Флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование

Флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к дефицитным по репликации флавивирусам и описывает их использование в качестве вакцины против заболеваний, ассоциированных с флавивирусами.

Описание достигнутого уровня

Род Favivirus из семейства Flaviviridae включает множество важных патогенов человека и животных, в число которых входят вирусы желтой лихорадки, клещевого энцефалита, японского энцефалита, лихорадки Денге, лихорадки Западного Нила, классической свиной лихорадки, коровьей вирусной диареи и вирус гепатита С. В природных условиях флавивирусы циркулируют между позвоночными животным, в качестве своих хозяев, и векторами членистоногих, в основном представленными множеством комаров или москитов и различных видов клещей. Почти сорок представителей этого рода, сгруппированных, в рамках используемой классификации, в четыре разных антигенных комплекса, способны вызывать заболевания человека.

Геном флавивируса представлен одноцепочечной РНК размером примерно 12 кбайт с положительной полярностью. Указанный геном кодирует один полипептид, которые подвергается процессингу в ходе трансляции и после трансляции клеточными и вирусными протеазами с образованием структурных белков вирусов, C, prM/M и E, которые формируют инфекционные вирусные частицы, а также неструктурных белков NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5, которые формируют ферментативный комплекс, необходимый для репликации вирусного генома (Lindenbach and Rice, 2001). Геном флавивируса имитирует структуру клеточных матричных РНК за счет наличия 5'-метилгуанилатного колпачка, который при этом отличается от клеточных матричных РНК отсутствием 3'-концевой поли(А) последовательности.

В вирионах флавивирусов единичная копия вирусной геномной РНК упакована за счет С (капсидного) белка в нуклеокапсид, окруженный липидной оболочкой с встроенными в нее димерами Е и М белка. Механизм взаимодействия между нуклеокапсидом и оболочкой в настоящее время не совсем понятен, но, по всей видимости, он менее специфичен, чем, например, взаимодействие между нуклеокапсидом и оболочкой у альфа-вируса, так что вирионы флавивирусов могут быть эффективно образованы капсидными и оболочечными белками, полученными на основе вирусов, которые принадлежат к разным антигенным комплексам (Chambers et al., 1999; Lorenz et al., 2002; Monath et al., 2002). Кроме того, наличие нуклеокапсида не является абсолютным требованием для сборки частиц, и образование вирусоподобных частиц и высвобождение их из клеток могут быть достигнуты при экспрессии только prM и E из большого множества векторов. Образуемые при этом так называемые субвирусные частицы (SVP) не содержат РНК или капсидный белок (Mason et al., 1991), но включают белки оболочки, организованные в виде двадцатигранных структур, содержащих липид. Указанные prM/E-встроенные субвирусные частицы способны индуцировать эффективный иммунный ответ, который защищает животных от последующей инфекции компетентными по репликации вирусами (Konishi and Fujii.2002; Konishi, Fujii, and Mason, 2001; Konishi et al., 1992; Qiao et al., 2004), DNA (Aberle et al., 1999; Colombage et al., 1998; Davis et al., 2001; Kochel et al., 1997; Kochel et al., 2000; Konishi et al., 2000a; Konishi et al., 2000b; Phillpotts, Venugopal, and Brooks, 1996; Schmaljohn et al., 1997). Отсутствие компетентной по репликации РНК, упакованной в нуклеокапсид, делает применение субвирусных структур очень привлекательным инструментом, в качестве потенциальных вакцин, но вызывает необходимость разработки новых способов их крупномасштабной продукции или доставки конструкций экспрессии. Такие prM/E-экспрессирующие кассеты могут быть разработаны на основе вирусных и невирусных векторов. В случае вирусных векторов, имеется проблема, связанная либо с развитием, либо с существованием иммунного ответа на используемый вирусный вектор. Кассеты на основе ДНК, кодирующие указанные гены под контролем эффективных промоторов на основе РНК-полимеразы II, по всей видимости, могут быть наиболее предпочтительными. Однако их применение в клинической практике остается все еще под вопросом. В этой связи вакцинация против флавивирусов все еще достигается в основном за счет использования либо инактивированных, либо живых ослабленных вакцин (INV и LAV соответственно).

Результаты проведенных в последнее время исследований дают основание полагать, что структурные белки флавивируса не являются обязательными компонентами для репликации геномной РНК. Они могут быть, полностью или частично, делетированы, и тем не менее такие РНК (репликоны) сохраняют способность к саморепликации и экспрессии не только неструктурных, но также оставшихся структурных и/или дополнительных гетерологичных генов. Так, например, были синтезированы in vitro флавивирусные геномы, не содержащие функциональный капсидный ген, но включающие другие интактные структурные гены, и далее использованы непосредственно для иммунизации. Их репликация приводила к образованию субвирусных частиц и в конечном итоге индуцировала защитную иммунную реакцию. Применение модифицированных флавивирусов, которые не способны к развитию продуктивной распространяющейся инфекции, представляет собой новый путь к разработке безопасных и эффективных, с точки зрения создания защитного иммунитета, вакцин (Aberle et al., 2005; Kofler et al., 2004). Однако для их применения необходимо будет, по всей видимости, усовершенствовать систему доставки синтезированных in vitro РНК в клетки, чувствительные к репликации РНК. Это может быть достигнуто при использовании наиболее близких к природным механизмов доставки за счет упаковки таких дефектных геномов в инфицирующие частицы, состоящие из структурных белков вируса.

Несмотря на растущую угрозу распространения ассоциированных с флавивирусом заболеваний и продолжающееся распространение вирусов на новые зоны, антивирусные терапевтические средства не были разработаны даже для таких инфекций, и к настоящему времени создано очень ограниченное число разрешенных к применению вакцин. Инактивированные вирусные вакцины (INV) были разрешены для применения с целью профилактики клещевого энцефалита (TBEV) и японского энцефалита (JEV). Однако, как и в случае других инактивированных вирусных вакцин, указанные вакцины обладают ограниченной активностью, требуют проведения множественных вакцинаций и являются дорогостоящими при их производстве. Несмотря на указанные недостатки, инактивированные вирусные вакцины против японского энцефалита и клещевого энцефалита подтвердили хорошие показатели безопасности, и было показано, что они не ассоциированы с развитием какого-либо заболевания. Единственной разрешенной вакциной с живым ослабленным вирусом (LAV) для флавивируса является широко используемая вакцина на основе штамма 17D вируса желтой лихорадки (YFV), которая была получена при серийном пассировании вируса желтой лихорадки, штамма дикого типа Asibi в тканях куриного эмбриона. Хотя такая живая ослабленная вакцина рассматривается как весьма безопасная и эффективная, были зарегистрированы случаи развития желтой лихорадки и неблагоприятных эффектов при использовании таких вакцин, включая недавно зарегистрированный случай среди военного контингента США.

Разработка систем реверсивной генетики в применении к флавивирусам открыла возможность создания новых типов живой ослабленной вакцины на основе рациональной аттенюации таких вирусов. Указанный новый класс вакцин включает гибридные формы на основе YFV 17D, в которых prM-E кодирующий фрагмент генома вируса желтой лихорадки был замещен prM-E-кассетой, полученной из гетерологичных флавивирусов. Аналогичный подход, построенный на основе гибридных вирусов, был применен для вариантов на основе вирусов лихорадки Денге и клещевого энцефалита. В большинстве случаев, гибридные флавивирусы демонстрируют высокоаттенюированный фенотип, но тем не менее они способны вызывать эффективный защитный иммунный ответ и выполнять функцию защиты против последующей инфекции теми вирусами, структурные белки которых экспрессируются данными гидридами. Вакцинация такими предполагаемыми химерными вакцинами не затрагивается ранее существовавшим «векторным» иммунитетом, на который оказывает влияние активность рекомбинантных вирусных вакцин, полученных на основе других вирусных векторов.

Несмотря на то что гибридные флавивирусы обеспечивают, по всей видимости, достаточно универсальный подход для получения новых вакцин, имеется вполне обоснованная озабоченность, связанная с тем, что гибридные формы сами по себе будут обладать патогенностью, по меньшей мере в случае индивидуумов со сниженным иммунитетом, или в связи с тем, что могут возникать патогенные гибридные формы, поскольку были обнаружены мутации в процессе размножения тех вирусов, которые будут необходимы для получения вакцин.

Таким образом, недостатком, свойственным достигнутому уровню в данной области, является отсутствие безопасных, активных и эффективных вакцин, которые бы можно было использовать против возбудителей рода Flavivirus. Настоящее изобретение относится к решению проблемы, определяемой этой длительно существующей потребностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте, настоящее изобретение относится к флавивирусу с двухкомпонентным геномом. Такой флавивирус включает псевдоинфицирующий вирусный геном, кодирующий цис-промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, вовлекаемый в создание белков оболочки и полного набора неструктурных белков флавивируса и не кодирующий капсидный белок флавивируса. Дополнительно, указанный вирус включает комплементирующий геном, который кодирует цис-промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, создания капсидного белка и полного набора неструктурных белков флавивируса, и не кодирует белки оболочки флавивируса.

В другом родственном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматривается клеточная культуральная система, инфицированная описанным выше флавивирусом с двухкомпонентным геномом.

В еще одном родственном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу крупномасштабного размножения флавивируса с двухкомпонентным геномом. Такой способ включает инфицирование клеточной культуральной системы описанным выше флавивирусом с двухкомпонентным геномом, который эффективен в направлении достижения репликации обоих геномов в одной клетке, с высвобождением двухкомпонентного флавивируса, что приводит к крупномасштабному размножению флавивируса с двухкомпонентным геномом.

В другом родственном аспекте своего осуществления, настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей описанный выше флавивирус с двухкомпонентным геномом, адъювант, фармацевтически приемлемый носитель или их сочетания.

В еще одном родственном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу защиты субъекта от инфекций, возникающих при воздействии флавивируса. Такой способ включает введение иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, описанной выше, субъекту, где указанная композиция создает иммунный ответ против флавивируса у данного субъекта, что приводит к защите такого субъекта от инфекций, связанных с воздействием флавивируса.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A-1C показана упаковка дефектных по кодированию капсида и prM/E геномов YFV с образование инфицирующих вирусных частиц. На фиг.А представлена схема, изображающая 5'-концевые последовательностей в YFV геномах, дефицитных по репликации. Положение сигнальных пептидов и трансмембранных доменов показано в виде зачерненных прямоугольников. На фиг.1В проиллюстрировано высвобождение вирусных частиц, содержащих дефектных геном, из клеток, подвергнутых совместной трансфекции синтезированными in vitro РНК. Среды заменяют в указанные временные точки и определяют титры по описанной методике.

На фиг.2A-2B проиллюстрирована репликация YFV с дуплицированной капсид-специфичной последовательностью. На фиг.2A приведена схематическая иллюстрация рекомбинантных YFV геномов. Оптимизированные по кодонам последовательности, кодирующие капсид, показаны серым цветом. Альтернативная открытая рамка считывания в капсидном YF/Cfrs/GFP/C геноме, которая является результатом введения двух мутаций, приводящих к сдвигу в рамке считывания, показана в виде зачерненного прямоугольника. Титры и развитие CPE оценивают через 72 часа после трансфекции с использованием синтезированных in vitro РНК. На фиг.2B проиллюстрированы результаты анализа высвобожденных рекомбинантных вирусов. Синтезированные in vitro РНК трансфицируют в клетки. Среды заменяют в указанные временные точки и вирусные титры определяют по процедуре анализа бляшкообразования.

На фиг.3A-3B продемонстрирован процесс выбора вариантов, содержащих YF/C/GFP/C геном, которые способны к эффективной репликации, и идентификации адаптивных мутаций. На фиг.3А приведено схематическое изображение генома YF/C/GFP/C и делеций, идентифицированных у эффективно реплицирующихся вариантов. Цифры указывают положения делеций в аминокислотной последовательности капсида и GFP белков. На фиг.3B проиллюстрирована репликация реконструированных мутантов с делецией в BHK-21 клетках. Синтезированные in vitro РНК трансфицируют в клетки и среды заменяют в указанные временные точки. Определяют титры высвобожденных вирусов по методу анализа бляшкообразования согласно настоящему описанию. Пунктирная линия указывает на предел обнаружения.

На фиг 4A-4C проиллюстрирована репликация рекомбинантных YFV геномов, кодирующих гетерологичный ген против направления считывания полипротеина. На фиг.4A продемонстрирована схема, изображающая рекомбинантный геном и последовательность открытых рамок считывания, расположенных против направления считывания информации GFP гена. Оптимизированная по кодонам последовательность, кодирующая капсид, показана серым цветом. Стрелки указывают старт GFP-кодирующей последовательности. Прописные буквы указывают мутации, введенные в капсидную и GFP последовательности. На фиг.4B проиллюстрирована репликация созданных YFV вариантов в BHK-21 клетках. Синтезированные in vitro РНК трансфицируют в клетки и среды заменяют в указанные временные точки. Определяют титры высвобожденных вирусов по методу анализа бляшкообразования, приведенному в настоящем описании. Пунктирная линия указывает на предел обнаружения. На фиг.4C показаны титры рекомбинантного YF_mut/GFP вируса после серийного пассирования в BHK-21 клетках.

На фиг.5A-5F проиллюстрированы результаты анализа репликации вируса с двухкомпонентным геномом. На фиг.5A приведена схема, изображающая геномы, кодирующие капсид и prM/E YFV, которые способны к транскомплементации при репликации в одной клетке. Оптимизированный по кодонам ген, кодирующий капсид, показан серым цветом. На фиг.5B продемонстрировано высвобождение вирусных частиц, содержащих дефектный геном, из клеток, в которые были трансфицированы синтезированные in vitro РНК. Среды заменяли в указанные временные точки и определяли титры инфекционных вирусных частиц, содержащих каждый из описанных геномов. На фиг.5C проиллюстрирована репликация двухкомпонентного генома YFV при пассировании с множественностью инфекции, равной ~10 инфицирующих единиц/клетку. Среды заменяют в указанные временные точки и определяют титры высвобожденных инфекционных частиц, содержащих каждый из определенных в настоящем описании геномов. На фиг.5D проиллюстрирована репликация двухкомпонентного генома YFV после инфицирования клеток с различными показателями множественности заражения. Среды заменяют в указанные временные точки и определяют титры высвобожденных инфекционных частиц по приведенной методике. На фиг.5E проиллюстрирована репликация обоих дефектных геномов в инфицированных клетках. Клетки BHK-21 инфицировали двухкомпонентным геномом YFV с множественностью заражения, равной ~1 инфицирующая единица/клетку, и оценивали репликацию геномов через 48 часов после инфекции. На панели (а) изображены клетки, содержащие реплицирующиеся YF/Cherry/Cco; на панели (b) показаны клетки с реплицирующимся геномом YF/GFP/prME, и на панели (c) приведено их наложение. На фиг.5F показаны результаты анализа высвобождения инфекционного вируса и VLP из клеток, трансфицированных разными YFV-специфическими РНК. Клетки BHK-21 трансфицировали указанными РНК. Через 24 часа после инфекции среды заменяли бессывороточной средой и через 24 часа собирали полученные клетки. Частицы собирают ультрацентрифугированием и далее анализировали в непрерывном градиенте сахарозы, как будет описано ниже. Наличие YFV-специфичных белков во фракциях выявляли по методу вестерн-блоттинга с использованием D1-4G2 MAB, которые распознают вирусный белок E.

На фиг.6A-6C проиллюстрирована упаковка YFV репликона, утратившего все структурные гены, в линии пакующих клеток. На фиг.6A приведена схематическая иллюстрация YFV репликона, кодирующего флуоресцентный маркер и Cherry вместо структурных белков. На фиг.6B приведена схематическая иллюстрация ранее описанного VEE репликона, кодирующего C-prM-E и его новую версию. Показаны титры упакованных Yfrep/Cherry в созданных пакующих клеточных линиях с использованием обоих репликонов VEEV. На фиг.6C проиллюстрировано высвобождение инфекционных вирусных частиц, содержащих геном Yfrep/Cherry, из клеток, содержащих VEErep/GFP-C-prM-E/Pac, при наличии в них указанного YF репликона или при инфицировании теми же частицами на следующем пассаже. Среды заменяли в указанные временные точки и определяли титры высвобожденных упакованных репликонов, как приведено в настоящем описании.

На фиг.7 показаны предполагаемые стратегии для достижения репликации вируса с двухкомпонентным геномом в случае высокой и низкой множественности заражения. При высокой множественности заражения оба генома, геном PIV (кодирующий prM/E) и комплементарный геном (кодирующий капсид), доставляются в одну и ту же клетку и продуцируют полный набор белков, необходимых для репликации вируса. Клетки продуцируют вирус с двухкомпонентным геномом, который далее подвергали пассажам в возрастающем порядке. При низкой множественности заражения клетки получали только один из двух геномов, и те, которые были инфицированы PIV, создают SVP, не содержащие генетический материал и нуклеокапсид.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка нового типа флавивируса, дефицитного по репликации, который мог бы использоваться в качестве профилактической вакцины против заболеваний, ассоциированных с флавивирусами. В этой связи настоящее изобретение относится к флавивирусу с двухкомпонентным геномом, например, описывает вирус желтой лихорадки (YFV), где геном флавивируса разделен на два генома. При этом оба генома являются дефицитными по экспрессии по меньшей мере одного из белков, необходимых для продуктивной репликации (капсид или prM/E), но способны к комплементации функций друг друга при доставке в одну и ту же клетку. Такие дефектные по репликации флавивирусы, в случае их продукции в промышленных масштабах, могли бы далее найти применения в качестве вакцин против инфекций, вызванных флавивирусами, поскольку являются инфекционными и способны осуществлять единичный цикл инфекции при инфицировании животных. У таких животных клетки, инфицированные частицами, которые содержат только один из геномов, продуцируют вирусные неструктурные белки и неполный набор структурных белков. Синтезированные prM/E белки образуют только субвирусные частицы, которые не содержат генетический материал, но функционируют как эффективные иммуногены. Таким образом, указанные дефектные флавивирусы могут быть объединены с инактивированными вакцинами, преимуществом которых является их безопасность, а также с живыми ослабленными вакцинами, которые характеризуются эффективностью и поддаются масштабированию. Дополнительно, такие дефектные флавивирусы способны не только к продукции SVP, но также к экспрессии гетерологичных белков.

В настоящее время флавивирусы остаются одной из наиболее серьезных проблем общественного здравоохранения. Они широко распространены в обоих полушариях земного шара и вызывают множество заболеваний человека. При этом безопасные и эффективные вакцины производятся против сотен флавивирусных инфекций. Вакцины могут быть охарактеризованы как живые ослабленные или инактивированные. Единственная широко распространенная разрешенная живая ослабленная вакцина против флавивируса создана на основе вируса желтой лихорадки, штамм 17D, которая была получена при серийном пассировании штамма вируса желтой лихорадки дикого типа Asibi в тканях куриных эмбрионов. Живые ослабленные вакцины были получены против JEV, TBEV и YFV, но не были получены разрешенные продукты против других флавивирусов, таких как вирус лихорадки Денге и WNE. Живые вакцины, по всей видимости, являются более эффективными продуктами, чем вакцины на основе инактивированных вирусов или субъединичные вакцины. Однако очевидные проблемы безопасности продолжают оставаться актуальными из-за возможности реверсии в патогенный фенотип. Применение инактивированных вакцин обычно требует проведения множественных вакцинаций и получения больших количеств материала, а также наличия сложно оборудованных систем для размножения вирулентных вирусов, используемых для создания инактивированных продуктов. Таким образом, несмотря на наличие перспективных вариантов получения флавивирусных вакцин обоих типов, нет универсального подхода к их разработке.

Отличительной особенностью флавивирусов является способность их белковой оболочки формировать так называемые субвирусные частицы (SVP). Такие частицы могут эффективно продуцироваться эукариотическими клетками, содержащими стандартные векторы, экспрессирующие prM/E гликопротеины, или дефектные флавивирусные геномы, содержащие делетированный капсидный ген. Указанные вирусоподобные частицы утрачивают генетический материал и полный нуклеокапсид, но функционируют как эффективный иммуноген и индуцируют защитную иммунную реакцию против последующей инфекции компетентными по репликации флавивирусами. Дефектные флавивирусные геномы, утратившие кодирующую капсид последовательность, могут быть доставлены в клетки в виде РНК или в виде упакованного в инфекционные вирусные частицы материала с использованием пакующих клеточных линий, в которых капсид представлен в транс-форме, например, с помощью персистентно реплицирующихся альфа-вирусных репликонов, кодирующих капсидный ген флавивируса под контролем субгеномного промотора. При инфекции «необученных» клеток in vitro и in vivo указанные псевдоинфицирующие флавивирусы демонстрируют способность к репликации и продукции SVP, но не они не могут вызвать распространяющуюся продуктивную инфекцию. В этой связи, их применение не приводит к развитию заболевания, так что они представляют собой интересную промежуточную форму между живыми и инактивированными вирусами. Они выполняют единичный цикл инфекции, приводя к индукции эффективного иммунного ответа, и получили, в этой связи, название псевдоинфицирующих вирусов (PIV).

Разработка систем реверсивной генетики для флавивирусов открыла возможность получения новых типов вакцин на основе живых ослабленных вирусов с использованием рациональной системы аттенюации таких вирусов. Такой новый класс вакцин включает гибриды на основе вируса желтой лихорадки 17D, в котором геномный фрагмент, кодирующий prM-E вируса желтой лихорадки, был замещен prM/E кассетой, полученной из гетерологичных флавивирусов. Указанные химерные флавивирусы, по всей видимости, представляют собой разумный универсальный подход к созданию новых вакцин. Однако имеется озабоченность, связанная с тем, что такие гибридные формы сами по себе могут быть патогенными, по меньшей мере для индивидуумов со сниженным иммунитетом, и патогенные гибриды могут возникать при репликации у иммунизированных позвоночных животных, или рекомбинантные, компетентные по репликации флавивирусы будут переноситься комарами, москитами или клещами.

Другим перспективным направлением в разработке вакцин является направление, основанное на создании невосстанавливаемых делеций в геноме флавивируса, которое позволяет достичь продуктивной репликации вируса у вакцинированного организма-хозяина либо с меньшей эффективность, либо это становится невозможным событием. В последнем случае, вирусные геномы, содержащие полный репликативный механизм, но утратившие, например, С-кодирующий участок, могут быть доставлены в случае иммунизации in vivo в виде синтезированных in vitro РНК, способных к саморепликации. Было показано, что прямая иммунизация с использованием синтезированных in vitro дефектных РНК геномов, которые определяют продукцию субвирусных частиц (SVP) в отсутствие полного цикла вирусной репликации, является безопасным и эффективным методом с точки зрения создания защитного иммунитета. Однако имеются серьезные препятствия на пути получения вакцин на основе РНК, определяемые синтезом, стабильностью и доставкой в ткани. Таким образом, имеющиеся способы разработки флавивирусных вакцин, основанные на получении либо инактивированных вирусных вакцин, которые являются весьма безопасными, но обладают ограниченной активностью и требуют множественных вакцинаций, либо на основе живых ослабленных вакцин, обладают мощным потенциалом с точки зрения реверсии в сторону патогенного варианта дикого типа и к их передаче членистоногими в качестве векторов.

Кроме того, применение PIV для вакцинации требует их крупномасштабного производства и разработка клеточных линий, которые позволяли бы упаковывать дефектные геномы с образованием вирусных вирионов, продемонстрировала такую возможность. PIV могут быть пассированы в клеточных пакующих линиях, но не в «обученных» клетках, в возрастающем порядке. Однако, по всей видимости, это не единственный способ их крупномасштабного размножения. Продукция флавивирусов согласно настоящему изобретению не требует разработки таких клеточных линий, при том что способ, описанный в настоящем изобретении, тем не менее ведет к эффективной продукции PIV. Дополнительно, флавивирусы, дефектные по репликации, согласно настоящему изобретению, являются не только безопасными для использования, но к тому же они способны к репликации в культуре ткани в возрастающих, пригодных для промышленного применения масштабах и к экспрессии дополнительных генов. Таким образом, указанные флавивирусы являются дефектными по репликации и не способны вызвать продуктивную распространяющуюся инфекцию у человека и животных.

В основном генетический материал, требуемый для вирусной репликации, был выделен из двух геномов, способных к транскомплементации имеющихся у них недостаточностей. Оба из них кодировали цис-активные промоторные элементы, необходимые для репликации РНК, и полный набор неструктурных белков, которые формируют репликативный ферментативный комплекс. Таким образом, оба РНК генома способны к саморепликации, но один из них кодирует капсид, но гены, кодирующие белки оболочки, в нем делетированы, а другой кодирует гены оболочки, но не капсида.

При доставке в одну и ту же клетку геномы продуцируют полный набор структурных белков и клетки высвобождают высокие титры инфекционных вирусных частиц, содержащих каждый из этих геномов. При следующем пассаже «необученные» клетки могут быть инфицированы вирусами с таким показателем множественности заражения, который позволяет обоим геномам доставляться в одну клетку. Это ведет к достижению продуктивной репликации и к высвобождению инфекционных вирусных частиц, содержащих каждый из указанных геномов. Таким образом, данная система позволяет размножать рекомбинантные вирусы в возрастающем порядке. При инокуляции в организм животного (который содержит большое число чувствительных клеток)ф каждый из геномов доставляется в разные клетки, распространяющаяся инфекция доходит до неприемлемого уровня, и клетки, инфицированные вирионами, которые содержат геномы, кодирующие белки оболочки, продуцируют неинфекционные вирусо-подобные частицы, утратившие генетический материал, но которые служат в качестве эффективных иммуногенов и индуцируют защитный иммунный ответ против следующей инфекции вирусом дикого типа (фиг.7).

Для усиления эффективной репликации и комплементации оба дефектных генома требуют наличия 5'UTR и более 60 нуклеотидов (элемент 1) в следующей природной последовательности, кодирующей белок, представленной амино-концевым фрагментом капсида, в случае большинства флавивирусов или N^pro гена, для представителей рода пестивирусов. За этой последовательностью следует последовательность убихитина или протеаза 2А, специфичная для вируса ящура (FAMDV), слитая с другой последовательностью, кодирующей капсид или белки оболочки. Такое сочетание слитых генов является необходимым для репликации обоих геномов и их упаковки с равной эффективностью в вирусные частицы.

Использование искусственных, оптимизированных по кодону последовательностей, кодирующих вирусные структурные белки, исключает возможность рекомбинации между двумя дефектными вирусными геномами, которая в потенциале может привести к образованию компетентных по репликации флавивирусов. Оба дефектных генома могут использоваться для экспрессии дополнительных генов и в этой связи служить в качестве векторов для генерации иммунного ответа на гетерологичные белки. Указанные дополнительные гены могут быть клонированы между последовательностью элемента 1 и убихитином или FAMDV 2A протеазой.

Как указывалось выше, применение таких флавивирусов с двухкомпонентным геномом для вакцинации не приводит к развитию продуктивной распространяющейся инфекции у иммунизированных людей и животных. Поскольку люди и животные имеют множество клеток, эти клетки инфицируются с очень низким показателем множественности, что ведет к инфекции лишь одним геномом. Такие клетки способны продуцировать только так называемые вирусопободные частицы, которые утрачивают нуклеокапсид и какой-либо генетический материал. Последние частицы служат в качестве эффективного иммуногена, но они не способны проводить следующие циклы инфекции. Согласно настоящему описанию указанные дефектные вирусные геномы с комплементерными функциями могут экспрессировать дополнительную генетическую информацию и служить в качестве поливалентных вакцин.

Конкретно, настоящее изобретение относится к использованию генетического материала из вируса желтой лихорадки для целей демонстрации эффективности описанного метода. В этой связи следует отметить, что генетический материал из вируса желтой лихорадки разделен между двумя вирусными геномами, способными к транскомплементации недостаточностей друг у друга. Каждый из первоначально разработанных дефектных YFV геномов кодировал полный механизм репликации РНК и один их них содержал делецию практически полного капсидного гена, а второй геном не кодировал prM/E. Для отслеживания репликации каждого из геномов в культуре ткани и для определения титров инфекционных частиц использовали геномы, кодирующие разные флуоресцентные маркеры, GFP и Cherry. Их экспрессия в клетках указывала на уровень инфекции и репликации конкретного генома. При доставке в одни и те же клетки ожидалось, что YF/GFP/prME и YF/C/Cherry будут продуцировать полный набор структурных белков вирусов и в итоге упакованных в инфекционные вирионы. Однако неожиданно было обнаружено, при первых попытках установить продуктивную репликацию, что это невозможно из-за высокой цитотоксичности, определяемой репликацией YF/C/Cherry. При этом продуцировались очень высокие уровни флуоресцентного белка, но также создавался жесткий CPE, что приводило к низкому уровню высвобождения инфекционных вирусных частиц.

Для дальнейшего исследования этого феномена был разработан геном YFV, который кодировал две копии капсидного гена, где один из них мог бы использоваться для широкого набора генетических манипуляций. Этот вирус также характеризовался необычной цитотоксичностью и реплицировался с низкими тирами. После модификаций последовательности, кодирующей капсид, было показано, что повышение цитотоксичности связано с самим капсидным белком (когда он экспрессировался не в рамках C-prM-E кассеты), а не с возможным изменением во вторичной структуре РНК (фиг.2). Кроме того, вирус YF/C/GFP/C, содержащий две копии капсидного гена в геноме, мог далее развиваться и создавать варианты, адаптированные для роста с более высокими титрами, но при низких уровнях вирусного развития CPE. К настоящему времени, точный механизм влияния экспрессии YFV капсида вирусами YF/C/Cherry или YF/C/GFP/C на индукцию CPE остается непонятным.

Секвенирование вариантов YF/C/GFP/C, адаптированных к более высокому уровню высвобождения вирусов, обеспечивает подходы к созданию модифицированных инфекционных вирусов, способных к стабильной экспрессии дополнительных различных гетерологичных белков in vivo и in vitro. Однако наиболее важен тот факт, что идентифицированные спонтанные делеции предоставляют возможность модифицировать первоначально разработанный дефектный по репликации геном вируса YF/C/Cherry до YF/Cherry/Cco, что привело к другой стратегии кодирования белков и создавало возможность эффективной транскомплементации при репликации YF/GFP/prME. Клетки, которые были подвергнуты совместной трансфекции синтезированными in vitro РНК из обоих геномов, продуцировали вирусные белки, в которых геномы, кодирующие и капсид, и prM/E, были представлены в одной и той же концентрации, и такой необычный вирус мог быть далее пассирован в «необученных» клетках в возрастающем порядке.

Инфекция клеток с низкой множественностью заражения недвусмысленно продемонстрировала, что оба генома упаковываются в отдельные вирусные частицы, и поэтому такой YFV, содержащий два генома с комплементарными функциями, не может быть обозначен как сегментированный геном вируса (что предполагает наложение всех геномных фрагментов, упакованных в один вирион), но, скорее всего, это вирус с двухкомпонентным геномом. Вирусы такого типа, содержащие оба геномных сегмента, упакованные по отдельности, были ранее описаны в растениях. Дальнейшее применение таких вирусов для иммунизации сопряжено с проблемами, определяемыми возможной рекомбинацией между геномами, которая могла бы привести к образованию инфекционных, полных, компетентных по репликации вирусов. В этой связи, несмотря на то, что это в высшей степени невероятное событие, капсидный ген в РНК YF/Cherry/C был представлен в виде синтетической, оптимизированной по кодонам версии, утратившей последовательность циклизации. Во множестве экспериментов с использованием YFV с двухкомпонентным геномом не было выявлено образования инфекционного YFV, содержащего не фрагментированный геном. Однако возможно дополнительно снизить вероятность рекомбинации за счет использования различных пар последовательностей циклизации в самореплицирующихся фрагментах, кодирующих капсид и prME.

Интересно отметить, что модификация стратегии кодирования C-prM-E в конструкциях генома, основанных не на YFV, приводила к резкому повышению эффективности упаковки YFV векторов, которые совсем не кодируют структурные белки. Указанные клеточные линии, продуцирующие C-GFP-Copt-prM-E с 25 аминокислотами из персистентно реплицирующихся VEErep/GFP-C-prM-E/Pac, создавала упакованные YFV репликоны со значительно более высокими титрами, чем аналогичная клеточная линия, экспрессирующая только C-prM-E кассету. Упакованные YFV репликоны не только высвобождались с более высокими титрами, превышающими 10⁸ инфицирующих единиц/мл, но могли также пассироваться в пакующих клеточных линиях без снижения титров. Таким образом, простая модификация субгеномной РНК кодирующей C-prM-E за счет клонирования 25 кодонов, специфичных для капсида, против направления считывания структурного полипротеина, оказывала очень выраженное положительное влияние на высвобождение инфекционных частиц и могла расширить число векторов на