Рсв-специфичные связывающие молекулы и средства для их получения

Рсв-специфичные связывающие молекулы и средства для их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биологии и медицины. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) является широко распространенным вирусом простудных заболеваний, принадлежащим к семейству парамиксовирусов. РСВ является вирулентным, легко передающимся вирусом и наиболее распространенной причиной заболеваний нижних дыхательных путей у детей в возрасте до 2 лет. Обычно, до 98% детей, получающих дневную медицинскую помощь, инфицированы РСВ в течение одного сезона заболевания. От 0,5% до 3,2% детей с инфекцией РСВ требуют госпитализации. В Соединенных Штатах в год регистрируется приблизительно 90000 случаев госпитализации и 4500 случаев смерти. Основными факторами риска для госпитализации в связи с РСВ являются преждевременные роды, хронические заболевания легких, врожденные пороки сердца, ослабленный иммунитет и возраст менее 6 недель у здоровых в остальном детей. Кроме поддерживающей терапии в виде адекватного питания и кислородной терапии не существует эффективного лечения РСВ положительного бронхиолита (капиллярного бронхита). Противовирусная терапия, такая как терапия Рибавирином, не доказала свою эффективность в отношение РСВ инфекции. Для профилактики РСВ инфекции зарегистрированы в качестве лекарственного средства только моноклональные антитела Паливизумаб (также называемые Синагис (Synagis)). Паливизумаб представляет собой генно-инженерное (гуманизированное) моноклональное антитело к гибридным белкам РСВ. Однако Паливизумаб не всегда является эффективным. Следовательно, существует потребность в альтернативных способах лечения и антителах против РСВ.

Предметом настоящего изобретения является создание средств и методов противодействия и/или предотвращения связанных с РСВ заболеваний. Еще одним предметом изобретения является получение альтернативных и/или улучшенных антител против РСВ, или функциональных эквивалентов таких антител, а также обеспечение стабильных клеток, способных производить антитела или их функциональные эквиваленты против РСВ.

Настоящее изобретение обеспечивает антитела и их функциональные эквиваленты, которые способны специфически связывать РСВ. Такие антитела и/или функциональные эквиваленты, также называемые в настоящем документе "анти-РСВ антитела" или "РСВ-специфические антитела", способны специфически связывать по меньшей мере один из компонентов РСВ, такой как, например, эпитоп белка РСВ. Неспецифическое связывание не подпадает под определение "специфическое связывание". Анти-РСВ антитела и функциональные эквиваленты по настоящему изобретению особенно подходят для противодействия и/или по меньшей мере частичного предотвращения РСВ-инфекции и/или неблагоприятных последствий РСВ инфекции. Одним из наиболее предпочтительных анти-РСВ антител по настоящему изобретению является антитело, обозначенное "D25", обладающее областью тяжелой цепи и областью легкой цепи, как показано на Фигуре 11A-D. CDR последовательность D25, которая, в частности, способствует антигенсвязывающим свойствам D25, показана на Фигуре 11D. Антитело D25 обладает гораздо лучшими по сравнению с зарегистрированным анти-РСВ антителом Паливизумаб характеристиками (Фиг.8). Например, D25 обладает значением IC50 около 0,4-1,5 нг/мл при in vitro анализе на обезвреживание, в котором клетки НЕр-2 инфицировали РСВ, а Паливизумаб обладает значением IC50 около 453 нг/мл.

Функциональный эквивалент антитела в настоящем документе определен как функциональная часть, производное или аналог антитела.

Функциональная часть антитела определяется как его часть, которая обладает, качественно, не обязательно количественно, по меньшей мере одним одинаковым свойством указанного антитела. Указанная функциональная часть способна связывать тот же антиген, что и указанное антитело, хотя и не обязательно в той же степени. Функциональная часть антитела предпочтительно представляет собой однодоменное антитело, одноцепочечное антитело, одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv), фрагмент Fab или F(ab')₂ фрагмент.

Функциональное производное антитела определяется как антитело, которое было изменено таким образом, что по меньшей мере одно свойство, предпочтительно, способность связывать антиген, у полученного соединения в основном остается качественно, не обязательно количественно, неизменным. Производное антитела может быть получено различными способами, например, посредством консервативных аминокислотных замен, где аминокислотный остаток заменен другим остатком в целом с аналогичными свойствами (размером, гидрофобностью, и т.д.), так что функционирование, в целом, вероятно, не будет серьезно затронуто.

Специалист в данной области техники вполне способен получить аналоги антитела. Это, например, может быть осуществлено посредством скрининга пептидной библиотеки или фаговой дисплейной библиотеки. Такие аналоги обладают по меньшей мере качественно, не обязательно количественно, одним одинаковым свойством с указанным антителом.

Как хорошо известно специалисту в данной области техники, тяжелая цепь антитела является большей из двух типов цепей, составляющих молекулу иммуноглобулина. Тяжелая цепь включает константный домен и вариабельный домен, где вариабельный домен участвует в связывания антигена. Легкая цепь антитела является меньшей из двух типов цепей, составляющих молекулу иммуноглобулина. Легкая цепь включает константный домен и вариабельный домен. Вариабельный домен легкой цепи вместе с вариабельным доменом тяжелой цепи участвует в связывании антигена.

Определяющие комплементарность районы (CDR) являются гипервариабельными районами, присутствующими в вариабельных доменах тяжелых цепей и вариабельных доменах легких цепей. CDR тяжелой цепи и связанной с ней легкой цепи антитела вместе образуют антигенсвязывающей сайт.

CDR последовательности, приведенные на Фигуре 11, обеспечивают желаемые характеристики связывания РСВ, и специалист в данной области техники способен создать варианты, включающие по меньшей мере одну измененную последовательность CDR, например, с применением консервативной аминокислотной замены. Консервативная аминокислотная замена предполагает замещение одной аминокислоты другой в целом с аналогичными свойствами (размером, гидрофобностью, и т.д.), так что общее функционирование, вероятно, не будет серьезно затронуто.

Также возможно изменить по меньшей мере одну CDR последовательность, приведенную на Фигуре 11, с целью получения варианта антитела, или его функционального эквивалента по меньшей мере с одним измененным свойством по сравнению с D25. Предпочтительно, в настоящем документе предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие последовательность CDR, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности CDR, приведенной на Фигуре 11, так что предпочтительные характеристики связывания D25 по меньшей мере частично сохранены и даже улучшены. CDR последовательность, приведенная на Фигуре 11, предпочтительно изменена таким образом, что полученное антитело или его функциональный эквивалент обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством, таким как, например, улучшенная аффинность связывания, избирательность и/или стабильность по сравнению с D25. Варианты антител или их функциональные эквиваленты, включающие аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности CDR, приведенной на Фигуре 11, находятся в объеме настоящего изобретения. Для изменения аминокислотной последовательности в уровне техники доступны различные методы. Например, последовательности тяжелой цепи или легкой цепи с желаемой последовательностью CDR искусственно синтезированы. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность CDR, мутировали, например, с использованием случайного или сайт-направленного мутагенеза.

Таким образом, в первом аспекте изобретение обеспечивает выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональный эквивалент, способное специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус, которое включает:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности NYIIN, и/или

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности GIIPVLGTVHYAPKFQG, и/или

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ETALVVSTTYLPHYFDN, и/или

- последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности QASQDIVNYLN, и/или

- последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности VASNLET.

Предпочтительно, указанное антитело также включает последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QQYDNLP.

Предпочтительно, антитело или функциональный эквивалент по настоящему изобретению включают последовательность CDR, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична по меньшей мере одной из последовательностей CDR, приведенных на Фигуре 11D. Наиболее предпочтительно, антитело или функциональный эквивалент по настоящему изобретению включает CDR последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична по меньшей мере одной из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 11D. Особенно предпочтительно антитело D25, описанное выше, включающее CDR последовательности, которые представляют собой CDR последовательности, приведенные на Фигуре 11D. Таким образом, особенно предпочтителен вариант по настоящему изобретению, который включает выделенные, искусственные или рекомбинантные антитела или их функциональные эквиваленты, способные специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус, которые включают:

- последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность NYIIN, и/или

- последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность GIIPVLGTVHYAPKFQG, и/или

- последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность ETALVVSTTYLPHYFDN, и/или

- последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность QASQDIVNYLN, и/или

- последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность VASNLET.

Предпочтительно, указанные антитела включают также CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность QQYDNLP.

В одном варианте предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие три CDR последовательности тяжелой цепи и три CDR последовательности легкой цепи, приведенные на фигуре 11D, или последовательности по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентичные приведенным последовательностям. Кроме того, предусмотрены выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональный эквивалент, включающие CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности NYIIN, и CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GIIPVLGTVHYAPKFQG, и CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ETALVVSTTYLPHYFDN, и CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QASQDIVNYLN, и CDR2 последовательности легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности VASNLET, и CDR3 последовательность легкой цепи, включающей последовательность, которая, по меньшей мере на 70% идентична последовательности QQYDNLP. Указанные антитела или их функциональные эквиваленты предпочтительно содержат CDR последовательности, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны CDR последовательностям тяжелой цепи и CDR последовательностям легкой цепи, приведенным на фигуре 1 ID. Также предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие вышеупомянутые CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности тяжелой цепи, а также вышеупомянутые CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности легкой цепи.

Также предусмотрены антитела или их функциональные эквиваленты, включающие вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности тяжелой цепи, приведенной на Фигуре 11. Такие последовательности тяжелой цепи обеспечивают желаемые свойства связывания РСВ, о чем свидетельствует антитело D25. Кроме того, предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, обладающие последовательностью тяжелой цепи, включающей последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности

QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTT YLPHYFDNWGQGTLVTVSS. Кроме того, аминокислотная вариабельная последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 11, обеспечивает желаемые свойства связывания РСВ, о чем свидетельствуют антитело D25. Поэтому также предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент с последовательностью легкой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности

DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV. Антитело или его функциональная часть по настоящему изобретению предпочтительно включают вариабельную последовательность тяжелой цепи и/или вариабельную последовательность легкой цепи, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны последовательности тяжелой цепи и/или последовательности легкой цепи, приведенным на Фигуре 11. Чем выше гомология, тем ближе указанное антитело или его функциональная часть к антителу D25. Антитело или его функциональная часть по настоящему изобретению предпочтительно состоит из тяжелой цепи, а также легкой цепи, которые похожи на тяжелую и легкую цепи D25. Поэтому, кроме того, предусмотрены антитело или его функциональная часть, включающие последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи, которые по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны последовательности тяжелой цепи и последовательности легкой цепи, приведенным на Фигуре 11.

В одном варианте предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие последовательность тяжелой цепи, состоящую из последовательности тяжелой цепи, приведенной на Фигуре 11, и последовательность легкой цепи, состоящую из последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 11. Кроме того, как хорошо известно специалисту в данной области, возможно создать сокращенную последовательность тяжелой цепи или легкой цепи при сохранении желаемого свойства связывать антиген. Предпочтительно, такие полученные сокращенные тяжелые цепи или легкие цепи обладали сокращенным константным районом по сравнению с первоначальными тяжелыми или легкими цепями. Вариабельный домен предпочтительно сохранить. Например, получены фрагмент Fab или фрагмент F(ab')₂ на основе последовательности тяжелой цепи или последовательности легкой цепи, приведенных на Фигуре 11. Поэтому также предусмотрен функциональный эквивалент антитела, включающий по меньшей мере функциональную часть последовательности, приведенной на Фигуре 11. Указанная функциональная часть имеет в длину не менее 20 аминокислот и включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична CDR1 последовательности тяжелой цепи, приведенной на фигуре 11D, и/или последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична CDR2 последовательности тяжелой цепи, приведенной на Фигуре 11D, и/или последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична CDR3 последовательности тяжелой цепи, приведенной на Фигуре 11D, и/или последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична CDR1 последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 11D, и/или последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична CDR2 последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 11D. Предпочтительно, указанная функциональная часть также включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична CDR3 последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 11D.

Другое особенно предпочтительное анти-РСВ антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, обозначаемое "AM14", которое обладает тяжелой цепью и легкой цепью, приведенными на Фигуре 14А. CDR последовательности AM14, которые, в частности, ответственны за антигенсвязывающую способность AM14, также представлены на Фигуре 14А.

В настоящем изобретении предусмотрено, что CDR последовательности, приведенные на Фигуре 14А, обеспечивают желаемые характеристики связывания РСВ, и специалист в области техники способен создать варианты, включающие по меньшей мере одну измененную последовательность CDR, например, применяя консервативные замены аминокислот. Консервативная замена аминокислоты предполагает замещение одной аминокислоты другой аминокислотой в целом с аналогичными свойствами (размером, гидрофобностью, и т.д.), так что общее функционирование, вероятно, не будет серьезно затронуто.

Также возможно изменить по меньшей мере одну CDR последовательность, приведенную на Фигуре 14А, с целью получения варианта антитела, или его функционального эквивалента по меньшей мере с одним измененным свойством по сравнению с AM14. Предпочтительно, предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие последовательность CDR, которая, по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR, приведенной на Фигуре 14А, так что предпочтительные характеристики связывания антигена AM14 по меньшей мере частично сохранены и даже улучшены. CDR последовательности, приведенные на Фигуре 14А, предпочтительно изменены таким образом, что полученное антитело или его функциональный эквивалент обладают, по меньшей мере, одним улучшенным свойством, таким как, например, улучшенная аффинность связывания, избирательность и/или стабильность, по сравнению с AM14. Варианты антител или их функциональные эквиваленты, включающие аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 70% идентичны последовательности CDR, приведенной на Фигуре 14А, находятся в рамках настоящего изобретения. В уровне техники доступны различные методы для изменения последовательности аминокислот. Например, последовательности тяжелой цепи или легкой цепи с желаемыми последовательностями CDR искусственно синтезированы. Предпочтительно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие последовательности CDR, мутировали, например, с использованием случайного или сайт-специфического мутагенеза.

Таким образом, в одном аспекте изобретение обеспечивает выделенные, искусственные или рекомбинантные антитела или их функциональные части, их производные и/или их аналоги, способные специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус и включающие:

- CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GFSFSHYA, и/или

- CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ISYDGENT, и/или

- CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ARDRIVDDYYYYGMDV, и/или

- CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QDIKKY, и/или

- CDR2 последовательности легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности DAS, и/или

- CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QQYDNLPPLT.

Предпочтительно, антитело или его функциональный эквивалент по настоящему изобретению включает CDR последовательность, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична по меньшей мере одной из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14А. Наиболее предпочтительно, антитело или его функциональный эквивалент по настоящему изобретению включает CDR последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере, одной из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14А. Особенно предпочтительное антитело AM14, описанное выше, включает CDR последовательности, которые состоят из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14А. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте по настоящему изобретению предусмотрены выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональный эквивалент, способные специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус, которые включают:

- CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность GFSFSHYA, и/или

- CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность ISYDGENT, и/или

- CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность ARDRIVDDYYYYGMDV, и/или

- CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность QDIKKY, и/или

- CDR2 последовательности легкой цепи, включающую последовательность DAS, и/или

- CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность QQYDNLPPLT.

В одном варианте предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие три CDR последовательности тяжелой цепи и три CDR последовательности легкой цепи, приведенные на Фигуре 14А, или последовательности, которые по меньшей на 70% идентичны им. Поэтому дополнительно предусмотрены выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональный эквивалент, включающие CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GFSFSHYA, и CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ISYDGENT, и CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ARDRIVDDYYYYGMDV, и CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QDIKKY, и CDR2 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности DAS, и CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности QQYDNLPPLT. Указанные антитела или их функциональные эквиваленты предпочтительно содержат CDR последовательности, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны CDR последовательностям тяжелой цепи и CDR последовательностям легкой цепи, представленным на Фигуре 14А. Также предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие вышеупомянутые CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности тяжелой цепи, приведенные на Фигуре 14А, а также вышеупомянутые CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности легкой цепи, приведенные на Фигуре 14А.

Также предусмотрены антитела или их функциональные эквиваленты, включающие тяжелые цепи, аминокислотные последовательности которых по меньшей мере на 70% идентичны последовательностям тяжелых цепей, приведенных на Фигуре 14А. Такие последовательности тяжелых цепей обеспечивают желаемое свойство связывать РСВ, о чем свидетельствует антитело AM14. Поэтому, кроме того, предусмотрены антитело или его функциональные эквиваленты, обладающие последовательностью тяжелой цепи, включающей последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYY YYGMDVWGQGATVTVSS. Кроме того, аминокислотные последовательности легкой цепи, которые по меньшей мере на 70% идентичны последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 14А, также обеспечивают желаемое свойство связывать РСВ, о чем свидетельствует антитело AM14. Поэтому также предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент с последовательностью легкой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRT V. Антитело или его функциональная часть по настоящему изобретению предпочтительно включает вариабельную последовательность тяжелой цепи и/или вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична последовательности тяжелой цепи и/или последовательности легкой цепи, приведенным на Фигуре 14А. Чем выше гомология, тем больше указанное антитело или его функциональная части напоминает антитело AM14. Антитело или его функциональная часть по настоящему изобретению предпочтительно состоит из тяжелой цепи, а также легкой цепи, которые похожи на тяжелую и легкую цепи AM14. Поэтому, кроме того, предусмотрены антитело или его функциональная часть, включающие последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи, которые по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны последовательности тяжелой цепи и последовательности легкой цепи, приведенным на Фигуре 14А.

В одном варианте предусмотрено антитело или его функциональный эквивалент, включающие последовательность тяжелой цепи, состоящую из последовательности тяжелой цепи, приведенной на Фигуре 14А, и включающие последовательность легкой цепи, состоящую из последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 14А. Кроме того, как хорошо известно специалисту в данной области, возможно создать сокращенную последовательность тяжелой цепи или легкой цепи при сохранении интересующей способности связывать антиген. Предпочтительно, создаются сокращенная тяжелая цепь или легкая цепь с сокращенным константным районом по сравнению с первоначальными тяжелой или легкой цепями. Вариабельный домен желательно сохранить. Например, получены Fab фрагмент или F(ab')₂ фрагмент на основе последовательности тяжелой цепи или последовательности легкой цепи, приведенных на Фигуре 14А. Поэтому также предусмотрен функциональный эквивалент антитела, включающий по меньшей мере функциональную часть последовательности, приведенной на Фигуре 14А. Указанная функциональная часть имеет длину не менее 20 аминокислот и включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична по меньшей мере одной из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14А.

Другое особенно предпочтительное анти-РСВ антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, обозначенное "AM16", которое обладает районом тяжелой цепи и районом легкой цепи, приведенными на Фигуре 14В. CDR последовательности AM16, которые, в частности, способствуют антигенсвязывающим свойствам AM16, также приведены на Фигуре 14В.

В настоящем изобретении предусмотрено, что CDR последовательности, приведенные на Фигуре 14В, обеспечивают желаемые характеристики связывания РСВ, и специалист в данной области способен создать варианты, включающие по меньшей мере одну измененную последовательность CDR, например, применяя консервативную замену аминокислот. Консервативная замена аминокислоты предполагает замещение одной аминокислоты другой аминокислотой в целом с аналогичными свойствами (размером, гидрофобностью, и т.д.), так что общее функционирование, вероятно, не будет серьезно затронуто.

Также возможно изменить по меньшей мере одну CDR последовательность, приведенную на Фигуре 14В, с целью получения варианта антитела, или его функционального эквивалента по меньшей мере с одним измененным свойством по сравнению с AM16. Предпочтительно, предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие последовательность CDR, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности CDR, приведенной на Фигуре 14В, так что предпочтительные характеристики связывания AM16 по меньшей мере частично сохранены и даже улучшены. CDR последовательность, приведенная на Фигуре 14В, предпочтительно изменена таким образом, что полученное антитело или функциональный эквивалент обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством, таким как, например, улучшенная аффинность связывания, избирательность и/или стабильность по сравнению с AM16. Поэтому варианты антител или их функциональные эквиваленты, включающие аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 70% идентичны последовательности CDR, приведенной на Фигуре 14В, находятся в рамках настоящего изобретения. В уровне техники доступны различные методы для изменения последовательности аминокислот. Например, последовательности тяжелой цепи или легкой цепи с желаемой последовательностью CDR искусственно синтезированы. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность CDR, мутировали, например, с использованием случайного или сайт-специфического мутагенеза.

Таким образом, в одном аспекте изобретение предусматривает выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональную часть, производное и/или его аналог, способные специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус, которые включают:

- CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GFTFSSYN, и/или

- CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ISAGSSYI, и/или

- CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности AREDYGPGNYYSPNWFDP, и/или

- CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SSNIGAGYD, и/или

- CDR2 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GNT, и/или

- CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности HSYDRSLSG.

Предпочтительно, антитело или функциональный эквивалент по настоящему изобретению включает CDR последовательность, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% идентична по меньшей мере одной из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14В. Наиболее предпочтительно, антитело или функциональный эквивалент по настоящему изобретению включает CDR последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична по меньшей мере одной из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14В. Особенно предпочтительно антитело AM16, описанное выше, включающее CDR последовательности, которые состоят из CDR последовательностей, приведенных на Фигуре 14В. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте по настоящему изобретению предусмотрено выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональный эквивалент, способные специфически связывать респираторно-синцитиальный вирус, которые включают:

- CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность GFTFSSYN, и/или

- CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность ISAGSSYI, и/или

- CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность AREDYGPGNYYSPNWFDP, и/или

- CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность SSNIGAGYD, и/или

- CDR2 последовательность легкой цепи, включающую последовательность GNT, и/или

- CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность HSYDRSLSGB.

В одном варианте предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, включающие три CDR последовательности тяжелой цепи и три CDR последовательности легкой цепи, приведенные на Фигуре 14В, или включающие последовательности, которые по меньшей мере на 70% идентичны указанным последовательностям. Поэтому, кроме того, предусмотрены выделенное, искусственное или рекомбинантное антитело или его функциональный эквивалент, включающие CDR1 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GFTFSSYN, и включающие CDR2 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности ISAGSSYI, и включающие CDR3 последовательность тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере 70% идентична последовательности AREDYGPGNYYSPNWFDP, и включающие CDR1 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SSNIGAGYD, и CDR2 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности GNT, и CDR3 последовательность легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности HSYDRSLSG. Указанное антитело или функциональный эквивалент предпочтительно содержат CDR последовательности, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны вышеупомянутым CDR последовательностям тяжелой цепи и вышеупомянутым CDR последовательностям легкой цепи, приведенным на Фигуре 14В. Также предусмотрены антитело или функциональный эквивалент, включающие вышеупомянутые CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности тяжелой цепи, приведенные на Фигуре 14В, а также вышеупомянутые CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности легкой цепи, приведенные на Фигуре 14В.

Также предусмотрены антитела или их функциональные эквиваленты, включающие аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности тяжелой цепи, приведенной на Фигуре 14В. Такие последовательности тяжелой цепи обеспечивают желаемое свойство связывать РСВ, о чем свидетельствует антитело AM16. Поэтому, кроме того, предусмотрены антитело или его функциональные эквиваленты, обладающие последовательностью тяжелой цепи, включающей последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности

EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS. Кроме того, аминокислотные последовательности легкой цепи, которые по меньшей мере на 70% идентичны последовательности легкой цепи, приведенной на Фигуре 14 В, также обеспечивают желаемое свойство связывать РСВ, о чем свидетельствует антитело АМ16. Поэтому также предусмотрены антитело или его функциональный эквивалент, обладающие последовательностью легкой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности

QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNT NRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV. Антитело или функциональная часть по настоящему изобретению предпочтительно включают вариабельную последовательность тяжелой цепи и/или вариабельную последовательность легкой цепи, которые по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%,