Конъюгированные белки с пролонгированным действием in vivo

Конъюгированные белки с пролонгированным действием in vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к конъюгированным белкам, в частности, но не исключительно, к факторам свертывания крови, к способам получения этих конъюгатов, к фармацевтическим композициям, содержащим эти конъюгаты, и к применению конъюгатов в терапии, в частности, но не исключительно, для лечения заболеваний, облегчаемых факторами свертывания крови, такого как профилактическое лечение гемофилии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Свертывание крови представляет собой процесс, состоящий в комплексном взаимодействии различных компонентов (или факторов) крови, которое, в конечном счете, вызывает образование фибринового сгустка. Как правило, компоненты крови, которые участвуют в том, что называют "каскадом" свертывания крови, представляют собой ферментативно неактивные белки (проферменты или зимогены), которые преобразуются в протеолитические ферменты под действием активатора (который сам по себе представляет собой активированный фактор свертывания крови). Факторы свертывания крови, которые претерпели такое преобразование, обычно называют "активными факторами" и обозначают добавлением буквы "а" к названию фактора свертывания крови (например, фактор VII(a)).

Для пациентов с тяжелой гемофилией существует направление отхода от лечения по необходимости к профилактическим режимам, чтобы предотвратить кровотечение и последующее объединенное повреждение. Однако в связи с их коротким периодом полувыведения из циркулирующей крови факторы свертывания крови, такие как FVIII, FIX и FVIIa, в частности, не идеальны для долгосрочного профилактического лечения, поскольку для поддержания фармакологически релевантных уровней в плазме требуются как высокие дозы, так и частые инъекции. Поэтому в настоящее время внимание сосредоточено в направлении разработки длительно действующих аналогов, которые являются лучше подходящими для профилактического применения.

Пегилирование является установленным способом продления периода полувыведения белков из циркулирующей крови. Однако, в связи с большой пограничной поверхностью взаимодействия факторов свертывания крови в пределах клеточной мембраны с другими факторами и кофакторами свертывания крови, существуют ограниченные возможности для химической модификации без разрушительной потери активности.

Таким образом, существует огромная потребность в разработке факторов свертывания крови с повышенными периодами полувыведения из плазмы для профилактического лечения гемофилии.

В WO 2005/027978 (Novo Nordisk A/S) описаны производные глюкаконоподобного пептида-1 (GLP-1), которые обладают пролонгированным профилем действия, где эти полипептиды связаны с альбумин-связывающим остатком через гидрофильный спейсер.

В изобретении, таким образом, предложены новые белковые конъюгаты с улучшенными фармакологическими свойствами, а также способы их получения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с первым аспектом изобретения предложен способ получения конъюгированного белка или гликопротеина, который включает стадии взаимодействия белка или гликопротеина с нерастворимым в воде альбумин-связывающим веществом в присутствии молекулы возможно замещенного циклодекстрина.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предложен белковый конъюгат, который содержит белок или гликопротеин, связанный с альбумин-связывающим остатком через гидрофильный спейсер, или его фармацевтически приемлемая соль, сольват или пролекарство.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предложен белковый конъюгат формулы (I):

(A - W - B)_y-P,

где Р представляет собой белок или гликопротеин;

В представляет собой гидрофильный спейсер;

W представляет собой химическую группу, связывающую А и В;

А представляет собой альбумин-связывающий остаток; и

у представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват или пролекарство.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предложен способ получения конъюгированного фактора свертывания крови, который включает стадии взаимодействия фактора свертывания крови, как определено в данной заявке, с модифицирующей группой, как определено в данной заявке.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предложен конъюгированный фактор свертывания крови, содержащий фактор свертывания крови, как определено в данной заявке, конъюгированный с модифицирующей группой, как определено в данной заявке.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предложен способ лечения гемофилии, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества конъюгированного фактора свертывания крови, как определено в данной заявке.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "белок", "полипептид" и "пептид", как используют в данной заявке, соединение, состоящее по меньшей мере из пяти составляющих аминокислот, соединенных пептидными связями. Составляющие аминокислоты могут относиться к группе аминокислот, кодируемых генетическим кодом, и они могут представлять собой природные аминокислоты, которые не кодируются генетическим кодом, а также синтетические аминокислоты. Природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, являются, например, гидроксипролин, у-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аланин и D-глутамин. Синтетические аминокислоты включают аминокислоты, полученные путем химического синтеза, то есть D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин и D-лейцин, Aib (а-аминоизомасляная кислота), Abu (а-аминомасляная кислота), Tie (тpeт-бутил глицин), β-аланин, 3-аминометилбензойная кислота, антраниловая кислота. Должно быть понятно, что термин "конъюгированный", используемый в данной заявке в отношении белка или гликопротеина, относится к определенной конъюгации с альбумин-связывающим остатком в соответствии с изобретением. Должно быть также понятно, что белок или гликопротеин, используемый в способе конъюгации по изобретению, может быть уже конъюгирован с другими группировками, такими как сахарная группировка.

Термин "гликопротеин", как используют в данной заявке, относится к белкам, которые содержат олигосахаридные цепи (гликаны), ковалентно присоединенные к их полипептидным боковым цепям. Должно быть понятно, что когда гликопротеин используют в способе конъюгации по изобретению, альбумин-связывающий остаток может быть связан с этим гликопротеином через остаток гликана.

В настоящем контексте термин "соединение гормона роста", как используют в данной заявке, означает гормон роста, имеющий происхождение от млекопитающих, такой как гормон роста человека, быка или свиньи, и рекомбинантный гормон роста, такой как рекомбинантный гормон роста человека, быка или свиньи, а также варианты таких гормонов роста. Как используют в данной заявке, "GH" и "соединение гормона роста" взаимозаменяемы. Когда GH представляет собой вариант гормона роста, имеющего происхождение от млекопитающих, такого как hGH и рекомбинантный hGH, этот вариант понимают как соединение, полученное путем замены одного или более чем одного аминокислотного остатка в последовательности гормона роста, например hGH, другой природной или неприродной аминокислотой; и/или путем добавления одной или более чем одной природной или неприродной аминокислоты к последовательности гормона роста, например hGH; и/или путем делеции одного или более чем одного аминокислотного остатка из последовательности гормона роста, например hGH, где за любой из этих стадий может необязательно следовать дальнейшая дериватизация одного или более чем одного аминокислотного остатка. В частности, такие замены являются консервативными в том смысле, что один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком из той же группы, то есть другим аминокислотным остатком с подобными свойствами. Аминокислоты могут быть для удобства подразделены на приведенные ниже группы на основании их свойств: Основные аминокислоты (такие как аргинин, лизин, гистидин), кислые аминокислоты (такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярные аминокислоты (такие как глутамин, цистеин и аспарагин), гидрофобные аминокислоты (такие как лейцин, изолейцин, пролин, метионин и валин), ароматические аминокислоты (такие как фенилаланин, триптофан, тирозин) и малые аминокислоты (такие как глицин, аланин, серин и треонин). Типично GH обладает по меньшей мере 80% идентичности с hGH, и типично обладает по меньшей мере 20% активности гормона роста hGH, как определено в данной заявке в анализе I.

В настоящем контексте термин "альбумин-связывающий остаток", как используют в данной заявке, означает остаток, который нековалентно связывается с сывороточным альбумином человека. Альбумин-связывающий остаток, присоединенный к белку или гликопротеину, типично обладает связывающим сродством в отношении сывороточного альбумина человека, которое составляет ниже примерно 10 мкМ или даже ниже примерно 1 мкМ. Ряд альбумин-связывающих остатков известен среди нормальных и разветвленных липофильных группировок, содержащих 12-40 атомов углерода, соединений с циклопентанофенантреновым каркасом и/или пептидов, имеющих 10-45 аминокислотных остатков, и т.д. Альбумин-связывающие свойства можно измерить с помощью поверхностного плазменного резонанса, как описано в J. Вiоl. Chem. 277(38), 35035-35042, (2002).

Термин "гидрофильный спейсер", как используют в данной заявке, означает спейсер, который разделяет белок или гликопротеин и альбумин-связывающий остаток, с химической группировкой, которая содержит по меньшей мере 5 атомов не водорода, где 30-50% из них представляет собой N или О.

Термин "нерастворимый в воде" относится к группировке, имеющей cLogP>0.

Термин "водорастворимый" относится к группировке, имеющей cLogP<0.

В настоящем контексте термин "переаминирование" и родственные термины предназначены для указания реакции, где амидный атом азота в боковой цепи глутамина обменивается с атомом азота из другого соединения, в частности с атомом азота из другого азотсодержащего нуклеофила.

В настоящем контексте термин "недоступен" предназначен для указания того, что что-либо отсутствует или фактически отсутствует в том смысле, что не может быть достигнуто. Когда указано, что функциональные группы недоступны в белке, который нужно конъюгировать, это должно указывать на то, что данная функциональная группа отсутствует в белке или, если присутствует, то каким-либо образом предотвращено ее участие в реакциях. Например, эта функциональная группа может быть глубоко погружена в структуру белка, так что она защищена от участия в реакции. Признано, что, является ли функциональная группа доступной или нет, зависит от условий реакции. Можно рассматривать, что, например, в присутствии денатурирующих агентов или при повышенных температурах белок может развертываться с открытием функциональных групп, которые в ином случае недоступны. Должно быть понятно, что "недоступен" означает "недоступен при условиях реакции, выбранных для конкретной интересующей реакции".

Термин "алкан" или "алкил" предназначен для указания насыщенного, нормального, разветвленного и/или циклического углеводорода. Если не указано другое число атомов углерода, термин предназначен для указания углеводородов с 1-30 (включительно) атомами углерода, как, например, 1-20 (включительно), как, например, 1-10 (включительно), например, от 1 до 5 (включительно). Термины алкил и алкилен относятся к соответствующему радикалу и бирадикалу, соответственно.

Термин "C_1-6 алкил" относится к прямоцепочечному или разветвленному насыщенному углеводороду, имеющему от одного до шести атомов углерода включительно. Примеры таких групп включают, но не ограничены ими, метил, 2-пропил, 1-бутил, 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил и н-гексил.

Термин "С_3-10 циклоалкил" типично относится к циклопропилу, циклобутилу, циклопентилу, циклогексилу, цикпогептилу, циклооктилу, циклононилу и циклодеканилу.

Термин "алкен" предназначен для указания нормальных, разветвленных и/или циклических углеводородов, содержащих по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Если не указано другое число атомов углерода, термин предназначен для указания углеводородов с 2-30 (включительно) атомами углерода, как, например, 2-20 (включительно), как, например, 2-10 (включительно), например, от 2 до 5 (включительно). Термины алкенил и алкенилен относятся к соответствующему радикалу и бирадикалу, соответственно.

Термин "алкин" предназначен для указания нормальных, разветвленных и/или циклических углеводородов, содержащих по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, и которые могут возможно содержать одну или более чем одну углерод-углеродную двойную связь. Если не указано другое число атомов углерода, термин предназначен для указания углеводородов с 2-30 (включительно) атомами углерода, как, например, 2-20 (включительно), как, например, 2-10 (включительно), например, от 2 до 5 (включительно). Термины алкинил и алкинилен относятся к соответствующему радикалу и бирадикалу, соответственно.

Термин "гомоциклическое ароматическое соединение" предназначен для указания ароматических углеводородов, таких как бензол и нафталин.

Термин "гетероциклическое соединение" предназначен для указания циклического соединения, содержащего 5, 6 или 7 кольцевых атомов, из которых 1, 2, 3 или 4 представляют собой гетероатомы, выбранные из N, О и/или S. Примеры включают гетероциклические ароматические соединения, такие как тиофен, фуран, пиран, пиррол, имидазол, пиразол, изотиазол, изоксазол, пиридин, пиразин, пиримидин, пиридазин, а также их частично или полностью гидрогенизированные эквиваленты, такие как пиперидин, пиразолидин, пирролидин, пирролин, имидазолидин, имидазолин, пиперазин и морфолин.

Термины "гетероалкан", "гетероалкен" и "гетероалкин" предназначены для указания алканов, алкенов и алкинов, как определено выше, в которых в структуру этих группировок встроен один или более чем один гетероатом или группа. Примеры гетерогрупп и атомов включают -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -C(O)-, -C(S)- и -N(R*)-, где R* представляет собой атом водорода или Ci-Cg-алкил. Примеры гетероалканов включают:

,	,	,
,	,	,

Термин "радикал" или "бирадикал" предназначен для указания соединения, из которого удален один или два, соответственно, атома водорода. Когда конкретно указано, радикал может также включать группировку, образованную в результате предшествующего удаления из соединения большей группы атомов, например, гидроксила.

Термин "галоген" предназначен для указания членов седьмой основной группы периодической таблицы, например F, CI, Вг и I.

В настоящем контексте термин "арил" предназначен для указания карбоциклического ароматического кольцевого радикала или радикала конденсированной ароматической кольцевой системы, где по меньшей мере одно из колец является ароматическим. Типичные арильные группы включают фенил, дифенилил, нафтил и тому подобное.

Термин "гетероарил" или "гетарил", как используют в данной заявке, один или в комбинации, относится к ароматическому кольцевому радикалу, например, с 5-7 атомами-членами, или к радикалу конденсированной ароматической кольцевой системы, например, с 7-18 атомами-членами, где по меньшей мере одно из колец является ароматическим, содержащему в качестве кольцевого атома один или более чем один гетероатом, выбранный из гетероатомов азота, кислорода или серы, где N-оксиды, а также монооксиды серы и диоксиды серы являются допустимыми гетероароматическими замещениями. Примеры включают фуранил, тиенил, тиофенил, пирролил, имидазолил, пиразолил, триазолил, тетразолил, тиазолил, оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, изотиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиразинил, пиримидинил, хинолинил, изохинолинил, бензофуранил, бензотиофенил, индолил и индазолил и тому подобное.

Отметка звездочкой, используемая в химических структурах, в данной заявке указывает на присутствие открытой связи, пригодной для присоединения.

Термин "конъюгат" как существительное предназначен для указания модифицированного белка, то есть белка с группировкой, связанной с ним с целью модификации свойств этого белка. Как глагол, этот термин предназначен для указания процесса связывания группировки с белком для модификации свойств этого белка.

Как используют в данной заявке, термин "пролекарство" указывает биогидролизуемые амиды и биогидролизуемые сложные эфиры, а также охватывает а) соединения, в которых биогидролизуемая функциональная группа в таком пролекарстве включена в соединение в соответствии с настоящим изобретением, и б) соединения, которые могут быть окислены или восстановлены биологически в данной функциональной группе с получением лекарственных веществ в соответствии с настоящим изобретением. Примеры этих функциональных групп включают 1,4-дигидропиридин, N-алкилкарбонил-1,4-дигидропиридин, 1,4-циклогексадиен, трет-бутил и тому подобное.

Как используют в данной заявке, термин "биогидролизуемый сложный эфир" представляет собой сложный эфир лекарственного вещества (в данном случае, соединения в соответствии с изобретением), который либо а) не препятствует биологической активности исходного вещества, но придает этому веществу предпочтительные свойства in vivo, такие как продолжительность действия, начало действия и тому подобное, либо б) является биологически неактивным, но легко преобразуется in vivo субъектом в биологически активное вещество. Преимуществом является, например, повышенная растворимость или то, что биогидролизуемый сложный эфир всасывается перорально из кишечника и преобразуется в соединение в соответствии с настоящим изобретением в плазме. Многие их примеры известны в данной области техники и включают, например, сложные низшие алкилэфиры (например, C₁-C₄), низшие ацилоксиалкилэфиры, низшие алкоксиацилоксиалкилэфиры, алкоксиацилоксиэфиры, алкилациламиноалкилэфиры и холиновые эфиры.

Как используют в данной заявке, термин "биогидролизуемый амид" представляет собой амид лекарственного вещества (в данном случае, соединение в соответствии с настоящим изобретением), который либо а) не препятствует биологической активности исходного вещества, но придает этому веществу предпочтительные свойства in vivo, такие как продолжительность действия, начало действия и тому подобное, либо б) является биологически неактивным, но легко преобразуется in vivo субъектом в биологически активное вещество. Преимуществом является, например, повышенная растворимость или то, что биогидролизуемый амид всасывается перорально из кишечника и преобразуется в соединение в соответствии с настоящим изобретением в плазме. Многие их примеры известны в данной области техники и включают, например, низшие алкиламиды, амиды а-аминокислот, алкоксиациламиды и алкиламиноалкилкарбониламиды.

В настоящем контексте термин "фармацевтически приемлемая соль" предназначен для указания солей, которые не являются вредными для пациента. Такие соли включают фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты, фармацевтически приемлемые соли металлов, соли аммония и алкилированного аммония. Соли присоединения кислоты включают соли неорганических кислот, а также органических кислот. Репрезентативные примеры подходящих неорганических кислот включают соляную, бромисто-водородную, йодисто-водородную, фосфорную, серную, азотную кислоты и тому подобное. Репрезентативные примеры подходящих органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пировиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, винную, аскорбиновую, памовую, бисметиленсалициловую, этандисульфоновую, глюконовую, цитраконовую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую, ЭДТА, гликолевую, пара-аминобензойную, глутаминовую, бензолсульфоновую, пара-толуолсульфоновую кислоты и тому подобное. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения неорганической или органической кислоты включают фармацевтически приемлемые соли, приведенные в J. Pharm. Sci. 66, 2, (1977), которая включена в данную заявку посредством ссылки. Примеры солей металлов включают соли лития, натрия, калия, магния и тому подобное, примеры солей аммония и алкилированного аммония включают соли аммония, метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония, тетраметиламмония и тому подобное.

"Терапевтически эффективное количество" соединения, как используют в данной заявке, означает количество, достаточное для вылечивания, облегчения или частичной остановки клинических проявлений данного заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для осуществления этого, определяют как "терапевтически эффективное количество". Эффективные количества для каждой цели зависят от тяжести заболевания или повреждения, а также от массы и общего состояния субъекта. Должно быть понятно, что определение соответствующей дозировки может быть достигнуто с использованием рутинного экспериментирования путем построения матрицы значений и тестирования различных точек в матрице, что находится в пределах обычной компетенции подготовленного врача или ветеринара.

Термин "лечение" и "лечащий", как используют в данной заявке, означает лечение и уход за пациентом в целях борьбы с состоянием, таким как заболевание или расстройство. Термин предназначен для включения всего спектра терапий для данного состояния, которым страдает пациент, таких как введение активного соединения для . облегчения симптомов или осложнений, для замедления прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, для облегчения или ослабления симптомов или осложнений и/или для излечения или устранения заболевания, расстройства или состояния, а также для предупреждения этого состояния, где предупреждение следует понимать как лечение и уход за пациентом в целях борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и оно включает введение активных соединений для предупреждения возникновения симптомов или осложнений. Пациент, подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой млекопитающее, в частности человека, но может также включать животных, таких как собаки, кошки, коровы, овцы и свиньи.

Термин "аналог", как используют в данной заявке по отношению к полипептиду, означает модифицированный пептид, где один или более чем один аминокислотный остаток пептида заменен другими аминокислотными остатками и/или где один или более чем один аминокислотный остаток делетирован из пептида и/или где один или более чем один аминокислотный остаток добавлен в пептид. Такое добавление или делеция аминокислотных остатков может иметь место при N-конце пептида и/или при С-конце пептида. Все аминокислоты, для которых оптический изомер не указан, следует понимать как означающие L-изомер.

Термин "функциональный период полувыведения in vivo" используют в его обычном значении, то есть периода, при котором 50% биологической активности модифицированного белка или стандартной молекулы все еще присутствует в организме/органе-мишени, или время, которое требуется для падения активности модифицированного белка или стандартной молекулы до 50% ее пикового значения. В качестве альтернативы определению функционального периода полувыведения in vivo можно определять "период полувыведения из плазмы in vivo", то есть период, при котором 50% модифицированных белков или стандартных молекул циркулирует в плазме или кровотоке до их выведения.

Определение периода полувыведения из плазмы часто проще, чем определение функционального периода полувыведения, и величина периода полувыведения из плазмы обычно является хорошим показателем величины функционального периода полувыведения in vivo. Альтернативные термины периода полувыведения из плазмы включают период полувыведения из сыворотки, период полувыведения из циркулирующей крови, период полувыведения из кровообращения, сывороточный клиренс, плазменный клиренс и период полувыведения клиренса. Функция, которая должна сохраняться, обычно выбрана из прокоагулянтной, протеолитической, связывающей кофактор, активности связывания рецептора или другого типа биологической активности, связанной с конкретным белком.

Измерение биологического периода полувыведения in vivo можно осуществлять с помощью ряда путей, которые описаны в литературе. Пример использования модифицированного FVlla (фактора свертывания крови Vila) анализа для измерения периода полувыведения in vivo rFVIIa и его вариантов описан в ссылке FDA № 96-0597. Кратко, свертывающую активность FVlla измеряют в плазме, взятой до и во время 24-часового периода после введения модифицированного белка. Измеряют средний кажущийся объем распределения в стабильном состоянии и определяют средний клиренс.

Термин "повышенный", используемый в отношении функционального периода полувыведения in vivo или периода полувыведения из плазмы, указывает на то, что релевантный период полувыведения модифицированного белка статистически значимо повышен относительно стандартной молекулы, такой как белок, идентичный во всем остальном, который, однако, не подвергнут способу по изобретению. Таким образом, период полувыведения определяют в сравнимых условиях. Например, релевантный период полувыведения может быть повышен по меньшей мере примерно на 25%, например, по меньшей мере примерно на 50%, например, по меньшей мере примерно на 100%, 150%, 200%, 250% или 500%. В некоторых формах осуществления модифицированные белки по настоящему изобретению проявляют повышение периода полувыведения по меньшей мере примерно на 0,25 ч, предпочтительно по меньшей мере примерно на 0,5 ч, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 1 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 2 ч относительно периода полувыведения немодифицированного белка.

Термин "биодоступность" относится к доле введенной дозы конъюгата, который можно обнаружить в плазме в предопределенные моменты времени после введения. Типично биодоступность измеряют у подопытных животных путем введения дозы между примерно 25-250 мкг/кг препарата; получения образцов плазмы в предопределенные моменты времени после введения; и определения содержания белка в образцах, используя подходящий биологический анализ или иммунологический анализ, либо эквивалентный анализ. Данные типично выражают графически как [белок] против времени, и биодоступность выражают в виде площади под кривой (AUC). Относительная биодоступность тестируемого препарата относится к отношению между AUC тестируемого препарата и немодифицированного белка.

Термин "иммуногенность" препарата относится к способности препарата при введении людям вызывать вредный иммунный ответ, либо гуморальный, либо клеточный, либо оба ответа. В любой подгруппе населения людей могут существовать индивидуумы, которые проявляют чувствительность к определенным вводимым белкам. Иммуногенность можно измерить путем количественного определения присутствия антител против белка и/или Т-клеток, реактивных в отношении этого белка, у чувствительного индивидуума, используя общепринятые способы, известные в данной области техники. В некоторых формах осуществления модифицированные белки по настоящему изобретению проявляют снижение иммуногенности у чувствительного индивидуума по меньшей мере примерно на 10%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 50% относительно иммуногенности немодифицированного белка для этого индивидуума.

Иммуногенность лекарства также относится к тому факту, что белковые лекарства могут быть иммуногенными у нечувствительных субъектов, что означает, что повторные введения этого лекарства приводят к постоянному бустингу иммунного ответа против этого лекарства. Это в большинстве случаев нежелательно, поскольку иммунный ответ будет препятствовать активности лекарства, в результате чего возникает необходимость вводить возрастающие дозы этого лекарства со временем с целью получения терапевтического эффекта. В некоторых формах осуществления модифицированные белки по настоящему изобретению проявляют снижение иммуногенности у нечувствительного индивидуума по меньшей мере примерно на 10%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 50% относительно иммуногенности немодифицированного белка для этого индивидуума.

Термин "защищенный от протеаз", как используют в данной заявке относительно белка, означает белок, который химически модифицирован с целью придания этому соединению устойчивости к пептидазам или протеазам плазмы. Известно, что протеазы в плазме вовлечены в расщепление нескольких пептидных гормонов, а также играют роль при расщеплении белков большего размера.

Устойчивость пептида к расщеплению, например, дипептидиламинопептидазой IV (DPPIV) определяют с помощью приведенного ниже анализа расщепления: Аликвоты пептида (5 нмоль) инкубируют при 37°С с 1 мкл очищенной дипептидиламинопептидазы IV, что соответствует ферментативной активности 5 mU, в течение 10-180 минут в 100 мкл буфера 0,1 М триэтиламин-HCI, рН 7,4. Ферментативные реакции останавливают добавлением 5 мкл 10% трифторуксусной кислоты, и продукты расщепления пептида разделяют и определяют количественно, используя анализ ВЭЖХ. Одним из способов проведения этого анализа является следующий: Смеси наносят на колонку Vydac С18 с широкими порами (поры 30 нм, частицы 5 мкм) 250 х 4,6 мм и элюируют при скорости тока 1 мл/мин линейными ступенчатыми градиентами ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (0% ацетонитрила в течение 3 мин, 0-24% ацетонитрила в течение 17 мин, 24-48% ацетонитрила в течение 1 мин) согласно Siegel et al., Regul. Pept. 1999:79:93-102 и Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35. Мониторинг пептидов и продуктов их расщепления можно проводить на основании их поглощения при 220 нм (пептидные связи) или 280 нм (ароматические аминокислоты) и определять количественно путем интегрирования их пиковых областей относительно пиковых областей стандартов. Степень гидролиза пептида дипептидиламинопептидазой IV оценивают при периодах инкубации, результатом которых является менее чем 10% гидролизованного пептида. Этот эксперимент можно возможно ставить в присутствии альбумина, чтобы исследовать защитные свойства, проявляемые комплексообразованием с альбумином.

Термин "водная композиция" определяют как композицию, содержащую по меньшей мере 50% масс/масс воды. Подобным образом, термин "водный раствор" определяют как раствор, содержащий по меньшей мере 50% мас./мас. воды, и термин "водная суспензия" определяют как суспензию, содержащую по меньшей мере 50% мас./мас. воды.

Термин "идентичность", как известно в данной области техники, относится к отношениям между последовательностями двух или более чем двух белков, которые определяют путем сравнения последовательностей. В данной области техники "идентичность" также означает степень родства последовательностей между белками, которую определяют по числу совпадений между цепочками из двух или более чем двух аминокислотных остатков. "Идентичность" измеряет процент идентичных совпадений между наименьшими из двух или более чем двух последовательностей с выравниванием с помощью гэпов (если есть), предусмотренным конкретной математической моделью или компьютерной программой (то есть "алгоритмами"). Идентичность родственных пептидов можно легко вычислить известными способами. Такие способы включают, но не ограничены ими, способы, описанные в публикациях Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073, (1988).

Предпочтительные способы определения идентичности разработаны таким образом, чтобы давать наибольшее совпадение между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают пакет программ GCG, включающий GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12, 387, (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J.Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)). Программа BLASTX общедоступна из Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и других источников (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). Хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана можно также использовать для определения идентичности.

Например, используя компьютерный алгоритм GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), два белка, для которых нужно определить процент идентичности последовательности, выравнивают для максимального совпадения из соответствующих аминокислот ("matched span", как определено алгоритмом). Штраф на открытие гэпа (который вычисляют как 3-кратную среднюю диагональ; "средняя диагональ" представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; "диагональ" представляет собой балл или число, приписываемое каждому наилучшему совпадению аминокислот конкретной матрицей сравнения) и штраф на удлинение гэпа (который обычно составляет {коэффициент (1/10)} штрафа на открытие гэпа), а также матрицу сравнения, такую как РАМ 250 или BLOSUM 62, используют в сочетании с алгоритмом. Стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) для матрицы сравнения РАМ 250; Henikoff et al., Proa. Natl. Acad. Sci USA, 89, 10915-10919, (1992) для матрицы сравнения BLOSUM 62) также используется алгоритмом.

Предпочтительные параметры для сравнения белковых последовательностей включают приведенные ниже:

Алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48, 443-453, (1970); Матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, (1992); Штраф на гэп: 12, Штраф на длину гэпа: 4, Порог подобия: 0.

Программа GAP полезна с приведенными выше параметрами. Вышеупомянутые параметры представляют собой параметры по умолчанию для сравнений белков (параллельно с отсутствием штрафа на концевые гэпы) с использованием алгоритма GAP.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с первым аспектом изобретения предложен способ получения конъюгированного белка или гликопротеина, который включает стадии взаимодействия белка или гликопротеина с нерастворимым в воде альбумин-связывающим веществом в присутствии молекулы возможно замещенного циклодекстрина.

В одной форме осуществления белковый конъюгат представляет собой белковый конъюгат формулы (I):

(A-W-B)_y-P (I)

где Р представляет собой белок или гликопротеин;

В представляет собой гидрофильный спейсер;

W представляет собой химическую группу, связывающую А и В;

А представляет собой альбумин-связывающий остаток; и

у представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или пролекарство, так что группировка A-W-B- включает нерастворимую в воде группировку.

Результатом изобретения являются модифицированные белки или гликопротеины, обладающие улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с немодифицированным белком или гликопротеином. Например, улучшенное фармакологическое свойство выбрано из группы, состоящей из повышенной биодоступности, повышенного функционального периода полувыведения in vivo, повышенного периода полувыведения in vivo из плазмы, сниженной иммуногенности, повышенной устойчивости к протеазам, повышенного сродства к альбумину, улучшенного сродства к рецепт