Синтетический иммуноген для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ

Синтетический иммуноген для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может применяться при токсическом действии различных форм наркотических веществ, отравлений различными ядами в промышленности и быту, при техногенных катастрофах и т.п., для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами.

Известен синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими веществами (в частности, опиатной зависимости), представляющий собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения. Причем в качестве носителя он содержит бычий сывороточный альбумин или синтетические полипептиды и гликопротеины, а в качестве гаптена - морфин, или кодеин, или героин, или метадон, или т.п. ([см. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. ″Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям″. М.: Наука, 1985).

Однако этот иммуноген имеет балластные примеси, снижающие его терапевтическую (иммуностимулирующую) активность, требует применения больших доз (до 20 мг/кг), кроме того, продолжительность иммунизации доходит до 6 месяцев, а достижение стабильного и/или пролонгированного иммунитета не всегда возможно.

Известен принятый за прототип синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами, представляющий собой комплекс конъюгата в виде макромолекулярного носителя - природного или искусственного белка (яичный альбумин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины) и гаптена - наркотического или психотропного соединения из следующих групп низкомолекулярных соединений: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов с полимерной матрицей, в качестве которой берут иммунокомпетентный полиэлектролит - полиоксидоний. Соотношение, вес.%: конъюгат : полиоксидоний составляет 1:1,5-5,0. Этот иммуноген имеет высокую иммунологическую активность при сокращении доз и сроков лечения до 12 месяцев (патент РФ №2236257, МПК⁷ A61K 39/385, A61K 39/39, опуб. 20.09.2004).

Однако продолжительность иммунизации (стойкость гуморального иммунитета), обеспечиваемая применением этого иммуногена, является недостаточной.

Задачей настоящего изобретения является создание иммуногена, который в течение длительного времени позволяет сохранить в организме стабильный иммунный ответ и уменьшает токсическое действие наркотиков и психоактивных веществ за счет стойкого повышения титра специфических антител к ним.

Поставленная задача решается тем, что в известном синтетическом иммуногене для защиты от токсического действия наркотических и психоактивных веществ, представляющем собой конъюгат макромолекулярного носителя, выбранного из ряда: природный или искусственный белок, олиго- и полипептид, углевод, липид или нуклеотид, и гаптена - наркотического или психотропного соединения, новым является то, что он дополнительно содержит поли(4-нитрофенил)акрилат, который ковалентно связан с коньюгатом в диапазоне соотношений от 2-х до 7-ми молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, при этом соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в конъюгате составляет 2-17 молей гаптена на 1 моль носителя.

В качестве макромолекулярного носителя, выбранного из группы природных белков, он содержит соединение, выбранное из ряда: овальбумин, человеческий гамма-глобулин, альбумин, лизоцим, микробные токсины, белки сыворотки крови.

В качестве гаптена он может содержать наркотическое или психотропное соединение, выбранное из ряда опиатов, например морфин, героин, кодеин, каннабиноидов, например дельта-9-тетрагидроканнабинол, амфетамина, например метамфетамин, экстази, кокаина, например бензоилэкгонин, барбитуратов, например барбамил, фенобарбитал, бензодиазепинов, например гидезепам, метадона, фенциклидина, трициклических антидепрессантов, котинина и их производных и метаболитов.

Соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в конъюгате, составляющее 2-17 молей гаптена на 1 моль носителя, является оптимальным для получения при иммунизации более аффинных и специфических антител к этому классу гаптенов. Если соотношение меньше чем 2:1, то антитела не вырабатываются, если больше 17:1, то вырабатываются низкоаффинные неспецифичные антитела, дающие перекрестные реакции с др. классами веществ.

Заявляемый синтетический иммуноген обеспечивает эффективную иммунную реакцию за счет ковалентной связи конъюгата с поли(4-нитрофенил)акрилатом, который в стандартных условиях позволяет воспроизводить структуру иммуногена в заданном диапазоне соотношений, добиваясь увеличения длительности стойкого гуморального иммунитета до 18 месяцев.

Диапазон соотношений от 2-х до 7-ми молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата обеспечивает стандартизацию и контроль фармакологического эффекта в заданных соотношениях при формировании и укрупнении структуры иммуногена. Проведенные нами исследования показали, что при соотношении 1:1 образуется комплекс небольшого размера, не способный индуцировать стойкий гуморальный ответ и обеспечивать выработку антител, а использование соотношения конъюгата и поли(4-нитрофенилакрилата) больше чем 1:7 не позволяет образоваться стойкой ковалентной связи. Соотношение 1:7 дает максимально возможное стабильное и воспроизводимое замещение полимерной матрицы конъюгатом с гаптеном.

Использование в предлагаемом синтетическом иммуногене конкретных носителей и гаптенов защищает организм человека от действия широкого спектра токсических веществ (в том числе наркотиков, промышленных ядов, различных канцерогенов).

Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня исследуемой техники, что свидетельствует о его соответствии критерию ″новизна″.

Сущность настоящего изобретения для специалистов не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию ″изобретательский уровень″.

Возможность приготовления синтетического иммуногена из доступных промышленно выпускаемых компонентов на традиционном оборудовании с помощью известных методик с достижением поставленной задачи свидетельствует о соответствии изобретения критерию “промышленная применимость”.

Таблице 1 представлены обобщенные данные по изучению специфичности антител, полученных при иммунизации кроликов синтетическими иммуногенами.

В Таблице 2 представлены данные по специфичности антител, выделенных аффинной хроматографией из сыворотки крови больных опийной наркоманией, где * - специфичность составляет менее 0,001.

В таблице 3 представлены данные по определению константы аффинности (Ка) для антител к морфину, выделенных из сыворотки крови доноров и больных опийной наркоманией.

В таблице 4 представлены составы предлагаемого синтетического иммуногена и известного взятого за прототип, а также их фармакологические действия.

В настоящем изобретении под термином ингибитор понимается вещество, которое используют в процедуре конкурентного ИФА для оценки специфичности и аффинности антител. В качестве ингибиторов использовали соединения, структурно родственные гаптену, входящему в состав заявленного иммуногена, а также наркотические вещества и ряд психотропных лекарственных препаратов другой химической природы. Это метадон, псевдоэфедрин, норэфедрин, барбамил, канабинол, морфин, героин, кодеин и др.

Приведенные примеры подтверждают, но не ограничивают заявляемое изобретение.

Синтез конъюгатов макромолекулярных носителей с гаптенами.

Введение карбоксилсодержащих производных, способствующих проведению реакции связывания гаптена с макромолекулярным носителем, для опиатов, кокаина, барбитуратов, бензодиазепинов осуществляли путем их взаимодействия с хлорпроизводными уксусной и янтарной кислот в абсолютированном растворителе.

Синтез карбоксильных производных каннабиноидов, амфетамина, метадона, фенциклидина, трициклических антидепрессантов, котинина проводили по реакции диазотирования с п-аминобензойной кислотой.

На основе модифицированных наркотикотических и психотропных веществ приготовлены конъюгаты, в которых эти вещества ковалентно связанны с макромолекулярными носителями.

Реакции конденсации карбоксилсодержащих производных гаптенов с макромолекулярным носителем осуществляли методом активированных эфиров либо с использованием водорастворимого карбодиимида, глутарового альдегида или изобутилхлорформиата. Макромолекулярные носители содержали перечисленные выше гаптены в диапазоне соотношений от 2:1 до 17:1 молей гаптена на моль макромолекулярного носителя. Методом очистки синтезированных конъюгатов была использована колоночная гель-хроматография (сефадекс G-25).

Количество молей гаптена, связавшихся с макромолекулярным белковым носителем, определяли с помощью сравнительного спектрального анализа в ультрафиолетовой и видимой областях.

Пример 1. Синтез конъюгата морфина с овальбумином

Раствор 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина в 5,0 мл дистиллированной воды смешивали с 2,0 мл димтелформамида (ДМФА), содержащего 15,0 мг (0,039 ммоль) 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфина и при охлаждении по каплям прибавляли раствор 15 мг (0,055 ммоль) водорастворимого карбодиимида в 3 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 час при 4°C. Полученный конъюгат выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 25 мг конъюгата морфина с овальбумином (М-ОВА), содержащего 5 молей морфина на моль белка.

Пример 2. Синтез конъюгатов амфетамина с овальбумином

Производное d,1-1-фенил-2-аминопропан (5 мг; 0,112 ммоль) и (10 мг; 0,00022 ммоль) овальбумина растворяли в 3,0 мл 0,1 М фосфатного буфера. По каплям при перемешивании к реакционной смеси добавляли 70 мкл (0,3 ммоль) раствора глутарового альдегида при комнатной температуре. Постепенно реакционная смесь приобретала характерную желтую окраску, свидетельствующую об окончании реакции. Для остановки реакции к смеси добавляли 40 мкл 1М раствора лизина и инкубировали в течение 1 часа. Полученный конъюгат диализовали против фосфатного буфера в течение ночи при температуре 4°C. Выделение конъюгата проводили гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали. Получено 5 мг конъюгата, содержащего 12 молей амфетамина на моль белка.

Пример 3. Синтез конъюгата кокаина с овальбумином

Конъюгат кокаина с овальбумином (Кок-ОВА) получали по методике примера 1 из 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина и 2,0 мг (0,005 ммоль) бензоилэкгонина.

Получено 29 мг конъюгата Кок-ОВА, содержащего 14 молей кокаина на моль белка.

Пример 4. Синтез конъюгата тетрагидроканнабинола с овальбумином

К раствору 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) овальбумина в 3 мл дистиллированной воды прибавили раствор 7,4 мг (0,02 ммоль) вещества дельта-9-тетрагидроканнабинола, модифицированного реакцией азосчетания с п-аминобензойной кислотой в 1 мл ДМФА, охладили реакционную смесь до 0°C и при перемешивании прибавили 5 мг водорастворимого карбодиимида. Реакционную смесь выдерживали в течение 12 час в холодильнике, выпавший осадок мочевины и выделили полученный конъюгат гель-хроматографией на Сефадексе G-25.

Получено 10 мг конъюгата тетрагидроканнабинола с овальбумином (Δ⁹-ТГК-ОВА), содержащего 15 молей гаптена на моль белка.

Пример 5. Получение конъюгата морфина с лизоцимом

К раствору 50 мг (3,57×10^-3 ммоль) лизоцима в 2,5 мл 0,3 М раствора NaHCO₃ прибавили при охлаждении 0,3 мл раствора смешанного ангидрида 6-сукцинилморфина, полученного из 19,2 мг (0,05 ммоль) 6-сукцинилморфина и 6,0 мкл изобутилхлорформиата. Реакционную смесь инкубировали в течение 18 час. При 4°C образующийся конъюгат морфина с лизоцимом выделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 30 мг конъюгата морфина с лизоцимом (М-Лиз).

Количество присоединенного морфина рассчитывали по данным УФ-спектров исходного белка и полученного конъюгата по изменению поглощения при 280 нм. По данным УФ-спектров в полученном конъюгате содержалось 12 молей морфина на моль белка.

Пример 6. Получение конъюгатов морфина с полилизином (М-ПолиЛиз)

Раствор 50 мг (0,001 ммоль) полилизина (полиструктура пептидов) в 5,0 мл дистиллированной воды смешивали с 2,0 мл ДМФА, содержащего 15,0 мг (0,039 ммоль) 6-сукцинилморфина, и при охлаждении по каплям прибавляли раствор 15 мг (0,055 ммоль) водорастворимого карбодиимида в 3 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 час при 4°C. Полученный конъюгат выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 25 мг конъюгата морфина с полилизином (М-ПолиЛиз), содержащего 10 молей морфина на моль белка.

Пример 7. Получение конъюгатов морфина с полилизином (М-ПолиЛиз)

Раствор 27 мг (0,0006 ммоль) полилизина в 30 мл 0,25 М раствора NaHCO₃ добавляли к раствору смешанного ангидрида 3-О-карбоксиметилморфина. Смесь выдерживали при 0°C в течение ночи. Выделение конъюгата проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 20 мг конъюгата морфина с полилизином (М-ПолиЛиз), содержащего 2 моля морфина на моль белка.

Пример 8. Получение конъюгата Δ⁹-тетрагидроканнабинола с гамма-глобулином (Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин)

К раствору 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) гамма-глобулина в 3 мл дистиллированной воды прибавили раствор 7,4 мг (0,02 ммоль) вещества производного 4-карбосифенил-азо Δ⁹-тетрагидроканнабинола (каннабиноид) в 1 мл ДМФА, охладили реакционную смесь до 0°C и при перемешивании прибавили 5 мг водорастворимого карбодиимида. Реакционную смесь выдерживали в течение 12 час в холодильнике, выпавший осадок мочевины и выделили полученный конъюгат гель-хроматографией на Сефадексе G-25.

Получено 12 мг конъюгата Δ⁹-тетрагидроканнабинола с гамма-глобулином (Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин), содержащего 5 молей Δ⁹-тетрагидроканнабинола на моль белка.

Пример 9. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с дифтерийным тосином (А-Дт)

Так же, как в примере 2, использовали производное d,1-1-фенил-2-аминопропан (2 мг; 0,06 ммоль) и 10 мг (0,00022 ммоль) белка дифтерийного токсина, которые растворяли в 2,0 мл 0,1 М фосфатного буфера. Далее проводили операции, описанные в примере 2. Получено 7 мг конъюгата, содержащего 6 молей амфетамина на моль белка.

Пример 10. Получение конъюгата барбамила с гамма-глобулином (Б-гамма-глобулин)

Так же, как в примере 8, с использованием раствора 15 мг (3,3×10^-3 ммоль) гамма-глобулина в 3 мл дистиллированной воды, к которому прибавили при охлаждении и перемешивании раствор 1 мл ДМФ, содержащего 5,2 мг (0,03 ммоль) барбамила, производного барбитуровой кислоты и 5 мг водорастворимого карбодиимида. Далее выполнили процедуру, как в примере 8.

Получено 10 мг конъюгата барбамила с гамма-глобулином (Б-гамма-глобулин), содержащего 6 молей барбамила на моль белка.

Получение синтетического иммуногена - комплекса, состоящего из конъюгата макромолекулярного носителя в виде природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения, ковалентно связанного с полимерной матрицей в виде поли(4-нитрофенил)акрилата.

Приготовление синтетических иммуногенов осуществляли по известным традиционным методикам, соблюдая соотношение гаптена и макромолекулярного носителя в соответствии с предлагаемым изобретением

Реакции осуществляли с помощью поли(4-нитрофенил)акрилата. Коньюгат содержал указанные выше макромолекулярные носители и гаптены в соотношениях от 2:1 до 17:1 молей гаптена на моль макромолекулярного носителя (Примеры 1-10).

Контроль за степенью ковалентного связывания поли(4-нитрофенил)акрилата с конъюгатом макромолекулярного носителя в виде природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения осуществляли спектрофотометрически по количеству образовавшегося в процессе реакции p-нитрофенола.

Пример 11. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата овальбумина с морфином (М-ОВА), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 7 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата

К раствору 6 мг поли(4-нитрофенил)акрилата (м.в. 40000) в 1,5 мл диметилсульфоксида (ДМС) добавляют 3,8 мг М-ОВА, полученного в примере №1, содержащего в качестве гаптена 6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфина выдерживают реакционную смесь в течение суток при 20°C, а затем добавляют 200 мкл 25% аммиака. Растворитель упаривают в вакууме. Оставшееся масло многократно промывают эфиром.

Получают комплекс, имеющий 7:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Пример 12. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата овальбумин (М-ОВА) с морфином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 5 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли-(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 2 мг М-ОВА, полученного в примере №1, содержащего в качестве гаптена (6-(3-(аминогексиламинокарбонил)-пропионат)морфина.

Получаемый комплекс имеет 5:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом с производным морфина со спейсером по 6-му положению молекулы морфина.

Пример 13. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата полилизин (М-ПолиЛиз) с морфином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 3 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 2 мл ДМФ и 3 мг конъюгата М-ПолиЛиз, полученного в примере №7.

Получаемый комплекс имеет 3:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом полилизина со спейсером (3-О-карбоксиметилморфина) по 3-му положению молекулы морфина.

Пример 14. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с Δ⁹-тетрагидроканнабинолом (Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 2 мг конъюгата Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин, полученного в примере 8.

Получаемый комплекс имеет 2:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом Δ⁹-ТГК-гамма-глобулин.

Пример 15. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата дифтерийного токсина с амфетамином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 4 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 2,5 мг конъюгата амфетамин-дифтерийный токсин, полученного в примере №9.

Получаемый комплекс имеет 4:1 замещение полимерной матрицы поли(4-нитрофенил)акрилата конъюгатом амфетамин-дифтерийный токсин.

Пример 16. Получение иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с барбамилом, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 моля конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата.

То же, что в примере 11, только в качестве исходного соединения берут 3,5 мг поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМС и 3 мг конъюгата барбамил-гамма-глобулин, полученного в примере №10.

Получаемый комплекс имеет 6:1 замещение полимерной матрицы конъюгатом барбамил-гамма-глобулин.

Фармакологическое действие синтетических иммуногенов с различными указанными выше макромолекулярными носителями и гаптенами характеризуется синтезом антител, специфичных для каждого гаптена. Эти результаты основаны на многократных испытаниях, выполненных на мышах, кроликах, а также на группах добровольцев (в соответствии со ст.124 УК РФ, ст.43 Основ законодательства об охране здоровья граждан и ст.21, ч.2 Конституции РФ). Для этих целей использовали составы предлагаемого синтетического иммуногена, представленные в примерах 11-16 с различными вариантами макромолекулярных носителей и гаптенов и соотношениями (конъюгат: поли(4-нитрофенил)акрилат) в заявляемых пределах

Синтетический иммуноген вводили пациентам в виде раствора подкожно в количестве 0,5 мл. Через две недели процедуру повторяли и затем продолжали введение иммуногена 1 раз в неделю еще в течение шести недель. Время нарастания активной иммунной реакции определяли стандартными методами иммуноферментного анализа (ИФА). Пациенты находились под регулярным наблюдением за изменением состояния их здоровья в течение 3 лет.

Для получения сыворотки, содержащей специфические антитела, использовали 6 кроликов-самцов массой 2,5 кг. Иммунизацию проводили введением синтетического иммуногена, состоящего из конъюгата гаптена с макромолекулярным носителем, ковалентно связанным с поли(4-нитрофенил)акрилатом в заданном соотношении, в расчете 1 мг на кролика. В течение месяца с интервалом 7 дней проводили инъекции по 0,2 мл в 4 точки вблизи позвоночника - в области лопаток и в области крестца. Иммунизация кроликов препаратом по приведенной схеме приводила к появлению в сыворотке крови высоких титров антител к иммуногену. Результаты оценивали методом ИФА. В реакции прямого ИФА установлено, что образующиеся антитела имеют титр от 1:6000 до 1:12000. В конкурентном ИФА происходит связывание гаптена. Титр антител к иммунокомплексу уменьшался до 1:400 при использовании концентрации гаптена 0,001 моль, что свидетельствует о наличии антител к этому соединению.

Доклинические исследования

В экспериментах на животных показано, что полученные синтетические иммуногены способны индуцировать иммунные ответы с появлением антител, специфически взаимодействующих с гаптеном и нейтрализующие их активность в организме. В серии опытов была выяснена возможность нейтрализации токсического действия морфина на животных.

Пример 17. Группе контрольных животных, состоящей из шести неиммунизированных кроликов, и опытной группе, включающей шесть кроликов, предварительно иммунизированных синтетическим иммуногеном морфин-овальбумин-поли(4-нитрофенил)акрилат по указанной выше схеме, внутривенно вводили абсолютно летальную дозу морфина 100 мг/кг (LD100). Было установлено, что все шесть кроликов контрольной группы погибли от указанной летальной дозы.

Среди иммунизированных кроликов гибели не зарегистрировано ни в одном из шести случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита образовавшимися в процессе иммунизации специфическими антителами.

Пример 18. Аналогично описанному выше Примеру 17 проводили исследования в двух группах по шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола. Одну группу иммунизировали синтетическим иммуногеном амфетамин-дифтерийный токсин-поли(4-нитрофенил)акрилат из расчета 30 мг/кг. Вводили летальную дозу психоактивного вещества первитина животным первой и второй группы. Установлено, что погибли животные контрольной группы, не получавшие иммуноген.

Среди иммунизированных крыс гибели не зарегистрировано ни в одном из шести случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита образовавшимися в процессе иммунизации специфическими антителами.

Пример 19. Аналогично описанному выше Примеру 17 шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном барбамил-гамма-глобулин-поли(4-нитрофенил)акрилат (гаптен из группы производных барбитуровой кислоты) из расчета 30 мг/кг. Вводили летальную дозу снотворного - барбитурата. Погибли животные контрольной группы, не получавшие иммуноген.

Среди иммунизированных крыс гибели не зарегистрировано ни в одном из шести случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита образовавшимися в процессе иммунизации специфическими антителами.

Исследования по указанной выше схеме, выполненные для гаптенов, входящих в заявленный состав иммуногена, показали аналогичные результаты. Таким образом, синтезированный иммунокомплекс специфически связывает гаптен не только in vitro, но и в целом организме.

Пример 20. Определение специфичности антител, образующихся при иммунизации синтетическим иммуногеном, состав которых представлен в таблице 1.

Следующим этапом работы явилась оценка иммунохимических свойств антител, образующихся в процессе иммунизации. Специфичность была изучена в тесте конкуренции ИФА. Для этого в твердофазном ИФА в качестве ингибиторов использовали соединения, структурно родственные гаптену, входящему в состав заявленного иммуногена, а также наркотические вещества и ряд психотропных лекарственных препаратов другой химической природы.

Для каждого из этих соединений определяли концентрацию, при которой происходит 50% торможение взаимодействия антигаптеновых антител, с антигеном на твердой фазе. Специфичность рассчитывали как выраженное в процентах отношение молярных концентраций исследуемого вещества и исходного гаптена. Результаты изучения специфичности антител представлены в таблице 1.

По данным таблицы 1 видно, что только иммунные кроличьи антитела к гаптенам, входящим в состав заявляемого иммуногена, не давали перекрестных реакций с соединениями других классов и в меньшей степени реагировали со структурно родственными веществами, а взаимодействовали только с гаптенами, включенными в комплекс конъюгата с макромолекулярным носителем. Так, для иммуногена, состоящего из конъюгата овальбумина с морфином (М-ОВА), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 7 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата (пример 11), образуются антитела, специфически реагирующие с морфином, героином и в чуть меньшей степени с кодеином. Перекрестные реакции отсутствуют с метадоном, амфетамином, каннабиноидами, кокаином и др. веществами, не относящимися к классу опиатов. Аналогичные результаты получены и для иммуногена, состоящего из конъюгата полилизин (М-ПолиЛиз) с морфином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 3 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата (пример 13). Для иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с Δ⁹-тетрагидроканнабинолом (Δ⁹-ТГК), ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, специфическая реакция антител наблюдается только для каннабиноидов (пример 14). Для иммуногена, состоящего из конъюгата дифтерийного токсина с амфетамином, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом, при соотношении 4 молей конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата антитела реагируют с амфетамином и в меньшей степени с метамфетамином при отсутствии реакции со структурами эфедрина, а также с соединениями других классов (пример 15). Для иммуногена, состоящего из конъюгата гамма-глобулина с барбамилом, ковалентно связанного с поли(4-нитрофенил)акрилатом при соотношении 2 моля конъюгата на моль поли(4-нитрофенил)акрилата, полученные антитела взаимодействуют с барбамилом и в меньшей степени с фенобарбиталом, не давая перекрестных реакций с соединениями других классов (пример 16).

Проведен расчет константы аффинности (Ка) для специфических антител иммунной сыворотки. На основании кривых конкурентного ИФА, используя в качестве ингибитора гаптен из состава иммуногена, Ка определяли как обратную величину концентрации свободного ингибитора, необходимую для 50% торможения антител (I₅o), связавшихся с иммобилизованным на планшете антигеном. Ка=I/I_50.

Ка антител из сыворотки кроликов составила 10⁸-10¹⁰ М^-1.

Клинические исследования.

Аналогичные исследования специфичности были проведены с антителами, выделенными аффинной хроматографией из сыворотки крови добровольцев - больных наркоманией, иммунизированных синтезированным иммуногеном - комплекс с конъюгатом овальбумин-морфин-поли(4-нитрофенил)акрилат.

Иммуноген вводили 10 добровольцам, страдающим опийной наркоманией, возраст: 20-30 лет. Продолжительность приема наркотиков: 2-10 лет. Иммуноген вводили подкожно в верхнюю треть плеча правой и левой руки попеременно, один раз в неделю, 8-10 инъекций на курс.

Эффект иммуногена начинает развиваться после латентного периода, который наступает от момента первой инъекции и длится в течение 2-3-х недель. Формирование клеточного и гуморального иммунного ответов, необходимых для нейтрализации препаратов, происходит к концу 8-10 недели от начала иммунизации. При этом происходит интенсивное созревание клона иммунокомпетентных клеток, вызывающих продукцию высокоаффинных, специфических антител, стимулируются под действием факторов процессы реагирующих клеток иммунной системы, приводящие к взаимодействию T- и B-лимфоцитов, функционированию макрофагов, индуцируется образование мононуклеарных клеток. В организме человека накапливаются антитела, способные связывать дозы наркотических или других токсических веществ, многократно (в 8-12 раз) превышающие летальные. Таким образом, иммунизация пациента предлагаемым препаратом приводит к развитию продолжительной толерантности к конкретным веществам при отсутствии любых отрицательных явлений.

Из исходных 10 сывороток наркоманов антиопиатные антитела выделены во всех образцах. По данным ИФА в сыворотках содержатся антитела IgG- и IgM-класса против морфина, героина и кодеина, реагирующие с каждым из метаболитов. Обобщенные данные по специфичности антиморфиновых антител, выделенных из сыворотки крови больных опийной наркоманией, представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, все выделенные из сыворотки крови антитела индивидуальны по своей специфичности и не дают перекрестных реакций с исследованными ингибиторами, веществами других классов: метадон, псевдоэфедрин, норэфедрин, барбамил, канабинол - процент перекрестного связывания, указывающего на специфическое взаимодействие, меньше 0,001. Соединения опийной группы морфин, героин показывают 100 процентное связывание с выделенными у больных антителами.

Расчет константы аффинности (Ка) (таблица 3) проводили на основании кривых ингибиторного ИФА, используя в качестве ингибитора морфин. Ка определяли как обратную величину концентрации свободного ингибитора, необходимую для 50% торможения антител (I₅o), связавшихся с иммобилизованным на планшете антигеном. Ка=I/I₅₀.

Как и в случае иммунных кроличьих антител, антиопиатные антитела, выделенные из сыворотки крови наркоманов, практически не взаимодействовали с наркотическими веществами другого класса. Антитела, выделенные из сыворотки крови больных наркоманией, по сравнению с антителами из кроличьих иммунных сывороток обладают более низкой константой аффинности и более широким спектром специфичности.

Таким образом, антитела, полученные иммунизацией животных или человека искусственными синтетическими иммуногенами, могут быть использованы для нейтрализации вредного воздействия психоактивного вещества, что в свою очередь может быть использовано для защиты от токсического действия при злоупотреблениях наркотическими и психоактивными веществами.

Для подтверждения данных, приведенных в таблице ″Составы синтетических иммуногенов и их фармакологическое действие″, приведены дополнительные сведения.

Составы предлагаемого синтетического иммуногена и известного, взятого за прототип, а также их фармакологические действия, подтвержденные в примерах 21-27, приведены в табл.4.

Пример 21

Пациент - 20 лет, 4 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: 1 мл плазмы крови содержит 2000 пмоль героиносвязывающих антител, определяемых ингибиторным ИФА.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом овальбумин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат (7:1), полученным в примере 11.

Лабораторные данные (через 6 недель от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 80000 пмоль героиносвязывающих антител. Через 9 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; аллергические реакции отсутствуют.

Контрольные лабораторные данные (через 14 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 50000 пмоль. Количество специфических антител в 25 раз превышает исходные данные, что свидетельствует о стойком иммунитете.

За указанный период времени (14 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 22

Пациент - 30 лет, 3 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: 1 мл плазмы крови содержит 2100 пмоль героиносвязывающих антител, определяемых ингибиторным ИФА.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом овальбумин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат (5:1), полученным в примере 12.

Лабораторные данные (через 6 недель от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 70000 пмоль героиносвязывающих антител. Через 9 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; аллергические реакции отсутствуют.

Контрольные лабораторные данные (через 13 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 60000 пмоль. Количество специфических антител примерно в 30 раз превышает исходные данные, что свидетельствует о стойком иммунитете.

За указанный период времени (13 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 23

Пациент 25 лет, 4 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: ИФА 1 мл - 1600 пмоль; у пациента в момент поступления в клинику определили конкурентным ИФА интоксикацию и наличие наркотических веществ группы опиатов и каннабиноидов.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом полилизин:морфин:поли(4-нитрофенил)акрилат (3:1), полученным в примере 13,

Лабораторные данные (через 6 недель после начала иммунизации): ИФА 1 мл - 75000 пмоль специфических антител; определение конкурентным ИФА содержания опиатов, каннабиноидов - отрицательно, т.е. усиливается сорбция метаболитов и ксенобиотиков. Через 9 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; аллергические реакции отсутствуют.

Контрольные лабораторные данные (через 16 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 60000 пмоль. Количество специфических антител более, чем в 35 раз превышает исходные данные, что свидетельствует о стойком иммунитете.

За указанный период времени (16 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 24

Пациент - 32 года, 10 лет гашишная наркомания.

Исходные лабораторные данные: в ИФА определили, что 1 мл содержит 1500 пмоль антител.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном: комплекс с конъюгатом гамма-глобулина с Δ⁹-тетрагидроканнабинолом: поли(4-нитрофенил)акрилат (2:1), полученным в примере 14.

Лабораторные данные: ИФА1 мл - 91000 пмоль (после 6 недель от начала иммунизации) усиление детоксикационной функции организма установлено в тесте конкурентного ИФА. Усиление продукции антител; стойкость гуморального иммунитета; отсутствие аллергических реакций; пожизненный клеточный иммунитет.

Контрольные лабораторные данные (через 18 месяцев от начала лечения иммуногеном): ИФА 1 мл - 50000 пмоль (увеличение специфических антител более, чем в 30 раз и их сохранение в организме).

За указанный период времени (18 месяцев) рецидивов заболевания не наблюдалось.

Данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 25

Пациент - 27 лет, 5 лет - злоупотребление психостимуляторами амфетаминового ряда.

Исходные лабораторные данные: в ИФА определили, что 1 мл содержит 1500 пмоль антител.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном комплекс с конъюгатом:дифтерийный токсин:амфетамин и поли(4-нитрофенил)акрилат, полученным в примере 15.

Лабораторные данные: ИФА 1