Устройство для анализов и способ выполнения биологических анализов

Устройство для анализов и способ выполнения биологических анализов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к технологии анализа в индустрии биологических наук и, в частности, к мультиплексированию, применяемому в диагностике, геномных исследованиях и молекулярной биологии. В изобретении используются технологии и процессы техники микрообработки, а также технологии полупроводников.

Анализы в области биологии позволяют детектировать целевую молекулу в биологическом образце. Как правило, детектирование целевых молекул осуществляется с использованием твердых поверхностей (например, микроматриц или дна лунок) или структур наноносителя или микроносителя, которые функционализируют с детектирующими молекулами (лигандами), предназначенными для связывания специфических мишеней.

Одной из задач технологии биологических анализов является ускорение массопереноса, имеющего место в течение анализа. Проблема массопереноса еще более осложнена в мультиплексных анализах, в которых ведется одновременный поиск многочисленных целевых молекул в единичном биологическом образце, так как относительный удельный вес в каждой пробе меньше, чем в единичном анализе.

Были описаны различные приспособления для преодоления ограничений массопереноса, такие как, например, выполнение мультиплексных анализов в микроканалах, тем самым снижая диффузионную длину между мишенями и пробами. Например, Дж.К.-К. Нг и др. (2007), Anal. Chem Acta 582, стр. 295-303 описывают микрожидкостное устройство, содержащее микрошарики, которые должны функционализировать с олигонуклеотидами посредством связывания биотин-стрептоавидин. Микроструйное устройство состоит из основного отделения с различными участками и с перегородкой для задержки микрошариков в структуре монослоя. Различные наборы микрошариков последовательно вводятся, с разделением нефункционализирующими спейсерными шариками. Как видно на фиг.5а документа микрошарики формируют большие группы с неопределенными границами из-за смешения частиц с частицами из спейсерного набора. Так как у шариков нет характеристик, по которым они отличаются друг от друга, таких как, например, размер, форма или код, границы различных наборов неизвестны и становятся явными только после анализа путем детектирования присутствия в образце аналита. Вследствие этого приспособление, описанное Дж.К.-К. Нг и др., не подходит для мультиплексных анализов, так как невозможно достоверно определить присутствие или отсутствие определенных мишеней в образце. Например, в отсутствие некоторых аналитов в образце, которые соответствуют последовательным наборам, не будет записан никакой сигнал во всей области микроканала.

Таким образом, будет сложно установить, скольким наборам в действительности соответствует эта область (таким образом, не будет индикации того, сколько аналитов в действительности отсутствуют). Также будет сложно или даже невозможно установить идентичность более поздних аналитов, которые реагируют с последовательными наборами, так как местонахождение последовательности этих наборов не может быть достоверно установлено.

В заявках EP 1712282A2, WO 00/061198A1 и WO 04/025560AI описываются приспособления, имеющие элементы микроносителя, помещенные внутрь микроканалов так, что их перемещение ограничено микроканалом. Анализы выполняются посредством протекания жидкостей. Этот тип приспособления эффективен для массопереноса, так как диффузионные расстояния малы и перемещение образца относительно микроносителя приводит целевые молекулы близко к рецепторным молекулам. Этот тип приспособлений также снижает стоимость посредством снижения количества требуемых реагентов.

Однако в заявках EP 1712282A2 и WO 00/061198Al порядок микроносителей в микроканале очень важен, так как он определяет идентичность микроносителей. В заявке WO 2004025560A1 микроносители закодированы так, что их порядок в микроканале не так критичен, как в заявке EP 1712282A2. Тем не менее открытие заявки WO 2004025560A1 описывает только конфигурации, в которых микроносители определенно ориентированы друг за другом для того, чтобы удовлетворять требованиям предложенного декодирующего механизма, для которого требуется специфическое расположение кодов микроносителей, чтобы сделать возможной их идентификацию.

В заявках EP 1712282A2, WO 00/061198A1 и WO 04/025560A1 описываются приспособления, которые нелегко подготовить на практике потому, что для них требуется высококонтролируемое введение микроносителей в ограниченное пространство как для контроля их порядка, так и для их выравнивания в целях декодирования. Для достижения таких конфигураций требуются специализированные методы и специфические установочные параметры, включающие в себя микроскопию, микроманипулирование (использование контролируемых на микроскопическом уровне сил) и/или технологии микрообработки.

В действительности нужно, чтобы микроносители вводились в микроканал посредством некоторого процесса, который включает в себя или сложное микроманипулирование индивидуальными микроносителями, такое как, например, описанное в заявке WO 0061198Al, или, когда не нужен контроль за точной позицией каждого микроносителя, некоторые виды вороночного механизма, которые направляют микроносители из основной массы в маленький микроканал, такой как, например, описанный в заявке WO 04/025560A1. Вороночный механизм на практике проще создавать, но он чувствителен к засорению образованием зависаний на входе в микроканал 1 (Фигуры 14 и 15). В продолжение вороночного подхода в заявке WO 04/025560A1 предполагается производство стержней для анализа многослойным подходом, где шарики помещаются на нижнюю пластину, имеющую выемку. Впоследствии верхняя пластина располагается сверху и прикрепляется к нижней пластине.

Практическим следствием сложности этапа приготовления приспособлений, описанных в предшествующем уровне техники, является то, что он снижает возможность использования для производства гибкой конфигурации для исследовательского использования лаборантом. Например, было бы крайне затруднительно позволить приготовление изготовляемой по специальным техническим требованиям конфигурации лаборанту, который хотел бы использовать собственные методики нанесения покрытия на микроносители (например, для тестирования биологических проб, находящихся в развитии) и тогда вводить их в приспособление для проведения биологических анализов.

Вследствие этого в данной области существует необходимость в устройствах для анализа и способах, которые улучшают массоперенос в биологических мультиплексных анализах, основанных на микроносителях, и упрощают общую процедуру приготовления приспособлений, осуществления биологического анализа и выполнения снятия необходимых показаний.

Таким образом, основной задачей изобретения является обеспечение устройства и способа, которые позволяют осуществить улучшенный массоперенос и упрощение процедуры подготовки и проведения биологических мультиплексных анализов, в частности, устройство и способ для мультиплексных анализов.

Настоящее изобретение обеспечивает микроканал в качестве реакционного пространства, содержащего одновременно несколько наборов закодированных микроносителей (например, микрочастицы, имеющие лиганды, прикрепленные к их поверхности) таких, что форма и размер микроносителей относительно сечения микроканала позволяют иметь по всей длине микроканала по меньшей мере два любых микроносителя, расположенных бок о бок без соприкосновения друг с другом и без соприкосновения с периметром микроканала при движении в продольном направлении канала, например при наполнении. Предпочтительно, чтобы можно было наблюдать за микроносителями внутри микроканала. Оборудование также включает в себя некоторые средства для ограничения продольного движения вышеупомянутых микроносителей в вышеупомянутом микроканале, в то время как жидкость все еще может протекать. Биологические образцы, типично содержащие одну или более целевых молекул, перемещаются через ограниченные или иммобилизованные микроносители так, что микроносители не следуют за потоком биологического образца. Движение образца относительно микроносителей приводит к близости целевых молекул с рецепторными молекулами, при этом увеличивая возможность связывания и поэтому уменьшая инкубационный период, необходимый для совершения массопереноса. Для того чтобы отличить различные наборы независимо от выполнения анализа и независимо от их расположения, микроносители закодированы так, что код указывает их функцию.

Важный аспект изобретения заключается в сравнительной форме и размере микроносителей по отношению к поперечному сечению микроканала, для того чтобы облегчить подготовку оборудования. В существующем методе, описанном в заявках EP 1712282A2, WO 00/061198Al и WO 04/025560A1, требуется точный контроль окружения микроносителей в микрожидкостном канале, который не просто выполнить, так как манипулирование объектами такого малого размера (например, в пределах микрона) не тривиально и требует специализированных способов и специфических установок, включая микроскопию, микроманипулирование (использование контролируемых на микроскопическом уровне сил) и/или технологии микрообработки.

В настоящем изобретении у микроносителей гораздо большая степень свободы перемещения внутри микроканала. Форма и размер микроносителей в изобретении такие, что, по меньшей мере, два микроносителя могут быть размещены бок о бок без соприкосновения друг с другом и без соприкосновения с периметром микроканала по всей длине микроканала, служащего в качестве реакционного пространства, и особенно на входе в него. Это означает, что микроносители, которые будут передвигаться в продольном направлении микроканала с разной скоростью будут способны пропускать друг друга до того места, где их продольное передвижение ограничено. Эта особенность является ключом к облегчению конструкции оборудования, которая особенно важна при подготовке оборудования в исследовательской обстановке непосредственно перед выполнением анализа, что позволяет гибкость приготовления смесей наборов микроносителей. Использование микроканала, который гораздо более широк по сравнению с размерами микроносителей, имеет эффект уменьшения вероятности образования нависаний на входе в микроканал, что может засорять вход. Это дополнительно позволяет использование для загрузки микроканала расширенного впускного отверстия вместо узкой воронки. Второе преимущество заключается в уменьшении возможности блокирования больших участков микроносителей, если есть препятствия внутри микроканала. В качестве препятствий могут быть нежелательные элементы, такие как, например, осколки (пыль) или воздушные пузыри в микроканале, или встроенные детали, которые обязательно необходимы для облегчения микрообработки микроструйного канала, например, опоры для обеспечения должной устойчивости микроканалов при использовании мягких полимеров, таких как, например, ПДМС.

Изобретение в дальнейшем обеспечивает способ проведения анализа, основанного на микроносителях и пригодного для мультиплексирования, содержащего этапы:

а) обеспечение оборудования для анализа, содержащего микроканал в качестве реакционного пространства и обеспечение по меньшей мере двух наборов закодированных микроносителей, при этом код микроносителей является указывающим на функцию и при этом форма и размер вышеупомянутых микроносителей по отношению к поперечному сечению микроканала позволяет иметь по всей длине микроканала по меньшей мере два любых микроносителя, расположенных бок о бок без соприкосновения друг с другом и без соприкосновения с периметром микроканала;

b) по меньшей мере, частичное наполнение вышеупомянутого микроканала, по меньшей мере, двумя вышеупомянутыми закодированными микроносителями;

c) ограничение перемещения вышеупомянутых микроносителей в продольном направлении вышеупомянутого микроканала, в то время как текучая среда все еще может протекать;

d) протекание образца, потенциально содержащего одну или более целевых молекул через вышеупомянутый микроканал, содержащий вышеупомянутые микроносители

e) идентификация наборов микроносителей и

f) детектирование реакции между лигандом и целевой молекулой и соотношение присутствия или отсутствия реакции с идентичностью специфического набора для вывода о присутствии или отсутствии целевой молекулы в образце.

В традиционных решениях, таких как, например, использование многочисленных лунок, массоперенос улучшен за счет стандартных технологий перемешивания, в соответствии с которыми образец и элементы микроносителя беспорядочно перемешиваются. В микромасштабе, где потоки - ламинарные, эта технология только минимально повышает относительное перемещение микроносителей по отношению к образцу, что является ключевым элементом для достижения эффективного массопереноса. Настоящее изобретение разъединяет перемещения образца и микроносителей. Более того, удлиненное реакционное пространство приспособления и лимитированный объем вокруг микроносителей гарантируют то, что образец проходит близко к максимальному количеству микроносителей. Полученное преимущество анализа и способа, раскрытого в данном документе, заключается в ускорении массопереноса посредством уменьшения степени использования диффузии для контакта представляющих интерес молекул с потенциальными рецепторами. Другие преимущества включают в себя простоту механизма, который основывается на свойствах микроканалов и геометрическом расположении для улучшения массопереноса. Приспособление также позволяет гибкие жидкостные манипуляции с минимумом требований для оперирования микроносителями, например, если необходимы дополнительные этапы для выполнения комплексных анализов. Если желательно перемещение жидкости вперед и назад, то необходима небольшая адаптация приспособления, например, если скорость жидкости не может достоверно контролироваться или если образец разбавлен, то может быть, таким образом, необходимо его пропускание в течение нескольких раз в контакте с микроносителями для гарантирования точного захвата представляющих интерес молекул.

Открытие пригодно для мультиплексных анализов, так как оно позволяет соединение различных функций с различными наборами микроносителей и их одновременное использование в анализе, в то время как все еще существует возможность распознавать различные реакции при условии, что реакция генерирует сигнал о том, что бок о бок локализовалось на носителе. Это осуществлено посредством работы с закодированными микроносителями, которые опознаваемы и вследствие этого определяют функцию, которую они несут.

Кроме того, микрожидкостное приспособление уменьшает количество образца, необходимое для проведения биологического анализа. Это также облегчает проведение любых необходимых дополнительных этапов анализа, позволяя пропускать дополнительные реагенты или моющие растворы через микроканал без выполнения каких-либо специфических манипуляций на микроносителях.

Изобретение также в целом упрощает манипуляции, необходимые для получения результатов анализа, по сравнению с традиционными основанными на микроносителях подходами, где микроносители должны быть собраны из реакционного пространства и внесены в считывающее устройство. Более того, при тех условиях, когда микроканал, по меньшей мере, частично прозрачный, за микроносителями можно наблюдать непосредственно внутри микроканала с помощью оптических средств для определения наборов и проведения считывания биологических показаний. Эта конфигурация также дает возможность получения кинетической информации посредством наблюдения за микроносителями, если реакция имеет место.

Кроме того, изобретение также упрощает подготовку устройства для анализа посредством облегчения манипулирования и уменьшения уровня экспертизы, необходимого для введения микроносителей в микроканал, таким образом, позволяя использование пользовательских конфигураций, которые подготовлены непосредственно перед выполнением анализа (например, в исследовательских условиях).

Изобретение главным образом может использоваться в индустрии биологических наук и, в частности, в диагностике, геномных исследованиях и молекулярной биологии.

Изобретение будет лучше понято и объекты, отличные от вышеизложенных, станут наглядными при рассмотрении дальнейшего подробного описания таковых. Такое описание ссылается на чертежи, на которых:

Фиг.1 представляет примерный вариант выполнения микроканала 1 в качестве реакционного пространства (изображен с выделением жирным цветом) с его входом 14, который соединяется с расширенным краем 6 и с впускным отверстием 5, его выход 16, который соединяется с задерживающим средством 4 (в форме фильтрующей конструкции) и со стоком 15. На Фиг.1.1 изображен вид сверху, тогда как на Фиг.1.2 показан вид поперечного сечения по линии A-A Фиг.1.1.

На Фиг.2 изображен вариант выполнения микроканала 1, имеющего вход 14 с увеличенным краем 6 и двумя впускными отверстиями 5 и 5'. На Фиг.2.1 изображен вид сверху микроканала 1 с расширенной частью 6 и двумя впускными отверстиями 5 и 5', тогда как на Фиг.2.2 показан вид поперечного сечения по линии A-A Фиг.2.1.

На Фиг.3 изображен вариант выполнения микроканала 1, имеющего вход 14 с увеличенным краем 6 и одним впускным отверстием 5 также показаны ламинарные потоки и ламинарный завихритель 8 в резервуаре 7. На Фиг.3.1 показан вид сверху микроканала 1 и его расширенной части 6 в одном из концов микроканала 1. На Фиг.3.2 изображен вид поперечного сечения по линии A-A Фиг.3.1 и показывает впускное отверстие 5 и резервуар 7, который имеет доступ к микроканалу 1 так же, как и к потоку 9, формируемому завихрителем 8.

На Фиг.4 показан вариант осуществления, где микроносители 2 имеют форму диска (то есть форму в виде пластинки с округлой передней поверхностью) и находятся в микроканале 1 с прямоугольным поперечным сечением. Микроканал 1 имеет боковые стенки 101, основание 102 и покрытие 103. Поперечное сечение микроканала 1 такое, что микроносители 2 формируют структуру монослоя и их вращательные перемещения ограничены. На Фиг.4.1 показан вид сверху, тогда как на Фиг.4.2 показан вид поперечного сечения по линии A-A Фиг.4.1. На Фиг.4.3 показано трехмерное изображение. В проиллюстрированном случае структура монослоя не находится строго в плоскости (вертикальное положение микроносителей 2 может незначительно отличаться как показано на Фигуре 4.2), но микроносители 2 не могут быть на вершине друг друга. Различные дополнительные примеры микроносителей 2 иллюстрируют различные наборы.

На Фиг.5 проиллюстрировано использование сенсора (10) регулярного типа, например, ПЗС или КМОП фотодетектор, для записи широкой области изображений структуры монослоя микроносителей 2 внутри микроструйного канала 1.

На Фиг.6 показан вариант осуществления, где микроносители 2 имеют форму диска и находятся в микроканале 1 с прямоугольным сечением. Это иллюстрирует то, как микроносители могут иметь относительно свободное движение (в двумерной плоскости в этом примере) до того, как они достигнут точки, где их продольное перемещение ограничено. Это позволяет им пропускать друг друга и снижать риск блокирования большого количества микроносителей в случае наличия препятствия. На Фиг.6.1 показан вид сверху, тогда как на фиг.6.2 показан вид сечения по линии A-A Фиг.6.1. На Фиг.6.3 показано трехмерное изображение.

На Фиг.7 показан вариант выполнения микроносителя 2, имеющего форму диска, и код в форме схемы поперечных отверстий 21 через микроноситель 2. Микроноситель 2 имеет треугольную ориентационную метку 20, которая используется для определения того, что микроноситель 2 перевернут вверх дном и также служит в качестве точки отсчета кодируемой схемы. Микроноситель 2 имеет кодирующие элементы по периметру, таким образом, оставляя значительный участок поверхности, около центра микроносителя 2, для специализированного равномерного и плоского участка, пригодного для снятия биологических показаний.

На Фиг.8 показано два изображения, полученных ПЗС камерой и иллюстрирующих снятие биологических показаний микроносителя 2 в простом мультиплексном анализе. Два набора микроносителей 2 были введены в микроканал: первый набор микроносителей 11 (кодированные одним отверстием), функционализирующие с ДНК пробой Pl (5' - CAA CCC CAG CTA ATA TTA TT - 3') и второй набор микроносителей 12 (кодированные двумя отверстиями), функционализирующие с другой ДНК пробой P2 (5' - TGG GTA AGT TAG GGC GATGG - 3'). После этого раствор, содержащий флуоресцентно меченную ДНК мишень Tl (5' Cy5 - AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG - 3'), комплементарную пробе Pl, был пропущен и только микроносители 11, функционализирующие с ДНК пробой Pl, реагировали (видно различие между яркой областью (белый свет) на Фиг.8.1 и флуоресцентный свет в Фиг.8.2).

На Фиг.9 проиллюстрировано, как может быть выполнено снятие биологических показаний, когда анализы должны обеспечивать информацию о кинетике реакции. На этой фигуре также показано, что устройство очень эффективно относительно массопереноса, так как возможно детектировать реакции гибридизации в течение нескольких секунд (выполнено при концентрации мишеней 200 нмоль). Это изображение было получено ПЗС камерой при флуоресцентном свете.

На Фиг.10 показан вариант осуществления, где маркированные микроносители 2, имеющие форму диска (как это описано выше для Фиг.7), находятся внутри микроканала 1 с прямоугольным поперечным сечением. Поперечное сечение микроканала 1 такое, что микроносители 2 формируют структуру монослоя (они не могут быть на вершине друг друга), и их вращательное перемещение ограничено так, что они располагаются главным образом ровно внутри микроканала.

На Фиг.11 проиллюстрирована микрохема 13 для мультиплексирования. Указанная микросхема содержит несколько микроканалов 1, содержащих несколько наборов функционализирующих микроносителей 2. Микроканалы 1 соединяются с впускным отверстием 5 и стоком 15. Микроносители 2 имеют форму диска и закодированы (как это описано выше для Фиг.10).

На Фиг.12 проиллюстрированы различные примеры микрочастиц в форме пластины. Передняя поверхность имеет форму диска (слева), квадрата (середина) или шестиугольника (справа).

На Фиг.13 показан вариант осуществления, где микроносители 2 имеют форму диска и закодированы комбинацией поперечных отверстий 21 и Г-образной ориентационной меткой 20. На Фиг.13.1 показана яркая область (белый свет) изображения микроносителей. На Фиг.13.2 показано флуоресцентное изображение, которое демонстрирует микроносители, которые прореагировали после протекания образца 9. Оба изображения были получены после протекания образца 9.

На Фиг.14 показано, как могут формироваться зависания в воронке, которая направляет микроносители 2 в узкий микроканал 1 и тем самым засоряет вход 14 микроканала 1.

На Фиг.15 показано изображение зависания микроносителей 2, сформированной в ворончатой конструкции, что засоряет вход микроканала 1.

На Фиг.16 изображены различные нелимитирующие примеры форм, являющихся прямоугольными или “близкими к прямоугольным”. Они иллюстрируют предпочитаемые поперечные сечения микроканалов 1 или микроносителей 2, когда они в форме пластины.

На Фиг.17 показано два изображения примерного варианта осуществления. Микросхема 13, изготовленная с использованием технологии формования ПДМС и соединенная с предметным стеклом микроскопа (как описано в Fundamentals and Applications of Microfluidics by Nam-Trung Nguyen and Steve Wereley [Основы и приложения микрогидродинамики], ISBN: 9781580533430, глава 3), содержит микроканал 1, который соединяется с впускным отверстием 5 и, с другой стороны, со стоком 15. Задерживающее устройство 4, состоящее из фильтрующей конструкции, сделанной из прямоугольных опор, встроено в выход из микроканала 1. Кроме того, цилиндрические опоры 17 встроены в микроканал 1 для стабилизации высоты микроканала (то есть для избежания его сжатия) при применении давления ниже атмосферного.

На Фиг.18 показано изображение пластины, содержащей кремниевые микрочастицы, которые еще не высвобождены. Микрочастицы имеют дископодобную форму и закодированы комбинацией поперечных отверстий 21. Микрочастицы имеют диаметр 50 микрон и включают в себя Г-образную ориентационную метку 20.

Способы выполнения изобретения

В рамках настоящего изобретения используются следующие определения:

'Мультиплексирование' относится к совмещенному выполнению ряда анализов, как правило, на большое количество соединений и молекул, с возможностью различать результаты каждого анализа индивидуально. Эти анализы могут, например, быть биологической и/или химической природы и, как правило, включают в себя некоторые целевые молекулы, которые должны быть обнаружены, и некоторые фиксирующие молекулы, которые должны служить в качестве агентов для детектирования тех целевых молекул. Упомянутые фиксирующие молекулы, как правило, присоединены в качестве лигандов на субстрате носителя. На количество совмещенных анализов, проводимых в мультиплексных анализах, обычно ссылаются как на “уровень” мультиплексирования, и он может изменяться в пределах от незначительных (2 или 3) до нескольких сотен или тысяч для высших уровней мультиплексирования. Последние обычно гибридизационные анализы на нуклеиновые кислоты, как правило, проводятся на сегодняшний день на микроматрицах, но они могут быть выполнены с помощью устройства, раскрытого в настоящем документе.

'Одиночный анализ' относится к проведению одиночного анализа, в котором только одна целевая молекула определяется детектированием одной фиксирующей молекулой.

'Реакционное пространство' относится к пространству, где имеет место биологическая и химическая реакция между целевой молекулой и фиксирующей молекулой или лигандом.

'Микроканал' или 'микрожидкостной канал' относится к закрытому каналу, то есть вытянутому проходу для жидкостей, с поперечным сечением микроскопического размера, то есть с наибольшим размером (поперечного сечения), как правило, от 1 до 500 микрометров, предпочтительно от 10 до 500 микрометров, более предпочтительно от 20 до 300 микрометров, еще более предпочтительно от 30 до 300 микрометров. Микроканал имеет продольное направление, которое необязательно является прямой линией и которое соответствует направлению, в котором направлена жидкость внутри микроканала, то есть по существу по направлению, соответствующему направлению добавления векторов скорости жидкости, проходящей в микроканале, при ламинарном режиме потока. Микроканал имеет с одного конца вход 14 и с другого конца выход 16, которые являются отверстиями микроканала, которые, например, позволяют жидкостям соответственно проникать в микроканал и покидать микроканал. Сечение микроканала обычно постоянно по большей части длины, но это сечение может варьироваться и может, как правило, увеличиваться по крайней мере рядом с входом 14 или рядом с выходом 16, для того чтобы соединить их с впускным отверстием 5, и со стоком 15, с одним или более микроканалов или с другим микрожидкостным компонентом (таким как, например, клапанный механизм). Микроканал может продолжаться так, что граница, образованная продольным направлением, имеет любую форму и длину и может продолжаться в пространстве (то есть линия, образованная продолжением в продольном направлении, не лежит в плоскости).

При ссылке на 'сечение' подразумевается перпендикулярное продольной оси сечение.

Термин “периметр” относится к внутреннему периметру микроканала или окружности сечения.

'Функционализирующий' относится к частице или микрочастице, имеющей один или более, но предпочтительно один, лиганд, прикрепленный к их поверхности, который может служить в качестве фиксирующей или рецепторной молекулы для данной целевой молекулы (аналита). Термин 'молекула' должен пониматься в широком смысле и может включать в себя некоторые молекулы, частицы или клетки. Например, целевая 'молекула' может быть вирусной частицей и/или фиксирующая 'молекула' (лиганд) может быть группой антиген-связывающих фрагментов. В другом примере целевая 'молекула' может быть нуклеиновой кислотой, такой как, например, ДНК, РНК или фрагмент одноцепочечной ДНК, а фиксирующая 'молекула' - другой нуклеиновой кислотой, такой как, например, ДНК, РНК или фрагмент одноцепочечной ДНК, разработанной для гибридизации с первой нуклеиновой кислотой. Может быть, также необходимо несколько различных фиксирующих молекул для специфического фиксирования одной целевой молекулы. В рамках настоящего изобретения упомянутые примеры будут относиться к категориям 'фиксирующая молекула' или 'целевая молекула', соответственно. Лиганды и целевые молекулы могут быть натуральными, синтетическими или полусинтетическими.

Термин 'функция' относится к способности связывать и/или реагировать с данной целевой молекулой и, следовательно, относится к наличию специфического лиганда.

Термин 'лиганд', 'фиксирующая молекула' и 'рецепторная молекула' используются в данном документе синонимично. То же самое относится к терминам 'целевая молекула' и 'аналит', несмотря на то, что аналит может содержать несколько целевых молекул.

'Микрочастицы' относится к любому типу частиц микроскопического размере, как правило, с наибольшим и размером от 100 нм до 300 мкм, предпочтительно от 1 мкм до 200 мкм.

'Микроносители' в используемом в настоящем документе значении являются микрочастицами, которые функционализируют для исследования и/или взаимодействия с аналитом в образце. Термин 'функционализирующий микроноситель' используется в настоящем документе синонимично. При описании аспектов, которые не привязаны к их функции, такие как, например, геометрические аспекты или аспекты микротехнологии, 'Микроносители' и 'Микрочастицы' могут рассматриваться в настоящем документе эквивалентно.

'Набор' или 'набор микроносителей' относится к одному или более микроносителей с одинаковой функционализацией. Набор может быть только одним или более чем одним микроносителем. Микроносители одного набора могут нести более одной фиксирующей молекулы для того, чтобы фиксировать две или более целевые молекулы, но это все равно считается носителем с одной функцией. Два различных микроносителя, которые отличимы друг от друга, могут иметь одинаковую функционализацию.

Термин 'снятие биологических показаний' относится к детектированию того, связался или прореагировал лиганд, присоединенный к микроносителю, с целевым аналитом. Снятие биологических показаний может также обеспечивать количественной информацией, которая указывает на количество целевого аналита, который прореагировал.

'Код' в используемом в настоящем документе является атрибутом или характеристикой микрочастицы или микроносителя, которые различимы при наблюдении или считывании и которые используются для идентифицирования микрочастиц или микроносителя или для объединения микрочастиц микроносителя в специфическую совокупность (например, совокупность микроносителей, имеющих заданную функцию). Код на микроносителя может быть определен независимо от его расположения и независимо от выполнения анализа, то есть не требует присутствия целевого аналита, который должен быть выявлен. Как правило, код характеризуется оптическим или магнитным откликом микрочастиц или микронасителя при наблюдении. Этот отклик должен быть определен для микрочастицы или микроносителя как целый (например, цвет микроносителя) или должен быть пространственно модулирован в или на микрочастице или микроносителе с результатом в виде характерной схемы (например, штрихкод, полученный посредством модуляции цвета микроносителя). Примеры кодов включают в себя, но не лимитированы цветом, формой, размером, маркированными или с неправильными выемками на поверхности образцами, конфигурацией отверстий, голографическими структурами, магнитными характеристиками, химической композицией, модификацией светопередачи или характеристиками отражения, точечной квантовой эмиссией или отличительными детектируемыми инородными объектами (например, олигонуклеотидами и другими полимерами), прикрепленными к поверхности.

Термины 'закодированные микроносители' и 'закодированные микрочастицы' относятся здесь, соответственно, к микроносителям и к микрочастицам, которые имеют код. Микроносители настоящего изобретения индивидуально закодированы, то есть каждый микроноситель несет свой собственный код, даже если несколько микроносителей (как правило, микроносители одного набора) могут нести код с одним и тем же значением (то есть микроносители не различимы на основании только их кода). Различные наборы закодированных микроносителей настоящего изобретения могут быть различимы и/или идентифицированы независимо от расположения микроносителей в микроканале и независимо от выполнения анализа.

Расположенные 'бок о бок' или стоящие 'бок о бок' в используемом в настоящем документе значении относится к геометрическому свойству, которое соотносит геометрию двух или более частиц с геометрией микроканала. Об одной или более микрочастиц говорят, что они расположены 'бок о бок' в установленном положении в микроканале, когда они (i) находятся в такой конфигурации, что две или более микрочастиц помещаются внутри микроканала, и (ii) пересекают сечение в этом установленном положении, и (iii) их защищенные поверхности в продольном направлении (в этом установленном положении) не перекрываются и ограничены поверхностью сечения (в этом установленном положении). В общем, в микроканале, который не имеет постоянного поперечного сечения по всей своей длине, возможно, что одна или более микрочастиц могут быть расположены 'бок о бок' в некоторых положениях, но не в других положениях (несмотря на то, что это основное правило не применяется к микроканалу 1 настоящего изобретения, в котором требуется возможность расположения бок о бок по всей его длине). В зависимости от геометрии микрочастиц возможно, что две или более микрочастиц могут стоять бок о бок в установленном положении в микроканале, только когда они в определенных ориентациях. При положении бок о бок микрочастицы могут контактировать друг с другом или иметь расстояние между ними.

“Форма пластины” относится здесь к особой форме микрочастицы, где высота заметно меньше (например по меньшей мере в два раза), чем как ширина, так и длина, и тому, что микрочастица имеет две главным образом параллельные и главным образом плоские поверхности (передние поверхности) на вершине и дне (Фиг.12). “Дископодобная” форма относится к форме в виде пластины с круглой передней поверхностью.

Микроканал

Микроканал 1 настоящего изобретения предпочтительно не изогнут, то есть продольное направление продолжается по прямой линии, но может также иметь извилистый контур, то есть продольное направление продолжается с образованием линии с параллельными траекториями, соединенными дугами, для лимитирования занимаемой площади. Микроканал 1 предпочтительно в основном планарный, но может также распространяться трехмерно.

Длина микрожидкостного канала 1 может варьироваться в зависимости от его поперечного сечения и желаемого контура, обычно для того, чтобы уместить в него микрожидкостной микроноситель 13, который он обычно содержит. Типично, она будет изменяться в пределах от 1 мм до 500 см, предпочтительно от 5 мм до 200 см. Например, микроканал 1 с извилистым контуром и имеющий маленькое поперечное сечение (например, менее 100 микрон), может достигать относительно большой длины, такой как, например, сотни сантиметров в относительно малой занимаемой площади (несколько квадратных сантиметров). Например, в одном в квадратном сантиметре возможно уместить извилистый микроканал длиной 100 см, который имеет сечение 50 мкм (предполагая, что половина поверхности занята микроканалом 1 и другая половина свободна). В наиболее предпочтительном варианте выполнения микроканал 1 главным образом прямой и имеет длину от 2 мм до 10 мм, ширину от 200 микрон до 600 мм и высоту от 10 микрон до 20 микрон.

Микроканал 1 изобретения имеет вход 14 и выход 16, которые позволяют жидкостям 9 соответственно проникать в микроканал 1 и выходить из него. Вход 14 также используется для введения микр