырожденным, для кодирования конкретной аминокислоты можно использовать более одного кодона, и настоящие композиции и способы охватывают нуклеотидные последовательности, которые кодируют конкретную аминокислотную последовательность.

Если нет иных указаний, нуклеиновые кислоты представлены слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности представлены слева направо в ориентации от N к С соответственно.

"Гомолог" означает структуру, обладающую определенной степенью идентичности с рассматриваемыми аминокислотными последовательностями и рассматриваемыми нуклеотидными последовательностями. Гомологичная последовательность включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже на 99% идентичную рассматриваемой последовательности, при использовании традиционных инструментов выравнивания последовательностей (например, Clustal, BLAST и т.п.). Как правило, гомолог может включать те же остатки активного центра, что и рассматриваемая аминокислотная последовательность, если нет иных указаний.

Как используют в настоящем документе, "гибридизация" относится к процессу, посредством которого одна цепь нуклеиновой кислоты образует пары оснований с комплементарной цепью, как в способах блот-гибридизации и способах ПЦР.

Как используют в настоящем документе, "синтетическая" молекула продуцируется химическим и ферментативным синтезом in vitro, а не организмом.

Как используют в настоящем документе, термины "трансформированный", "стабильно трансформированный" и "трансгенный", используемые в отношении клетки, означают, что клетка имеет ненативную (например, гетерологичную) последовательность нуклеиновой кислоты, встроенную в ее геном или находящуюся в ней в качестве эписомальной плазмиды, которая сохраняется на протяжении множества поколений.

Термин "введенный" в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку означает "трансфекцию", или "трансформацию", или "трансдукцию", как известно в данной области.

"Штамм-хозяин" или "клетка-хозяин" представляет собой организм, в который введен вектор, фаг, вирус или другая конструкция ДНК, включающие полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид (например, вариант α-амилазы). Иллюстративные штаммы-хозяева представляют собой бактериальные клетки. Термин "клетка-хозяин" включает протопласты, образованные из клеток, такие как протопласты Bacillus sp.

Термин "гетерологичный" в отношении полинуклеотида или белка относится к полинуклеотиду или белку, который в природе не встречается в клетке-хозяине.

Термин "эндогенный" в отношении полинуклеотида или белка относится к полинуклеотиду или белку, который встречается в клетке-хозяине в природе.

Как используют в настоящем документе, термин "экспрессия" относится к процессу, посредством которого получают полипептид на основе последовательности нуклеиновой кислоты гена. Процесс включает как транскрипцию, так и трансляцию.

Термины "селективный маркер" или "селектируемый маркер" относятся к гену, способному экспрессироваться в хозяине, обеспечивая простоту селекции клеток-хозяев, которые содержат этот ген. Примеры селективных маркеров включают, но не ограничиваются ими, гены устойчивости к противомикробным средствам (например, гигромицину, блеомицину или хлорамфениколу) и/или гены, которые обеспечивают метаболическое преимущество, такое как пищевое преимущество, в клетке-хозяине.

"Культивирование" относится к росту популяции микробных клеток в пригодных условиях в жидкой или твердой среде. Культивирование включает ферментативное биопревращение крахмального субстрата, содержащего гранулярный крахмал, в конечный продукт (как правило, в емкости или реакторе).

"Ферментация" представляет собой ферментативное и анаэробное разложение органических веществ микроорганизмами с образованием более простых органических соединений. Хотя ферментация происходит в анаэробных условиях, не предполагается, что термин ограничивается строго анаэробными условиями, поскольку ферментация также происходит в присутствии кислорода.

"Ген" относится к сегменту ДНК, который вовлечен в образование полипептида и включает кодирующие области, области, предшествующие кодирующим областям и следующие после них, и встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

"Вектор" относится к полинуклеотидной последовательности, предназначенной для введения нуклеиновых кислот в один или несколько типов клеток. Векторы включают клонирующие векторы, экспрессирующие векторы, челночные векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и т.п.

"Экспрессирующий вектор" относится к конструкции ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, которая функционально связана с пригодной последовательностью контроля, способной осуществлять экспрессию ДНК в пригодном хозяине. Такие последовательности контроля могут включать промотор для осуществления транскрипции, необязательную последовательность оператора для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую пригодные участки связывания рибосом на мРНК, энхансеры и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции.

"Промотор" представляет собой регуляторную последовательность, которая вовлечена в связывание РНК-полимеразы для инициации транскрипции гена. Промотор может представлять собой индуцибельный промотор или конститутивный промотор. Иллюстративным промотором является промотор α-амилазы (AmyL) Bacillus licheniformis.

Термин "функционально связанный" означает, что определенные компоненты взаимосвязаны (включая, но не ограничиваясь этим, соседнее положение), что позволяет им функционировать предполагаемым для них образом. Например, регуляторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, так чтобы экспрессия кодирующей последовательности была под контролем регуляторных последовательностей.

Термин "под транскрипционным контролем" означает, что транскрипция полинуклеотидной последовательности, как правило, последовательности ДНК, зависит от функционально связанного с ней элемента, который обеспечивает инициацию транскрипции или запускает ее.

Термин "под трансляционным контролем" означает, что трансляция полинуклеотидной последовательности, как правило, последовательности РНК, в полипептид зависит от функционально связанного с ней элемента, который обеспечивает инициацию трансляции или запускает ее.

"Сигнальная последовательность" представляет собой последовательность аминокислот, связанную с N-концевой частью белка, которая облегчает секрецию белка за пределы клетки. Зрелая форма внеклеточного белка лишена сигнальной последовательности, которая отщепляется в ходе процесса секреции.

Как используют в настоящем документе, "биологически активный" относится к последовательности, имеющей определенную биологическую активность, такую как ферментативная активность. В случае амилаз по настоящему изобретению активность представляет собой активность α-амилазы.

"Жесткость воды" является показателем неорганических элементов (например, кальция и магния), присутствующих в воде.

"Осахаривание" относится к ферментативному превращению крахмала в глюкозу.

"Желатинизация" означает солюбилизацию молекулы крахмала обработкой, образующей вязкую суспензию.

"Разжижение" относится к стадии превращения крахмала, в которой желатинизированный крахмал гидролизуется с