Композиции телмисартана в форме наночастиц и способ их получения

Композиции телмисартана в форме наночастиц и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение направлено на композиции наноструктурированного (в форме наночастиц) телмисартана, на способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции.

Наночастицы телмисартана в соответствии с изобретением имеют средний размер частиц менее чем примерно 600 нм. Телмисартан является антагонистом рецептора ангиотензина II (ARB), применяемым при лечении гипертензии.

Предшествующий уровень техники

А. Предшествующий уровень техники, относящийся к образованию/получению наночастиц

Разработка наночастиц для фармацевтических применений имеет дело с возникновением новых технологий для развития производственных решений под заказ для систем доставки лекарств. Системы доставки лекарств должны положительно влиять на скорость всасывания, распределение, метаболизм и выведение лекарства или других родственных химических веществ в организме. Кроме того, система доставки лекарства должна давать возможность лекарству связываться с его рецептором-мишенью и влиять на передачу сигнала и активность этого рецептора. Материалы для доставки лекарства должны быть совместимыми с ним, легко связываться с конкретным лекарством и обладать способностью к разложению на фрагменты после применения, которые либо претерпевают метаболизм, либо выводятся через нормальные экскреторные пути.

Другой подход состоит в получении активного ингредиента (АФИ) в форме наночастиц.

Композиция телмисартана описана в заявках на патент US 20020094997, US2009/0030057 Al, US 20090012140 и ЕР 1797872 Al.

Наночастицы АФИ могут быть получены, используя, например, методы измельчения, гомогенизации, осаждения или методы сверхкритических сред, которые известны в данной области техники. Способы получения композиций в форме наночастиц также описаны в US 5718388, US 5862999, US 5665331, US 5543133, US 5534270.

Б. Предшествующий уровень техники, относящийся к телмисартану

Телмисартан химически описан как 4′-[(1,4′-диметил-2′-пропил2,6′-би-1Н-бензимидазол]-1^`-ил)метил]-[1,1′-дифенил]-2-карбоновая кислота. Его эмпирическая формула представляет собой C₃₃H₃₀N₄O₂, его молекулярная масса равна 514,63, и его структурная формула представляет собой:

Телмисартан представляет собой твердое вещество от белого до слегка желтоватого цвета. Он практически нерастворим в воде и в диапазоне рН от 3 до 9, слаборастворим в сильной кислоте (за исключением нерастворимости в соляной кислоте) и растворим в сильном основании.

Телмисартан имеется в продаже в виде таблеток для перорального введения, содержащих 20 мг, 40 мг или 80 мг телмисартана. Таблетки содержат нижеследующие неактивные ингредиенты: гидроксид натрия, меглумин, повидон, сорбит и стеарат магния. Таблетки гигроскопичны и требуют защиты от влаги.

Фармакологические свойства

После перорального введения пиковые концентрации (С_max) телмисартана достигаются за 0,5-1 час после дозирования. Пища несколько уменьшает биодоступность телмисартана при снижении площади под кривой концентрации плазмы по времени (AUC) примерно 6% для таблетки 40 мг и примерно 20% после дозы 160 мг. Абсолютная биодоступность телмисартана дозозависима. При дозе 40 и 160 мг биодоступность составляла 42% и 58%, соответственно. Фармакокинетика введенного перорально телмисартана является нелинейной на протяжении диапазона дозы 20-160 мг с более чем пропорциональными возрастаниями концентраций в плазме (С_max и AUC) при возрастающих дозах. Телмисартан проявляет кинетику биэкспоненциального распада с конечным периодом полувыведения примерно 24 часа. Концентрации в плазме телмисартана при однократном дозировании в сутки составляют 10-25% пиковых концентраций в плазме. Телмисартан имеет индекс накопления в плазме от 1,5 до 2,0 при повторном дозировании один раз в сутки.

Метаболизм и элиминация

После либо внутривенного, либо перорального введения ¹⁴С-меченого телмисартана большая часть введенной дозы ( >97%) была элиминирована неизмененной в фекалиях посредством билиарной экскреции; только незначительные количества были обнаружены в моче (0,91% и 0,49% суммарной радиоактивности соответственно).

Телмисартан претерпевает метаболизм посредством конъюгации с образованием фармакологически неактивного ацилглюкуронида; глюкуронид родительского соединения является единственным метаболитом, который идентифицирован в плазме и моче человека. После однократной дозы глюкуронид представляет примерно 11% измеренной радиоактивности в плазме. Изоферменты цитохрома Р450 не вовлечены в метаболизм телмисартана.

Общий клиренс телмисартана составляет более 800 мл/мин. Конечный период полувыведения и общий клиренс оказались независимыми от дозы.

Распределение

Телмисартан в высокой степени связывается с белками плазмы ( >99,5%), в основном, с альбумином и α1 - кислым гликопротеином. Связывание белков плазмы является постоянным на протяжении диапазона концентрации, достигаемого при рекомендуемых дозах. Объем распределения для телмисартана составляет примерно 500 литров, что указывает на дополнительное тканевое связывание.

Побочные эффекты

Чаще всего спонтанно сообщаемыми побочными эффектами являются: головная боль, головокружение, астения, кашель, тошнота, утомляемость, слабость, отечность, отечность лица, отечность нижних конечностей, ангионевротический отек, крапивница, гиперчувствительность, повышенное потоотделение, эритема, боль в грудной клетке, мерцательная аритмия, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, повышенное кровяное давление, обострение гипертензии, гипотензия (включая постуральную артериальную гипотензию), гиперкалемия, синкопе, диспепсия, диарея, боль, инфекция мочевых путей, эректильная дисфункция, боль в спине, боль в животе, мышечные судороги (включая судороги ног), миалгия, брадикардия, эозинофилия, тромбоцитопения, повышенная мочевая кислота, аномальная функция печени/расстройство печени, нарушение функции почек, включая острую почечную недостаточность, анемия и повышенная креатинфосфокиназа (КФК).

В связи с нерастворимостью телмисартана в воде в данной области техники существует потребность в усилении липофильности/биодоступности/повышении всасывания/снижении побочных эффектов/уменьшении дозировки/снижении пищевого эффекта с целью преодоления проблем, связанных с применением общепринятых препаратов телмисартана предшествующего уровня техники. Кроме того, эти проблемы могут быть решены путем поверхностной модификации, чтобы уменьшить пресистемный метаболизм или модифицировать метаболизм телмисартана. Кроме традиционного препарата телмисартана, чрескожное применение могло бы уменьшить время, которое нужно для достижения желаемого эффекта телмисартана. Настоящее изобретение удовлетворяет данную потребность.

Описание изобретения

В настоящем изобретении описана наноструктурированная композиция телмисартана (в форме наночастиц) с усиленной липофильностью/биодоступностью/повышенным всасыванием и скоростью растворения/сниженными побочными эффектами/сниженной дозировкой.

Как приведено в нижеописанных примерах, не каждая комбинация стабилизаторов приведет в результате к стабильному образованию наночастиц. Было обнаружено, что стабильные наночастицы телмисартана могут быть получены непрерывным проточным способом, предпочтительно непрерывным проточным способом на основе микроструйной техники, используя выбранные стабилизаторы.

Изобретение включает наноструктурированный телмисартан, имеющий средний размер частиц менее чем примерно 600 нм.

Наноструктурированный телмисартан в соответствии с изобретением имеет средний размер частиц от 600 нм до 50 нм, предпочтительно от 200 нм до 50 нм.

Следующий аспект изобретения составляет композиция наноструктурированного телмисартана, содержащая:

(a) наноструктурированный телмисартан, имеющий средний размер частиц менее чем примерно 600 нм; и

(b) по меньшей мере один стабилизатор.

Композицию по изобретению получают в проточном реакторе непрерывного действия, предпочтительно в проточном реакторе непрерывного действия на основе микроструйной техники.

В композиции по изобретению средний размер частиц телмисартана предпочтительно составляет от 600 нм до 50 нм, предпочтительно от 200 нм до 50 нм.

В композиции по изобретению: (а) телмисартан присутствует в количестве, выбранном из группы, состоящей из: от примерно 99,5% до примерно 0,001%, от примерно 95% до примерно 0,1%, и от примерно 90% до примерно 0,5% масс/масс, на основе суммарной объединенной массы телмисартана и по меньшей мере одного стабилизатора, не включая другие эксципиенты; (b) стабилизатор присутствует в количестве, выбранном из группы, состоящей из: от примерно 0,5% до примерно 99,999% масс/масс, от примерно 5,0% до примерно 99,9% масс/масс и от примерно 10% до примерно 99,5% масс/масс, на основе суммарной объединенной сухой массы телмисартана и по меньшей мере одного стабилизатора, не включая другие эксципиенты; или (с) комбинация (а) и (b).

В композиции по изобретению телмисартан можно использовать в кристаллической фазе, аморфной фазе, полукристаллической фазе, полуаморфной фазе и фазе со-кристалла, а также в их смесях в любой полиморфной форме.

Для получения композиции по изобретению можно использовать стабилизаторы, включающие неионные, анионные, катионные, ионные полимеры/сурфактанты и цвиттерионные сурфактанты. Комбинации более чем одного стабилизатора также можно использовать в изобретении. Полезные стабилизаторы, которые можно использовать в изобретении, включают, но не ограничены ими, любые органические и неорганические фармацевтические эксципиенты. Такие эксципиенты включают различные полимеры, низкомолекулярные олигомеры, натуральные продукты и сурфактанты.

Репрезентативные примеры стабилизаторов включают гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, поливинилпирролидон, лаурилсульфат натрия, желатин, декстран, стеариновую кислоту, глицеринмоностеарат, цетостеариловый спирт, сложные эфиры сорбита, полиоксиэтиленовые производные касторового масла, полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирной кислоты (например, имеющиеся в продаже продукты Твин®, такие как, например, Твин® 20 и Твин® 80 (lCl Speciality Chemicals)); полиэтиленгликоли (например, Карбовакс® 3550 и 934 (Union Carbide), полимеры и сополимеры на основе поли(мет)акрилата (Eudargit®), сополимер этенилового эфира уксусной кислоты и 1-этенил-2-пирролидинона (сополимеры PVP/VA), додецилбензолсульфонат натрия, сукцинаты токоферилполиэтиленгликоля, полиэтоксилированные касторовые масла и их производные, полиоксиэтиленстеараты, метилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, ацетофталат целлюлозы, поливиниловый спирт (PVA), сополимер 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фенола с этиленоксидом и формальдегидом (также известный как тилоксапол, суперион и тритон), полоксамеры (например, плюроники, которые представляют собой блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида); полоксамины (например, тетроник, также известный как полоксамин, который представляет собой тетрафункциональный блок-сополимер, образованный в результате последовательного присоединения пропиленоксида и этиленоксида к этилендиамину (BASF Wyandotte Corporation, Parsippany, N.J.); ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-холестерин, производное ПЭГ-холестерина, ПЭГ-витамин А, ПЭГ-витамин Е, лизоцим, поли(2-этил-2-оксазолин), поли(метилвиниловый эфир), статистические сополимеры винилпирролидона и винилацетата, такие как Plasdone S630, и тому подобное.

Примеры полезных ионных стабилизаторов включают, но не ограничены ими, полимеры, биополимеры, полисахариды, целлюлозные полимеры, альгинаты, фосфолипиды и неполимерные соединения, такие как цвиттерионные стабилизаторы, поли-н-метилпиридиний, антрилпиридиния хлорид, катионные фосфолипиды, хитозан, полилизин, поливинилимидазол, полибрен, сополимер полиметилметакрилата и триметиламмония бромида (РММТМАВr), бензалкония хлорид, гексадецилтриметиламмония бромид, гексилдезилтриметиламмония бромид (HDMAB) и поли(винилпирролидон)-2-диметиламиноэтилметакрилата диметилсульфат.

Преимущества композиции по изобретению включают, но не ограничены ими: (1) меньший размер таблетки или другой твердой лекарственной формы и благоприятное чрескожное/местное применение; (2) более низкие дозы лекарства, требующиеся для получения такого же фармакологического эффекта по сравнению с общепринятыми формами телмисартана; (3) повышенную биодоступность по сравнению с общепринятыми формами телмисартана; (4) улучшенные фармакокинетические профили; (5) повышенную скорость растворения для наночастиц телмисартана по сравнению с общепринятыми формами того же активного соединения; (6) модифицированный метаболизм наночастиц телмисартана.

Для получения композиции по изобретению можно использовать способы, включающие непрерывное осаждение растворителем - осадителем, используя один или более чем один стабилизатор, или непрерывное химическое осаждение с использованием одного или более чем одного стабилизатора с образованием наночастиц без преобразования формы телмисартана или образования аморфного лекарства и без предварительной стерилизации.

Другой аспект изобретения составляет способ получения наноструктурированного телмисартана, включающий осаждение наноструктурированного телмисартана из соответствующего раствора телмисартана, содержащего один или более чем один стабилизатор, если желательно, в присутствии фармацевтически приемлемой кислоты, в проточном реакторе непрерывного действия.

В качестве проточного реактора непрерывного действия можно использовать проточный реактор непрерывного действия на основе микроструйной техники.

Используемый проточный реактор непрерывного действия на основе микроструйной техники описан в публикации Microfluid Nanofluid DOl 10.1007/s10404-008-0257-9 авторами l.Hornyak, В.Borcsek и F.Darvas.

Предпочтительно этот способ можно осуществлять путем (1) растворения телмисартана и возможно одного или более чем одного стабилизатора в подходящем растворителе; (2) добавления композиции со стадии (1) к раствору, возможно содержащему стабилизатор(ы), если желательно, в присутствии фармацевтически приемлемой кислоты; и (3) осаждения композиции со стадии (2).

Другой предпочтительной формой осуществления этого способа является та, где способ осуществляют путем (1) растворения телмисартана и возможно одного или более чем одного стабилизатора в подходящем растворителе; (2) добавления композиции со стадии (1) к раствору, содержащему один или более чем один стабилизатор, если желательно, в присутствии фармацевтически приемлемой кислоты; и (3) осаждения композиции со стадии (2).

Наиболее предпочтительно способ по изобретению осуществляют путем (1) растворения телмисартана и одного или более чем одного стабилизатора в растворе гидроксида щелочного металла; (2) добавления композиции со стадии (1) к раствору фармацевтически приемлемой кислоты, возможно содержащему один или более чем один стабилизатор; и (3) осаждения композиции со стадии (2).

В качестве растворителей (а) можно использовать два различных растворителя, смешиваемых друг с другом, где телмисартан растворим только в одном из них, или (b) можно использовать один и тот же растворитель на двух стадиях, где полиэлектролитный комплекс телмисартана образует наноструктурированные частицы, практически с тем ограничением, что применяемый стабилизатор растворим в используемых растворителях.

Такие растворители могут предпочтительно представлять собой растворы гидроксидов щелочных металлов, предпочтительно раствор гидроксида натрия, диметилсульфоксид, этанол, изопропанол, тетрагидрофуран, ацетон, метилэтилкетон, диметилформамид, диэтиленгликоля этиловый эфир.

В качестве фармацевтически приемлемых кислот можно использовать уксусную кислоту, лимонную кислоту, малеиновую кислоту, щавелевую кислоту, муравьиную кислоту, бензойную кислоту и тому подобное.

На размер частиц телмисартана в форме наночастиц могут влиять используемые растворители, скорость тока и отношение телмисартана к стабилизатору.

Другой аспект изобретения направлен на хорошую/мгновенную повторную диспергируемость твердой наномерной формы телмисартана в биологически релевантных средах, например, в физиологическом растворе, растворе рН=2,5 HCl.

Другой аспект изобретения составляет стабильная фармацевтическая композиция, содержащая телмисартан в форме наночастиц или его композицию в соответствии с изобретением и возможно фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

Фармацевтическую композицию по изобретению можно готовить: (а) для введения, выбранного из группы, состоящей из перорального, легочного, ректального, толстокишечного, парентерального, интрацистернального, интравагинального, внутрибрюшинного, глазного, ушного, локального, трансбуккального, назального и местного введения; (b) в лекарственной форме, выбранной из группы, состоящей из жидких дисперсий, гелей, аэрозолей, мазей, кремов, лиофилизированных препаратов, таблеток, капсул; (с) в лекарственной форме, выбранной из группы, состоящей из препаратов регулируемого высвобождения, быстро плавящихся препаратов, препаратов замедленного высвобождения, препаратов пролонгированного высвобождения, препаратов импульсного высвобождения и смешанных препаратов быстрого высвобождения и регулируемого высвобождения; или (d) любой комбинации (а), (b) и (с).

Композиции можно готовить путем добавления различных типов эксципиентов для перорального введения в твердых, жидких, вагинальных, ректальных, локальных (порошки, мази или капли) или местных формах введения, и тому подобного.

Предпочтительной лекарственной формой по изобретению является твердая или жидкая (крем/мазь) лекарственная форма, хотя можно использовать любую фармацевтически приемлемую лекарственную форму.

Для пероральной доставки в организм человека наночастицы можно также вводить в виде их водной дисперсии в качестве готовой лекарственной формы. Этот путь является путем доставки без дополнительной обработки после образования наночастиц. Однако слабая растворимость лекарства или полимера в водной среде или плохой вкус лекарства может требовать включения коллоидных частиц в твердые лекарственные формы, то есть в капсулы и таблетки.

Альтернативно водную дисперсию коллоидных частиц можно включать в твердую лекарственную форму в виде жидкости, например, путем грануляции подходящих наполнителей с коллоидной дисперсией с образованием гранулята. Такие гранулы можно впоследствии заполнять в капсулы или прессовать в таблетки. Альтернативно, посредством наслаивания дисперсии, например, на сахарные пилюли в качестве носителей в псевдоожиженном слое можно получить твердую форму наночастиц. За этими путями изготовления сердцевин таблеток, либо гранул, либо пилюль может потенциально следовать стадия покрытия с получением таблетки с пленочным покрытием или гранул с пленочным покрытием в капсуле в качестве готовой лекарственной формы.

Композиции, пригодные для парентеральной инъекции, могут содержать физиологически приемлемые, стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления в стерильных инъекционных растворах или дисперсиях. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей включают воду, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и тому подобное), их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъекционные органические эфиры, такие как этилолеат. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий и путем использования сурфактантов.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают, но не ограничены ими, капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активный агент смешан по меньшей мере с одним из приведенного ниже: (а) один или более чем один инертный эксципиент (или носитель), такой как цитрат натрия или двузамещенный фосфат кальция; (b) наполнители или разбавители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота; (с) связующие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (d) увлажнители, такие как глицерин; (е) разрыхлители, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые комплексные силикаты и карбонат натрия; (f) замедлители растворения, такие как парафин; (g) ускорители всасывания, такие как соединения четвертичного аммония; (h) смачивающие агенты, такие как цетиловый спирт и глицерилмоностеарат; (i) адсорбенты, такие как каолин и бентонит; и (j) смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. Для капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы могут также содержать буферные агенты.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к телмисартану жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области техники, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы. Примерными эмульгаторами являются этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, такие как хлопковое масло, масло земляного ореха, масло проростков пшеницы, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли, эфиры сорбита и жирных кислот, либо смеси этих веществ и тому подобное.

Кроме таких инертных разбавителей, композиция может также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащивающие, корригирующие и ароматизирующие агенты.

Фармацевтические композиции по изобретению проявляют усиленную липофильность/биодоступность/повышенную скорость всасывания и растворения/сниженные побочные эффекты/более быстрое начало действия, поэтому их можно применять в сниженной дозировке по сравнению с телмисартаном общепринятой формы при лечении гипертензии.

Настоящее изобретение также направлено на способы лечения гипертензии наночастицами телмисартана, раскрытыми в данной заявке.

А. Предпочтительные характеристики наночастиц телмисартана по изобретению

1. Повышенная биодоступность

Композиции телмисартана в форме наночастиц по изобретению предположительно проявляют повышенную биодоступность, более быстрое начало действия, сниженный пищевой эффект и требуют меньших доз по сравнению с ранее известными, общепринятыми препаратами телмисартана.

Пример 1:

Фармакокинетические тесты in vivo самцов крыс Спраг-Доули натощак: Сравнение эталонного активного фармацевтического ингредиента, имеющихся в продаже таблеток Прайтор, и наноструктурированного телмисартана

Экспериментальные протоколы

Сравнительные фармакокинетические тесты in vivo самцов крыс Спраг-Доули натощак

Однократная пероральная доза эталонного телмисартана составляла 30 мг/кг, а соответствующая доза препарата наноструктурированного телмисартана примера 8 составляла 223,8 мг/кг, что соответствует 30 мг/кг активного агента. Оба тестируемых вещества вводили через желудочный зонд в объеме дозирования 5 мл/кг. Носителем тестируемых веществ был стерильный 0,9% раствор NaCl, и гомогенность суспензии поддерживали путем непрерывного перемешивания во время обработки с целью минимизации ошибки в результате седиментации.

Сравнительные фармакокинетические тесты in vivo самцов крыс Спраг-Доули в условиях питания при введении суспензии наноструктурированной формы рН=5 и Прайтора

Однократная пероральная доза эталонного телмисартана составляла 30 мг/кг, а соответствующая доза препарата наноструктурированного телмисартана примера 8 составляла 223,8 мг/кг, что соответствует 30 мг/кг активного агента. Оба тестируемых вещества вводили через желудочный зонд в объеме дозирования 5 мл/кг. Носителем тестируемых веществ был стерильный 0,9% раствор NaCl, и его рН доводили до рН=5 1 н. раствором HCl. Гомогенность суспензии поддерживали путем непрерывного перемешивания во время обработки с целью минимизации ошибки в результате седиментации.

Животные

Самцов крыс Вистар (купленных в Laboratory Animal Center, University of Szeged) поддерживали на стандартном гранулированном рационе для грызунов (Bioplan Ltd, Isaszeg, Hungary) в контролируемых условиях температуры и освещения при свободном доступе к водопроводной воде. Период акклиматизации составлял по меньшей мере 4 суток. Крыс рандомизировали на группы по 6, и каждую группу использовали для взятия образцов крови через различные периоды времени после обработки телмисартаном. Все животные голодали в течение 16 часов перед пероральной обработкой. Животных анестезировали галотаном, и кровь отбирали путем пункции сердца через 15, 30, 45, 60, 120 и 360 минут после обработки телмисартаном. Вода была доступна сразу после обработки всех животных. Крысы в последней группе (умерщвляли через 360 мин) имели доступ к стандартному корму для грызунов в течение 120 минут после обработки. Образцы сыворотки готовили путем центрифугирования (7000 об/мин, 10 мин, 4°С) свернувшейся крови в пределах 60 минут и хранили при -20°С до анализа.

Приготовление образца

Аликвоту 200 сыворотки объединяли с 20 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта и 1,2 мл ацетонитрила для осаждения белка. Смесь перемешивали на вортексе в течение 1 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты выпаривали до сухости в потоке азота при 40°С и восстанавливали 200 мкл воды - метанола (50:50 об/об), и 20 мкл впрыскивали в систему ВЭЖХ.

Статистический анализ

Непарный t-критерий использовали для статистического сравнения сывороточных концентраций, принадлежащих к одним и тем же моментам времени. Статистический анализ и построение графика осуществляли с помощью программы GraphPad Prism 4.0 (программное обеспечение GraphPad Software, San Diego, USA).

Результаты

а) Сравнение эталонного и наноструктурированного телмисартана

Обработка как эталонным активным фармацевтическим агентом, так и наноструктурированным телмисартаном привела в результате к обнаружимой концентрации в сыворотке, проявляющей двухфазный профиль в интервале 15-360 мин после перорального введения 30 мг/кг тестируемого вещества. Всасывание телмисартана из наноструктурированного препарата явно было более быстрым и более полным, чем после введения эталонного вещества. После обработки наноструктурированным телмисартаном максимальная концентрация в сыворотке (С_mах) была определена через 45 мин, тогда как эталонный препарат приводил в результате к С_mах через 120 мин (фиг. 1).

Площадь под кривой концентрации в сыворотке между 15 и 360 мин (AUC_15-360мин) вычислена для характеристики степени всасывания тестируемых веществ. Наноструктурированный телмисартан приводил в результате к значению AUC_15-360мин 6412 мкг^∗мин/мл, тогда как данное значение после эталонной обработки составляло 940,1 мкг^∗мин/мл. Отношение двух значений AUC (AUC_15-360мин (наномерный) / AUC_15-360мин (эталонный)) составляло 6,82.

Фиг. 1: Концентрации в сыворотке телмисартана после перорального введения 30 мг/кг наноструктурированного и эталонного тестируемого вещества.

б) Сравнение имеющихся в продаже таблеток Прайтор и наноструктурированного телмисартана

Обработка как эталонным активным фармацевтическим агентом, так и наноструктурированным телмисартаном привела в результате к обнаружимой концентрации в сыворотке, проявляющей двухфазный профиль в интервале 15-360 мин после перорального введения 30 мг/кг тестируемого вещества. Статистически различающиеся концентрации в сыворотке, соответствующие одному и тому же времени, не были обнаружены между двумя обработками (непарный t-критерий). После обработки наноструктурированным телмисартаном максимальная концентрация в сыворотке (С_mах) была определена через 45 мин, тогда как таблетка Прайтор 40 мг привела в результате к С_mах через 60 мин.

Площадь под кривой концентрации в сыворотке между 15 и 360 мин (AUC_15-360мин) вычислена для характеристики степени всасывания тестируемых веществ. Наноструктурированный телмисартан приводил в результате к значению AUC_15-360мин 6412 мкг^∗мин/мл, тогда как данное значение после таблетки Прайтор 40 мг составляло 8069 мкг^∗мин/мл. Отношение двух значений AUC (AUC_15-360мин (наномерный) / AUC_15-360мин (таблетка Прайтор 40 мг)) составляло 0,795.

Концентрация в сыворотке телмисартана через 30 мин после введения проявляет минимум. Однако сравнение концентраций через 15, 30 и 45 мин (ANOVA с последующим критерием Ньюмана-Кеулса по полученным результатам) не выявило статистического различия. В целом представленные результаты четко указывают на то, что всасывание наноструктурированного телмисартана статистически идентично всасыванию, полученному после введения имеющегося в продаже лекарственного препарата (таблетки Прайтор 40 мг) (фиг. 2).

Фиг. 2: Концентрации в сыворотке телмисартана после перорального введения 30 мг/кг наноструктурированного тестируемого вещества и Прайтор.

в) Элиминация эффекта присутствия NaOH

Для оценки эффекта гидроксида натрия на растворимость проводили РК тест после введения таблетки Прайтор и наноструктурированного телмисартана примера 8 в физиологическом растворе, который доводили до рН=5. Всасывание телмисартана прослеживали в условиях питания.

Обработка как эталонным активным фармацевтическим агентом, так и наноструктурированным телмисартаном привела в результате к обнаружимой концентрации в сыворотке, проявляющей двухфазный профиль в интервале 15-360 мин после перорального введения 30 мг/кг тестируемого вещества в условиях питания. Всасывание телмисартана из наноструктурированного препарата является явно более быстрым и более полным, чем после введения эталонного вещества. После обработки наноструктурированным телмисартаном максимальная концентрация в сыворотке (С_mах) была определена через 30 мин, тогда как эталонный препарат приводил в результате к С_mах через 120 мин.

Площадь под кривой концентрации в сыворотке между 15 и 360 мин (AUC_15-360мин) вычислена для характеристики степени всасывания тестируемых веществ. Наноструктурированный телмисартан приводил в результате к значению АUС_15-360мин 2744 мкг^∗мин/мл, тогда как данное значение после эталонной обработки составляло 1242 мкг^∗мин/мл. Отношение двух значений AUC (AUC_15-360мин (наномерный) / АUС_15-360мин (эталонный)) составляло 2,21 (фиг. 3).

Фиг. 3: Концентрации в сыворотке телмисартана после перорального введения 30 мг/кг наноструктурированного тестируемого вещества и Прайтор при рН=5 в условиях питания.

Таблица 1: Результаты фармакокинетических тестов у крыс.

Пример 2:

Сравнительный фармакокинетический тест in vivo на самках собак породы бигль в условиях питания/натощак

Данное исследование было разработано для сравнения фармакокинетических параметров, полученных после перорального введения различных препаратов телмисартана у животных в условиях питания и натощак. Были использованы приведенные ниже препараты:

- Тестируемый препарат: наноструктурированный препарат телмисартана примера 8

- Тестируемый препарат: наноструктурированный препарат телмисартана примера 8 и NaOH, измеренный в облатке для введения

- Эталонный препарат: имеющаяся в продаже таблетка Прайтор 40 мг (введенная в облатке), изготовленная фирмой Pfizer AG.

Экспериментальные протоколы

Сравнительный фармакокинетический тест in vivo представлял собой перекрестное, двухпериодное исследование однократной дозы. Три самки собак бигль получали однократную пероральную дозу тестируемых и эталонного препаратов, содержащих одинаковое количество телмисартана. Доза активного ингредиента составляла 40 мг/животное. Концентрации в плазме телмисартана количественно определяли, используя надежный биоаналитический способ.

Для характеристики системного воздействия телмисартана основные фармакокинетические параметры (С_mах, Т_mах и AUC) определяли для индивидуальных кривых уровня в плазме против времени. Параметры, полученные после введения тестируемого препарата, сравнивали с параметрами, полученными для эталонной таблетки.

Животные

Собака породы бигль является подходящим видом, не относящимся к грызунам, для фармакокинетических исследований и приемлема для регуляторных органов. Эти собаки легко доступны, с ними легко обращаться, содержать их и дозировать, и они пригодны для исследования кривой всего уровня в плазме у каждого индивидуального животного. Системное воздействие было исследовано у шести собак.

Исследование проводили в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных, NRC, 1996 и в согласовании с принципами венгерского Акта 1998: XXVIII, регулирующего защиту животных.

Корм и кормление

Животные получали корм для собак Ssniff Hd-H, изготавливаемый фирмой Ssniff, Spezialdiaten GmbH. Корм был предложен ежесуточно по 300 г/собака примерно в одно и то же время. На следующее утро оставшийся корм убирали. Перед введениями животные голодали в течение ночи (по меньшей мере 12 ч). На сутки обработки животных рандомизировали в группу натощак, получающую корм примерно через 4 часа после введения. Животных рандомизировали в группы питания, получающие примерно 150 г стандартного рациона. Другие 150 г корма были предложены примерно через 4 часа после введения.

Сбор крови и отделение плазмы

Для определения уровней в плазме телмисартана примерно 3 мл крови собирали в пластмассовые флаконы с литиевой солью гепарина в качестве антикоагулянта. Моменты времени сбора крови приведены ниже для обоих периодов: перед дозированием (0 мин), 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после дозирования.

Кровь брали из v. cephalica antebrachii или v. saphena стерильными одноразовыми иглами.

После взятия образцов кровь держали охлажденной на колотом льду до центрифугирования. Образцы плазмы получали путем центрифугирования крови при 2000 g в течение 10 минут при 4°С в пределах 60 минут после взятия образцов крови. Отделенную плазму (примерно 1 мл) переносили в пробирки Эппендорф. Образцы плазмы сразу замораживали и хранили в морозильном аппарате для низкотемпературного замораживания (-20±5°С) до анализа.

Концентрации телмисартана определяли, используя надежный хроматографический биоаналитический способ.

Фармакокинетическая оценка

Фармакокинетическую оценку проводили путем использования программного обеспечения WinNonlin Professional Version 4.0.1 (Pharsight Corporation, USA). Индивидуальные кривые уровней плазмы против времени оценивали, используя некомпартментный метод.

Результаты

Пероральное введение имеющегося в продаже лекарства привело в результате к быстрому возрастанию концентраций телмисартана в сыворотке как натощак, так и в условиях питания. Скорость этого возрастания концентрации проявляла очень высокую межиндивидуальную вариабельность. Введение наномерного препарата телмисартана привело в результате к более медленному возрастанию концентраций в плазме, особенно в условиях питания, при значительно более низких межиндивидуальных различиях (на фиг.4. а-b показаны концентрации в плазме, определенные в первые 8 часов после перорального введения животным натощак (а) и в условиях питания (б)).

Площадь под кривой для всего периода исследования (0-72 ч) (AUC_last), C_max и t_max определяли на основании кривых и вычисляли относительную биодоступность (F_rel) наномерного препарата по сравнению с имеющимся в продаже лекарством (таблица 2). На фигурах показано пролонгированное t_max и сниженная С_mах для наномерного препарата, тогда как значения AUC_last были практически идентичны показателям относительно