Интерференционный микроскоп

Интерференционный микроскоп

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к микроскопии и может быть использовано в биологии, медицине, машиностроении, оптическом приборостроении.

Известны интерференционные микроскопы, см., например, М. Франсон «Фазово-контрастный и интерференционный микроскоп», М.: Государственное издательство физико-математической литературы, 1960. Они предназначены для исследования фазовых объектов.

Фазовые объекты, прозрачные для излучения видимого оптического диапазона, широко распространены как в промышленности, так и в биологии и медицине. К ним относятся различные полимерные пленки, кристаллы, оптические микродетали, оптоволоконные изделия и, наконец, биологические объекты - клетки и др. Эти объекты описываются трехмерным (3D) пространственным распределением показателя преломления, с которым связаны плотность, температура, концентрация и другие физические параметры объекта (Ч. Вест. Голографическая интерферометрия. М.: Мир, 1982).

При изучении фазовых объектов встает задача их визуализации, так как они обычно прозрачны для зондирующего излучения. На сегодняшний день широко известны следующие методы:

- метод фазового контраста, называемый также методом Цернике, состоящий в том, что фазовый сдвиг в световом пучке, проходящем через фазовый объект, преобразуется в изменение яркости изображения (Bennett, A., Osterberg, H. Jupnik, H. and Richards, О., Phase Microscopy: Principles and Applications, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1951);

- метод интерференционного контраста, состоящий в том, что световой пучок разделяется на два пучка, один из которых проходит сквозь фазовый объект, а второй минует его; интерференция обоих пучков позволяет обнаружить и измерить оптическую разность хода, внесенную фазовым объектом (Hariharan P., Optical Interferometery 2^nd ed, Academic Press, 2003);

- метод дифференциально-интерференционного контраста (метод Номарского, DIC), состоящий в том, что поляризованный световой пучок разделяется на два ортогонально поляризованных когерентных пучка, которые проходят через фазовый объект оптическими путями различной длины, сводятся и интерферируют (Murphy, D., Differential interference contrast (DIC) microscopy and modulation contrast microscopy, in Fundamentals of Light Microscopy and Digital Imaging, Wiley-Liss, New York, 2001);

- метод темного поля, состоящий в том, что для формирования изображения фазового объекта регистрируются только световые пучки, рассеянные этим объектом (Роскин Г.И., Микроскопическая техника, М.: Изд. «Советская наука», 1946);

- метод поляризационного контраста, состоящий в том, что анизотропный фазовый объект помещается между двух поляризационных фильтров, плоскость поляризации одного из которых повернута на 90° относительно другого; через второй фильтр проходят только те световые пучки, плоскость поляризации которых оказалась повернутой фазовым объектом (Роскин Г.И., Микроскопическая техника, М.: Изд. «Советская наука», 1946).

В настоящее время при исследованиях требуется не только наблюдать и оценивать различные геометрические параметры (площадь, периметр), но и проводить измерения их локальных и интегральных характеристик.

Количественные исследования характеристик фазовых объектов можно проводить с помощью интерференционных микроскопов, основанных на методе интерференционного контраста, так как только они позволяют измерять оптическую разность хода (ОРХ). Другие методы позволяют либо визуализировать, либо измерять производную по направлению от ОРХ (метод дифференциально-интерференционного контраста). Однако широкому распространению интерференционных микроскопов препятствовало отсутствие автоматизированных методов расшифровки интерферограмм, что тормозило внедрение данных микроскопов в практику лабораторных исследований и рутинных измерений.

Ранее интерференционные микроскопы строились по двулучевым схемам интерферометров Майкельсона, Маха-Цендера (А.Н. Захарьевский, А.Ф. Кузнецова. Интерференционные биологические микроскопы. Цитология, 1961).

1. Схема деления пучков Майкельсона используется в микроинтерферометре академика В.П. Линника (1933). Микроскоп Линника позволяет работать с микрообъективами больших числовых апертур. Для исследования фазовых микрообъектов они должны размещаться на зеркале, расположенном в предметном канале. В этом случае излучение дважды проходит сквозь них (схема на отражение) (В.П. Линник. Прибор для интерференционного исследования отражающих объектов под микроскопом (“микроинтерферометр”), ДАН СССР, 1933). Для больших или плотных объектов двойной проход излучения приводит к сильной рефракции на краях объекта и невозможности реконструкции фазы в данных местах. Необходимость использования предметного стекла с зеркальным напылением также является недостатком данной схемы. Впервые автоматизированный вариант интерференционного микроскопа Линника МИИ-4 был разработан профессором В.П. Тычинским (1989) и назван «Эйрискан» (В.П. Тычинский. Компьютерный фазовый микроскоп. М.: Знание, 1989).

2. Схема деления пучков Маха-Цендера используется в микроскопе Хорна (Horn, 1950). В своем составе он имеет две идентичные ветви, в которых располагаются исследуемый препарат и препарат сравнения. Излучение проходит через исследуемый объект один раз (схема на просвет) (G.A. Dunn. Transmitted-light interference microscopy: a technique bom before its time. Proceedings of the Royal Microscopical Society, 1998). Известен также автоматизированный вариант микроскопа Хорна (Zicha и Dunn, 1995) (G.A. Dunn. Transmitted-light interference microscopy: a technique bom before its time. Proceedings of the Royal Microscopical Society, 1998). В этом микроскопе используется метод фазовых шагов (К. Creath. Phase-shifting speckle interferometry. Appl.Opt. Vol.24, №18, 1985). Дискретный фазовый сдвиг обеспечивается поперечным перемещением компенсационного клина, управляемого от шагового двигателя. Данный метод получил название DRIMAPS (Digitally Recorded Interference Microscopy with Automatic Phase Shifting - цифровая интерференционная микроскопия с автоматическим фазовым сдвигом). Схема микроскопа Хорна сложна в эксплуатации и настройке, так как требует наличия двух идентичных каналов с одинаково приготовленными препаратами: исследуемого препарата и препарата сравнения.

Основной недостаток двухлучевых схем интерференционных микроскопов состоит в необходимости использования когерентного излучения. Это ведет к большим шумам в интерферограммах и, как следствие, к повышению погрешности реконструкции фазы из интерферограмм. Разнесение в пространстве объектной и опорной ветвей ведет также к тому, что идущие в них лучи по-разному реагируют на вибрацию и температурные колебания, что сильно ухудшает виброустойчивость интерференционного микроскопа.

Современная тенденция в интерференционной микроскопии - это создание интерференционной приставки (модуля) к коммерческому микроскопу, в котором используется свет от обычной галогеновой лампы или светодиода с малой длиной когерентности. Это позволяет существенно уменьшить характерные для когерентного излучения шумы (спекл-шум и т.п.). Применение источников излучения с малой длиной когерентности ведет к необходимости использования схем интерферометров с совмещенными объектной и опорной ветвями. Такие интерферометры обычно скомпенсированы на белый свет, т.е. оптическая разность хода в центре поля зрения равна нулю.

Известен интерференционный микроскоп, описанный в работе В. Bhaduri et.al. “Diffraction phase microscopy with white light”. Optics Letters, Vol.37, No.6, PP.1094-1096, 2012. Этот интерференционный микроскоп содержит коммерческий инвертированный микроскоп светлого поля с источником света в виде галогеновой лампы для формирования увеличенного изображения объекта в выходной плоскости этого микроскопа, 4f оптическую систему из двух фурье-объективов, передняя фокальная плоскость которой совпадает с задней фокальной плоскостью микроскопа светлого поля, а в задней фокальной плоскости 4f оптической системы располагается регистратор выходного изображения. В передней фокальной плоскости 4f оптической системы размещена дифракционная решетка, которая производит множество дифракционных порядков, содержащих всю информацию об объекте. Внутри 4f оптической системы в общей фокальной плоскости (Фурье-плоскости) располагается амплитудный пространственный фильтр, состоящий из точечной диафрагмы, совмещенной с оптической осью (нулевым порядком дифракции), формирующий опорный пучок, и прямоугольной диафрагмы, полностью пропускающей излучение в первом порядке дифракции. В задней фокальной плоскости 4f оптической системы в плоскости регистратора сходятся два плоских пучка под небольшим углом и формируют интерферограмму объекта в полосах конечной ширины. Данная схема, по сути, представляет собой двухлучевой интерферометр Маха-Цендера, в котором опорный пучок формируется из излучения, прошедшего через точечную диафрагму, а второй объектный - из излучения в 1-ом порядке дифракции. Недостаток данного интерференционного микроскопа заключается в том, что объектный и опорный пучки формируются на входе в 4f систему и поэтому они проходят разные пути в свободном воздушном пространстве. Следовательно, они по-разному будут подвержены флуктуациям воздуха, что ведет к нестабильности интерференционной картины. Другой недостаток состоит в том, что для расшифровки интерференционной картины можно применять только алгоритм Фурье. Более точный метод - метод фазового сдвига - требует изменения оптической длины пути одного из плеч интерферометра, что трудно сделать в данной схеме.

Известен другой интерференционный микроскоп, описанный в работе Z. Wang et al. “Spatial light interference microscopy (SLIM)”, Optics Express, Vol.19, No.2, PP.1016-1028, 2011. Он, как и предыдущий интерференционный микроскоп, состоит из коммерческого инвертированного микроскопа, но с фазовым контрастом (Цернике) для формирования увеличенного изображения объекта в выходной плоскости этого микроскопа. Далее к микроскопу добавлен оптический модуль в виде 4f оптической системы из двух фурье-объективов, передняя фокальная плоскость которой совпадает с задней фокальной плоскостью микроскопа светлого поля, а в задней фокальной плоскости 4f оптической системы располагается регистратор выходного изображения. Внутри 4f оптической системы в общей фокальной плоскости (Фурье-плоскости) располагается не амплитудный, а фазовый пространственный фильтр, работающий на отражение. Фильтр выполнен в виде чисто фазового пространственно-временного модулятора света, управляемого от компьютера, который сдвигает фазу нерассеянного излучения, сфокусированного вблизи оптической оси, т.е. он работает как переменный фазовый фильтр Цернике. При использовании кольцевой диафрагмы в конденсоре фазовый фильтр также имеет вид кольца. Отраженный от этой части модулятора свет формирует опорный пучок. Свет, который претерпел дифракцию на объекте, отражается от остальной части модулятора и образует объектный пучок. В результате, в задней фокальной плоскости 4f оптической системы, в плоскости регистратора, сходятся два плоских пучка под нулевым углом и формируют интерферограмму, аналогичную той, которая получается при настройке интерферометра на бесконечно широкую (нулевую) полосу. Так как один из пучков света сформирован из излучения, рассеянного на объекте, то такую интерферограмму можно рассматривать как голограмму Габора. Для расшифровки интерферограммы используется четыре кадра со сдвигом фазы на π/2. Основной недостаток данного интерференционного микроскопа заключается в использовании дорогостоящего фазового пространственно-временного цифрового модулятора света. Другой недостаток связан с тем, что для получения количественной информации о фазовом объекте используется более сложная математическая процедура, чем в обычном методе фазового сдвига. В частности требуется дополнительная регистрация амплитудного изображения, сформированного из рассеянного излучения, нормированного на амплитуду нерассеянного излучения.

Известен интерференционный микроскоп, описанный в работе N.T. Shaked “Quantitative phase microscopy of biological samples using a portable interferometer”, Optics Letters, Vol.37, No.11, PP.2016-2018, 2012, наиболее близкий к предлагаемому интерференционному микроскопу.

Этот интерференционный микроскоп содержит микроскоп светлого поля для формирования увеличенного изображения объекта в задней фокальной плоскости микроскопа, 4f оптическую систему из двух фурье-объективов, передняя фокальная плоскость которой совпадает с задней фокальной плоскостью микроскопа светлого поля, а в задней фокальной плоскости 4f оптической системы располагается регистратор выходного изображения, внутри 4f оптической системы до общей фокальной плоскости располагается светоделитель, формирующий два пространственно разделенных световых пучка, каждый из которых сходится в общей фокальной плоскости 4f оптической системы, где размещены два плоских зеркала перпендикулярно оптической оси каждого из пучков, и которые отражают падающее на них излучение в обратном направлении, а перед одним из зеркал располагается точечная диафрагма, совмещенная с оптической осью, которая пропускает только нерассеянное излучение и формирует опорный пучок.

Недостатком данного микроскопа является то, что светоделительная грань светоделителя расположена под углом 45 градусов к оптической оси микроскопа, т.к. светоделитель выполнен в виде кубика (склейки из двух призм с углами 90, 45, 45 градусов). В результате светоделитель формирует два пространственно разделенных световых пучка, оптические оси которых расположены под 90 градусов. Поэтому и два плоских зеркала, отражающие падающее на них излучение в обратном направлении, расположены под углом 90 градусов друг к другу. Установить эти зеркала точно на одном расстоянии от боковых граней светоделительного кубика невозможно, это расстояние всегда будет разное, поэтому и всегда будет существовать оптическая разность хода между пучками. Для излучения с малой длиной когерентности порядка 27 мкм, которое используется в данном микроскопе, оптическую разность хода необходимо уменьшать до величины около 1 мкм, намного меньшей, чем длина когерентности, чтобы добиться хорошего контраста полос. Это достаточно трудная задача тонкой юстировки интерферометра.

Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в снижении требований к юстировке интерферометра, повышению его стабильности и, в конечном счете, к повышению точности измерений.

Решение поставленной задачи достигается посредством того, что в интерференционном микроскопе, содержащем микроскоп светлого поля для формирования увеличенного изображения объекта в задней фокальной плоскости этого микроскопа, 4f оптическую систему из двух фурье-объективов, передняя фокальная плоскость которой совпадает с задней фокальной плоскостью микроскопа светлого поля, а в задней фокальной плоскости 4f оптической системы располагается регистратор выходного изображения, внутри 4f оптической системы до общей фокальной плоскости располагается светоделитель, формирующий два пространственно разделенных световых пучка, каждый из которых сходится в общей фокальной плоскости 4f оптической системы, где размещены два плоских зеркала, перпендикулярно оптической оси каждого из пучков, которые отражают падающее на них излучение в обратном направлении, а перед одним из зеркал располагается точечная диафрагма, совмещенная с оптической осью, которая пропускает только нерассеянное излучение и формирует опорный пучок, светоделитель формирует два параллельных пространственно разделенных световых пучка с нулевой разностью хода, а отражающие поверхности плоских зеркал лежат в одной плоскости.

Снижение требований к юстировке интерферометра достигается тем, что изготовление светоделителя выполняется с высокой степенью точности (Ю.Г. Кожевников. «Оптические призмы», М.: Машиностроение, 1984).

Выравнивание отражающих поверхностей зеркал в одной плоскости достигается тем, что их установка производится на общую пластину.

Повышение стабильности интерферометра достигается тем, что светоделитель и зеркала жестко закрепляются на общем основании, в результате чего вибрация оказывает одинаковое влияние на узлы интерферометра, что не отражается на результатах измерений.

Совокупность вышеупомянутых признаков существенно упрощает юстировку интерферометра, повышает его стабильность и точность измерений.

Возможен 1-ый вариант интерференционного микроскопа, отличающийся тем, что светоделитель выполнен в виде призмы Кестерса.

Возможен 2-ой вариант интерференционного микроскопа, отличающийся тем, что светоделитель выполнен в виде склейки из двух призм Дове.

Возможен 3-ий вариант интерференционного микроскопа, отличающийся тем, что светоделитель выполнен в виде кубика, светоделительная грань которого параллельна оптической оси падающего на него пучка.

Далее предлагаемое изобретение поясняется конкретными примерами его выполнения и прилагаемыми чертежами.

Фиг.1 иллюстрирует принципиальную схему, состоящую из двух частей: коммерческого микроскопа светлого поля I и интерференционной приставки II. Микроскоп I состоит из источника частично-когерентного света 1, например светодиода; собирающего оптического элемента 2, например коллекторной линзы; элемента, ограничивающего поперечное сечение световых пучков 3, например полевой диафрагмы; элемента, формирующего точечный источник света 4, например точечной диафрагмы; оптического элемента 5, формирующего параллельный пучок излучения, например коллимационной линзы; фазового объекта 6; оптического элемента 7, например микрообъектива; светоотражательного элемента 8, например плоского зеркала; оптического элемента 9, например окулярной линзы, формирующего увеличенное изображение в задней фокальной плоскости 10 оптического элемента 9. Интерференционная приставка II включает 4f оптическую систему из оптических элементов 11 и 12, например фурье-объективы, передняя фокальная плоскость которой совмещена с задней фокальной плоскостью 10 микроскопа, а в задней фокальной плоскости 13 которой установлен регистратор 14 изображения, например ПЗС-матрица; светоделитель 15, например призму Кестерса, бипризму Дове или кубик, расположенный до общей фокальной плоскости 4f системы; два светоотражательных элемента 16 и 17, например два плоских зеркала, отражательные поверхности которых устанавливаются в общей фокальной плоскости 4f оптической системы при помощи опорной пластины 18; фильтр пространственных частот 19, например точечную диафрагму, который закрепляется на светоотражательном элементе 17; подвижный элемент 20, например пьезодвигатель, на котором закреплен светоотражательный элемент 17.

Фиг.2 иллюстрирует ход лучей в призме Кестерса и смещение одного из светоотражательных элементов по одному из вариантов осуществления данного изобретения.

Другой вариант осуществления изобретения основан на использовании призмы Дове, а именно: в качестве светоделителя используется склейка из двух призм Дове. Фиг.3 иллюстрирует ход лучей в призме Дове и смещение одного из светоотражательных элементов.

Еще один возможный вариант осуществления изобретения основан на том, что светоделитель выполнен в виде кубика, светоделительная грань которого параллельна оптической оси падающего на него светового пучка. Фиг.4 иллюстрирует ход лучей в светоделительном кубике и смещение одного из светоотражательных элементов.

Фиг.5 отображает конструктивное исполнение опорной пластины светоотражательных элементов 16 и 17.

На Фиг.1 формируется параллельный пучок частично-когерентного излучения источника 1 при помощи оптических элементов 2 и 5, между которыми расположены полевая диафрагма 3, ограничивающая поперечное сечение светового пучка, и точечная диафрагма 4, выполняющая роль точечного источника.

Параллельный пучок света проходит через фазовый объект 6, который расположен в передней фокальной плоскости оптического элемента 7, задняя фокальная плоскость которого совмещена с передней фокальной плоскостью оптического элемента 9. В задней фокальной плоскости 10 оптического элемента 9 строится увеличенное изображение фазового объекта 6. Светоотражательный элемент 8 является вспомогательным для уменьшения конструкции микроскопа.

Задняя фокальная плоскость микроскопа совмещена с передней фокальной плоскостью 4f оптической системы. В ней излучение проходит через оптический элемент 11, затем через светоделитель 15, за которым в общей фокальной плоскости формируется два одинаковых по интенсивности спектра пространственных частот.

В общей фокальной плоскости 4f системы установлены два светоотражательных элемента 16 и 17, лежащих в одной плоскости. Последнее условие выполняется при помощи опорной пластины 18, на которой установлены зеркала. Светоотражательный элемент 17 установлен на подвижном элементе 20, который смещает светоотражательный элемент на известную величину Δ, что позволяет реализовать метод интерферометрии фазовых шагов. Излучение беспрепятственно отражается от светоотражательного элемента 16 и распространяется в обратном направлении. Таким образом, формируется предметный пучок. Перед светоотражательным элементом 17 установлен фильтр пространственных частот, пропускающий только нерассеянное излучение, которое также, отражаясь, распространяется в обратном направлении. Таким образом, формируется опорный пучок. В обратном ходе отраженные лучи совмещаются в пространстве светоделителем и проходят через оптический элемент 12, который строит в задней фокальной плоскости 13 интерференционное изображение фазового объекта 6, фиксируемое регистратором 14.

Метод фазовых шагов реализуется созданием разности хода интерферирующих опорного и предметного пучков, путем смещения светоотражательного элемента 17, установленного на подвижный элемент 20, на известную величину Δ вдоль оптической оси системы.

Фиг.2 более детально показывает ход лучей в призме Кестерса и схему смещения светоотражательного элемента 17 на величину Δ при помощи подвижного элемента 20.

Фиг.3 показывает ход лучей в светоделителе, выполненном в виде склейки двух призм Дове. Схема реализации сдвига та же.

Фиг.4 показывает ход лучей в третьем варианте исполнения светоделительной призмы - кубике.

На Фиг.5 изображена плоская опорная пластина 18, реализующая установку светоотражательных элементов 16 и 17 при сборке в одной плоскости, что обеспечивает работу интерферометра в режиме полос бесконечной ширины.

Устройство работает в два этапа следующим образом.

Первый этап - это калибровка интерференционного микроскопа. Оптическая система неидеальна, вследствие чего возникают различного рода аберрации, искажающие изображение исследуемого объекта. Для устранения подобных негативных эффектов на первом этапе фиксируется изображение, формируемое оптической системой, без исследуемого фазового объекта.

Второй этап - непосредственно процесс измерений. Исследуемый фазовый объект 6 помещается в передней фокальной плоскости микроскопа. В светоделительной системе оптический путь опорного светового пучка изменяется таким образом, чтобы осуществить фазовый сдвиг π/2 (Δ=λ/4) относительно предметного пучка. Последовательное внесение известной разности хода Δ и регистрация интерференционного изображения дает пять снимков, перекрывающих полный период, соответствующий центральной длине волны светодиода. Снимки корректируются при помощи изображения, полученного на этапе калибровки, а затем выполняется реконструкция исходного изображения фазового объекта.

Помимо вышеуказанных вариантов осуществления изобретения возможны варианты осуществления, когда вместо двух плоских зеркал используется одно плоское зеркало большего размера. Возможен также вариант, когда плоские зеркала отражающими гранями опираются на одну базовую плоскость. Кроме того, для осущетсвления изобретения возможно использование схемы, когда одно из плоских зеркал закреплено на пьезоэлементе для реализации метода фазового сдвига.

Таким образом, заявленное изобретение обеспечивает решение указанных выше технических задач за счет следующих существенных признаков используемого устройства: светоделитель формирует два параллельных пространственно разделенных световых пучка с нулевой разностью хода, а рабочие поверхности светоотражательных элементов лежат в одной плоскости, что упрощает юстировку; установка светоделителя и светоотражательных элементов исключает влияние вибраций.

Хотя заявляемое в качестве изобретения устройство описано на примере ряда его конкретных вариантов осуществления, для специалистов будут ясны возможности многочисленных модификаций данного устройства, не выходящие за границы идеи и объема правовой охраны изобретения, определяемые прилагаемой формулой.

1. Интерференционный микроскоп, содержащий микроскоп светлого поля для формирования увеличенного изображения объекта в задней фокальной плоскости этого микроскопа, 4f оптическую систему из двух фурье-объективов, передняя фокальная плоскость которой совпадает с задней фокальной плоскостью микроскопа светлого поля, а в задней фокальной плоскости 4f оптической системы располагается регистратор выходного изображения, внутри 4f оптической системы до общей фокальной плоскости располагается светоделитель, формирующий два пространственно разделенных световых пучка, каждый из которых сходится в общей фокальной плоскости 4f оптической системы, где размещены два плоских зеркала перпендикулярно оптической оси каждого из пучков, которые отражают падающее на них излучение в обратном направлении, а перед одним из зеркал располагается точечная диафрагма, совмещенная с оптической осью, которая пропускает только нерассеянное излучение и формирует опорный пучок, отличающийся тем, что светоделитель формирует два параллельных пространственно разделенных световых пучка с нулевой разностью хода, а отражающие поверхности плоских зеркал лежат в одной плоскости.

2. Интерференционный микроскоп по п.1, отличающийся тем, что светоделитель выполнен в виде призмы Кестерса.

3. Интерференционный микроскоп по п.1, отличающийся тем, что светоделитель выполнен в виде склейки из двух призм Дове.

4. Интерференционный микроскоп по п.1, отличающийся тем, что светоделитель выполнен в виде кубика, светоделительная грань которого параллельна оптической оси падающего на него светового пучка.

5. Интерференционный микроскоп по п.1, отличающийся тем, что плоские зеркала отражающими гранями опираются на одну базовую плоскость.

6. Интерференционный микроскоп по п.5, отличающийся тем, что одно из плоских зеркал закреплено на пьезоэлементе для реализации метода фазового сдвига.