Способ диагностики аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта

Способ диагностики аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии и гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунного поражения различных структур вегетативной нервной системы (ВНС), регулирующих моторику желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

Нервная система вовлекается в патологический процесс достаточно часто, причем ее поражение носит как первичный, так и вторичный характер. В настоящее время аутоиммунные поражения представляют собой актуальную проблему, поскольку распространены и поражают 5-7% населения земного шара, причем преимущественно лиц трудоспособного возраста, что придает им социально-экономическую значимость. В основе их развития лежит необычная реакция собственной иммунной системы, когда вырабатываемые в норме антитела, призванные защитить организм, вдруг начинают взаимодействовать с собственными антигенами, тем самым разрушая клетки и ткани, несущие данные антигены. В качестве антигенов могут выступать белки, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и другие клеточные компоненты. Возникший аутоиммунный процесс, как правило, носит хронический характер и приводит к долговременному повреждению тканей, поскольку аутоиммунная реакция постоянно поддерживается тканевыми антигенами. Выработка антител к определенному антигену определяет широкий клинический полиморфизм данной патологии, в которую обычно вовлечены практически все органы и системы организма человека.

Нервная регуляция моторики ЖКТ носит многоуровневый характер. Психоэмоциональные реакции, общий психоэмоциональный фон, органические поражения ЦНС оказывают эфферентные влияния на состояние вегетативной нервной системы (симпатической и парасимпатической), которая через внекишечные и внутрикишечные ганглии, собственную нервную систему кишечника регулирует работу гладких миоцитов и желез.

Неврологические заболевания, характеризующиеся нарушением моторики желудочно-кишечного тракта, очень распространены. Наибольшие затруднения представляет диагностика так называемых "функциональных" расстройств ЖКТ, при которых любые современные методы обследования (УЗИ, ректоскопия, гастроскопия, колоноскопия, ирригоскопия, биохимические и клинические анализы крови, мочи, кала, посевы на дисбактериоз и др.) чаще всего не выявляют отклонений от нормы. Вместе с тем, например, синдром раздраженного кишечника (СРК) выявляется у 15-20% населения и его заболеваемость составляет 1% ежегодно (Маев И.В., Черемушкин С.В. Синдром раздраженного кишечника: пособие для врачей. М.: Форте принт, 2012, 52 с.). Особенно важно установить причину диспептических расстройств у данной группы пациентов в связи с недостаточной эффективностью стандартной симптоматической терапии. Лечение, как правило, направлено на устранение диареи или запоров, повышенного газообразования, уменьшение болевого синдрома. С этой целью применяется коррекция диеты, различные виды сорбентов, обволакивающих средств, препаратов для восстановления нормальной флоры кишечника, а также спазмолитики (холинолитики) и антидепрессанты. Лечение у гастроэнтерологов с участием психотерапевтов и психиатров не всегда является эффективным и ряд пациентов с нарушением моторики ЖКТ обследуется по расширенной схеме многократно - до 20-30 раз. Более того, некоторым больным (чаще по их настоятельным просьбам) проводятся не обоснованные оперативные вмешательства.

В настоящее время также мало изучены нарушения моторики ЖКТ, связанные с нарушением иннервации кишечника. Регуляция моторной и секреторной функции кишечника осуществляется симпатическим, парасимпатическим и метасимпатическим отделами ВНС. Основными медиаторами являются адреналин, норадреналин, ацетилхолин, но медиаторные функции могут выполнять и некоторые пептиды: вазоактивный интестинальный пептид, питуитарный аденилатциклазактивирующий пептид, рилизинг-фактор гонадолиберина и др. Наиболее показательна в этом отношении болезнь Гиршпрунга - врожденная десимпатизация нисходящего отдела толстого кишечника, связанная с отсутствием симпатических превертебральных ганглиев. Парасимпатические и метасимпатические структуры ВНС представлены интрамуральными ганглиями и микроганглиями. Нарушения в работе парасимпатических и метасимпатических структур могут быть обусловлены аутоиммунным процессом как против рецепторного аппарата, так и против пептидов, выполняющих медиаторные функции. В этой связи актуальна разработка способов определения антител к структурам парасимпатического интрамурального ганглия (α3-АХР) и пептида, участвующего в регуляции моторики ЖКТ через парасимпатические и метасимпатические структуры ВНС.

Известен способ обследования больной с синдромом раздраженного кишечника после лечения у нее бесплодия бусерелином. Проводили исследование биопсийного материала путем гистологического анализа и иммуногистохимии. Образцы плазмы исследовались с помощью стандартных серологических анализов. Результатом исследования было обнаружение антител против гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH), a также выявление заметного уменьшения количества кишечных GnRH-продуцирующих нейронов. Это позволяло предположить наличие у данного пациента развитые синдрома раздраженного кишечника за счет бусерелин-индуцированного образования анти-GnRH антител, уничтожающих GnRH нейроны, происходящие из мышечно-кишечного сплетения. (Ohlsson В, Veress В, Janciauskiene S, Montgomery A, Haglund M, Wallmark A: Chronic intestinal pseudo-obstruction due to buserelininduced formation of anti-GnRH antibodies., Gastroenterology, 2007, 132:45-51). Указанное исследование подтверждает важность выявления причин нарушения регуляции моторной и секреторной функции кишечника, в том числе и основного места поражения отделов ВНС.

На сегодняшний день известен способ диагностики аутоиммунного поражения интрамуральных ганглиев желудочно-кишечного тракта путем определения в плазме и сыворотке крови больных, страдающих нарушением кишечной моторики, синдромом раздраженного кишечника (СРК) либо парезом, C-реактивного белка, растворимого CD40 и антител к GnRH. Причем анализ антител к GnRH проводили методом ELISA при оптическом поглощении света 405 нм. Измерение проводили в фотометре Titertek Multiscan при разбавлении сыворотки крови 1:40. Сыворотка крови 20 здоровых доноров служила в качестве контроля. Причем антитела против гонадотропин-рилизинг-гормона и нарушения моторики ЖКТ были найдены независимо от лечения больного аналогами GnRH. Титр антител также коррелировал с уровнем CD40 (RS=1,000, p<0,01), но не с C-реактивным белком. (Bodil Ohlsson, Eva Ekblad, Béla Veress, Agneta Montgomery and Sabina Janciauskiene RAesneatrcihb aorticdleies against gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and destruction of enteric neurons in 3 patients suffering from gastrointestinal dysfunction, BMC, Gastroenterology, 2010, 10:48). Данный способ рассмотрен нами в качестве ближайшего аналога. Однако этот метод не обладает высокой точностью из-за малого разведения, так как дает большое количество ложноположительных результатов и выявляет вовлечение в аутоиммунный процесс и поражение только интрамуральных ганглиев ЖКТ.

Технический результат заключается в том, что предложенный нами метод обеспечивает высокую точность определения вовлечения в аутоиммунный процесс структур вегетативной нервной системы, регулирующих моторику ЖКТ, и выявления поражаемой молекулярной мишени, в частности парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС желудочно-кишечного тракта.

Указанный технический результат достигается тем, что для диагностики аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта проводят исследование образца сыворотки крови больного, при этом в указанном образце определяют антитела к α3-субъединице нейронального ацетилхолинового рецептора (α3-АХР) и гонадолиберину (GnRH) методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) по взаимодействию с экстрацеллюлярным участком α3-субъединицы нейронального АХР и рилизинг-гормоном GnRH, а уровень антител к α3-АХР и GnRH определяют окрашиванием, используя в качестве хромогена тетраметилбензидин, оптическое поглощение света измеряют на ИФА-анализаторе при длине волны 450 нм в единицах оптической плотности (OD) и при повышении уровня антител к α3-АХР более 0,24 OD, a к GnRH менее 0,25 OD и до полного их отсутствия относительно контроля диагностируют аутоиммунное поражение периферического отдела вегетативной нервной системы на уровне парасимпатических интрамуральных ганглиев и микроганглиев желудочно-кишечного тракта, а при уровне антител к GnRH более 0,25 OD и к α3-АХР менее 0,24 OD и до полного их отсутствия диагностируют аутоиммунное поражение интрамуральных ганглиев и микроганглиев метасимпатического отдела желудочно-кишечного тракта.

Способ осуществляется следующим образом.

Для верификации вовлечения в аутоиммунный процесс парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС у больного осуществляют забор крови из кубитальной вены, затем отделяют сыворотку от кровяного сгустка путем центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин. Сыворотку тестируют на наличие антител к α3-субъединице нейронального ацетилхолинового рецептора (α3-АХР) и к рилизинг гормону гонадолиберину (GnRH) в ИФА. Количественное определение уровня антител проводят методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием в качестве хромогена тетраметилбензидин. В качестве антигенов используют генно-инженерные конструкции экстрацеллюлярного домена α3-АХР и рилизинг гормона GnRH. Оптическое поглощение света на конечном этапе тИФА измеряют на ИФА-анализаторе при длине волны 450 нм в единицах оптической плотности (OD). Повышенным считается уровень антител к α3-АХР более 0,24 и к GnRH - более 0,25 OD 450 нм.

Для количественного определения уровня аутоантител к α3-АХР и GnRH было проведено следующее исследование с помощью тИФА. На 96-луночные планшеты фирмы «Costar» сорбируют экстрацеллюлярный домен α3 субъединицы нейронального АХР и рилизинг-гормон GnRH в концентрации 2 мкг/лунку и инкубируют в течение 60 минут при 37°C. Первый ряд лунок оставляют свободными для конъюгатного контроля. Для блокирования неспецифического связывания в лунки вносят 2% раствор BSA (Sigma) в PBS/Твин-20 по 200 мкл/лунку и инкубируют 60 минут при 37°C. После инкубации во второй ряд вносят сыворотки контрольных доноров, во все последующие ряды вносят сыворотки больных с нарушением регуляции моторной и секреторной функции кишечника в разведении 1:100 и инкубируют 60 мин при 37°C с последующим 3-кратным отмыванием (0,2% BSA в РВ8/Твин-20 по 200 мкл/лунку) в течение 3-х минут. Наличие антител определяют окрашиванием с использованием конъюгата пероксидазы с анти-IgG человека (Sigma), который вносят по 100 мкл/лунку при разведении 1:1000 и инкубируют 60 минут при 37°C, после чего проводят 3-кратное отмывание (0,2% BSA в PBS/TBHH-20 по 200 мкл/лунку) в течение 3-х минут. В качестве хромогена используют тетраметиленбензидин (Sigma): 10 мг растворяют в 5 мл нитратного буфера (pH 4,5) и 15 мкл пероксида водорода и вносят по 100 мкл/лунку. Окрашивание развивается в течение 20 минут. Торможение реакции осуществляют 0,25 М раствором серной кислоты - 100 мкл/лунку. Измерение оптического поглощения света при длине волны 450 нм проводят на ИФА-анализаторе. Результаты выражают в единицах оптической плотности (OD).

Предлагаемым способом было обследовано 10 здоровых доноров и 14 пациентов с различными нарушениями структур вегетативной нервной системы, регулирующих моторику желудочно-кишечного тракта. В частности пациенты, страдающие нарушением кишечной моторики, синдромом раздраженного кишечника (СРК) либо парезом на фоне неврологической патологии. Во всех случаях показатели уровня антител соответствовали состоянию больных и здоровых доноров (контроль). В частности у 5 больных при повышенном уровне антител к α3-АХР более 0,24 OD, a к GnRH менее 0,25 OD и в некоторых случаях полном их отсутствии к GnRH относительно контроля наблюдалось аутоиммунное поражение периферического отдела вегетативной нервной системы на уровне парасимпатических интрамуральных ганглиев и микроганглиев желудочно-кишечного тракта. А у 9 пациентов при уровне антител к GnRH более 0,25 OD и к α3-АХР менее 0,24 OD или полном их отсутствии у 4 из 9 к α3-АХР наблюдалось аутоиммунное поражение интрамуральных ганглиев и микроганглиев метасимпатического отдела желудочно-кишечного тракта. Среднее значение содержания антител в контрольной группе составило: к α3 АХР - 0,2±0,04 OD, к GnRH - 0,18±0,07 OD.

На основании полученных результатов были разработаны иммуноаналитические тест-системы, позволяющие проводить количественное определение антител к этим антигенам при различных формах нарушений моторики ЖКТ с выявлением поражаемой молекулярной мишени, в частности интрамуральных ганглиев и микроганглиев парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС желудочно-кишечного тракта. Кроме того, эти результаты позволяли также рекомендовать адекватную дифференцированную терапию.

Таким образом, предложенный способ обладает высокой специфичностью выявления наличия антител к α3-АХР и к GnRH в тИФА и позволяет с высокой точностью обнаруживать отсутствие или наличие антител и их количественный уровень, при котором диагностируют аутоиммунное поражение периферического парасимпатического и метасимпатического отдела ВНС желудочно-кишечного тракта. Это обеспечивает своевременное адекватное лечение, направленное на подавление аутоиммунного поражения парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС желудочно-кишечного тракта и улучшение качества жизни пациентов с периферической вегетативной недостаточностью (ПВН).

Таким образом, предложенный способ отличается от известного уровня техники следующим:

1) позволяет проводить оценку структур ВНС желудочно-кишечного тракта путем исследования крови пациентов разработанным нами методом тИФА в сыворотке крови по взаимодействию с экстрацеллюлярным участком α3-субъединицы нейронального АХР и рилизинг-гормоном GnRH;

2) позволяет оценить уровень поражения структур ВНС желудочно-кишечного тракта;

3) позволяет проводить дифференциальную диагностику, объективизировать динамику патологического процесса, а также облегчает выбор адекватной терапии у больных с признаками ПВН и различными формами нарушений моторики ЖКТ;

4) является более экономичным и не менее чувствительным по сравнению с другими методами;

5) позволяет количественно определять уровень антител к α3-АХР и GnRH, что может характеризовать в какой-то степени и тяжесть аутоиммунного поражения на уровне парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС желудочно-кишечного тракта.

Примеры реализации способа

Пример 1

Больная П., 54 лет, поступила с жалобами на запоры, сменяющиеся учащенным жидким стулом (до 12-15 раз за ночь), слабость в положении стоя и сидя, невозможность передвигаться без утягивающей одежды, быстрая утомляемость, сухость кожи и слизистых оболочек с проксимальным гипергидрозом. Объективно у больной имеются признаки периферической вегетативной недостаточности, прогрессирующей в течение 8 лет: синдром Горнера справа, нарушение аккомодации с извращенной реакцией зрачков в пробе с адреналином, обратная реакция артериального давления в клиностатической и ортостатической пробе (повышение в положении лежа и существенное снижение - в положении стоя), отсутствие динамики частоты сердечных сокращений при изменении позы. Получала симптоматическую терапию (усиленный водный режим, минералокортикоиды, утягивающую одежду) с незначительным временным эффектом на фоне прогрессирования заболевания. Для выявления причин нарушения моторики желудочно-кишечного тракта проведено исследование сыворотки крови пациентки предлагаемым количественным тИФА способом. Выявлено значительное повышение уровня аутоантител к α3-АХР: 1,78 OD 450 нм. Антитела к GnRH составляли 0,01 OD 450 нм, что соответствует аутоиммунному поражению периферического отдела вегетативной нервной системы на уровне парасимпатических интрамуральных ганглиев и микроганглиев желудочно-кишечного тракта. С учетом этих данных было проведено лечение иммуносупрессантами (преднизолоном) в течение 10 дней. В результате указанного лечения у больной восстановилась моторика желудочно-кишечного тракта до нормы.

Пример 2

Больная X., 29 лет, поступила с диагнозом вегето-сосудистая дистония, синдром раздраженного кишечника, многократные оперативные вмешательства на органах малого таза и аппендэктомией (проведенных по настоятельной просьбе больной). У больной выявлены симптомы вегетативной дисфункции в виде приступов тахикардии, потливости, абдоминальных болей и нарушений моторики ЖКТ. Для выявления причин нарушения моторики ЖКТ и абдоминальных болей проведено исследование сыворотки крови предлагаемым количественным тИФА способом. Выявлено повышение уровня антител к GnRH: 0,78 OD 450 нм. Антитела к α3-АХР отсутствовали. На основании анализа был поставлен диагноз аутоиммунного поражения интрамуральных ганглиев и микроганглиев метасимпатического отдела вегетативной нервной системы желудочно-кишечного тракта. С учетом этих данных больной был назначен нейромидин - препарат, облегчающий освобождение ацетилхолина и улучшающий таким образом холинергическую передачу. Через 7 дней состояние больной заметно улучшилось, исчезли вышеописанные симптомы.

Пример 3

Больная И., 47 лет, наблюдается в НЦ Неврологии РАМН с диагнозом миастения, генерализованная форма. У больной жалобы на периодическую диарею, сменяющуюся кратковременными запорами, не связанными с погрешностями в диете. Объективно имеются симптомы вегетативной дисфункции в виде приступов тахикардии, потливости с сухостью слизистых оболочек, нарушения зрения (помимо диплопии, связанной с миастеническим наружным офтальмопарезом, периодически - «расфокусировка» контуров предметов на среднем расстоянии), помимо слабости и утомляемости произвольных мышц, общая слабость, повышенная утомляемость. Проведенное лечение ингибиторами ацетилхолинэстеразы АХЭ не привело к восстановлению моторики ЖКТ. Для выявления причин нарушения моторики ЖКТ и абдоминальных болей проведено исследование сыворотки крови предлагаемым количественным тИФА способом. Выявлено отсутствие антител как к α3-АХР, так и к GnRH. Это позволило указанные нарушения рассматривать как не относящиеся к аутоиммунному поражению ни на уровне парасимпатического, ни на уровне метасимпатического отделов вегетативной нервной системы желудочно-кишечного тракта. Дальнейшие исследования показали, что нарушения моторики ЖКТ и абдоминальные боли у больной возникли в результате дисгормональных нарушений (4 года назад оперирована по поводу рака щитовидной железы, есть нарушения менструального цикла с чередованием маточных кровотечения и длительных периодов аменореи). Скорректированная с учетом этих данных медикаментозная терапия позволила уже на 8-й день улучшить состояние больной в отношении абдоминальных болей, диареи и запоров.

Таким образом, определение антител к α3-АХР и к GnRH методом тИФА в сыворотке крови по взаимодействию с экстрацеллюлярным участком α3-субъединицы нейронального АХР и к GnRH отражает ганглионарный уровень поражения парасимпатического отдела ВНС и аутоиммунное поражение моторики ЖКТ. Заявляемый метод тИФА позволяет добиться улучшения диагностического процесса у больных, имеющих признаки периферической вегетативной недостаточности и нарушения моторики ЖКТ в короткие сроки, проследить динамику патологического процесса и выбрать правильную тактику лечения. При высокой специфичности способ является более простым и экономичным и обеспечивает возможность осуществления диагностики аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта.

Способ также позволяет провести дифференциальную диагностику так называемых "функциональных" диспептических явлений, связанных с нарушениями вегетативной иннервации ЖКТ аутоиммунного генеза.

Способ диагностики аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта, включающий исследование сыворотки крови больного, отличающийся тем, что в образце сыворотки крови больного определяют антитела к α3-субъединице нейронального ацетилхолинового рецептора (α3-АХР) и рилизинг-гормону гонадолиберину (GnRH) методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) по взаимодействию с экстрацеллюлярным участком α3-субъединицы нейронального АХР и рилизинг-гормоном GnRH, а уровень антител к α3-АХР и GnRH определяют окрашиванием, используя в качестве хромогена тетраметилбензидин, оптическое поглощение света измеряют на ИФА-анализаторе при длине волны 450 нм в единицах оптической плотности (OD) и при повышении уровня антител к α3-АХР более 0,24 OD, a к GnRH менее 0,25 OD и до полного их отсутствия относительно контроля диагностируют аутоиммунное поражение периферического отдела вегетативной нервной системы на уровне парасимпатических интрамуральных ганглиев и микроганглиев желудочно-кишечного тракта, а при уровне антител к GnRH более 0,25 OD и к α3-АХР менее 0,24 и до полного их отсутствия диагностируют аутоиммунное поражение интрамуральных ганглиев и микроганглиев метасимпатического отдела желудочно-кишечного тракта.