Инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения

Инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка основана на заявках на патент США №60/589058, поданной 19 июля 2004 г., №60/619153, поданной 15 октября 2004 г., №60/632578, поданной 2 декабря 2004 г., и №60/655838, поданной 24 февраля 2005 г., и №60/655803, поданной 24 февраля 2005 г., и включает полные описания данных изобретений посредством ссылки. Эта заявка также включает посредством ссылки следующие заявки, поданные 19 июля 2005 г. Radhakrishnan с соавт.: заявку на патент США №11/184668 под названием "Cation complexes of insulin compound conjugates, formulations and uses thereof; заявку на патент США №11/184594 под названием "Insulin-oligomer compound conjugates, formulations and uses thereof"; заявку на патент США №11/184528 под названием "Fatty acid formulations for oral delivery of proteins and peptides, and uses thereof".

2. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новым конъюгатам соединений инсулинов, в которых инсулин или аналог инсулина связан с модифицирующей группировкой. Изобретение также относится к катионным комплексам таких конъюгатов соединений инсулинов и к фармацевтическим препаратам, содержащим такие конъюгаты соединений инсулинов и/или модифицирующие группировки.

3. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Цинковый комплекс соединения инсулина имеется в продаже, например, под торговыми названиями HUMULIN® и HUMALOG®. Цинковый комплекс инсулина обычно существует в гексамерной форме.

Описаны различные способы применения цинка в кристаллизации ацилированного инсулина. Например, в патентной публикации США №20010041786, опубликованной 15 ноября 2001 г., Mark L. Brader с соавт., под названием "Stabilized acylated insulin formulations", описан препарат с водным раствором для парентеральной доставки, в частности, в виде препарата для инъекций, имеющий рН от 7,1 до 7,6, содержащий инсулин, ацилированный жирной кислотой, или аналог инсулина, ацилированный жирной кислотой, и стабилизированный с помощью цинка и предпочтительно фенольного соединения. В патенте США №6451970 под названием "Peptide derivatives", опубликованном 17 сентября 2002 г. Schaffer с соавт., права на который переданы Novo Nordisk A/S, описаны производные соединения инсулина и аналогов инсулина, где N-концевая аминогруппа В-цепи и/или е-аминогруппа Lys в положении В28, В29 или В30 ацилирована с использованием длинноцепочечной углеводородной группы, содержащей от 12 до 22 атомов углерода, и их цинковые комплексы.

Описали применение протаминов и фенольных соединений для кристаллизации ацилированного инсулина. В патентах США №№6268335 (31 июля 2001 г.) и 6465426 (10 октября 2002 г.), опубликованных Brader, которые оба озаглавлены "Insoluble insulin compositions", описаны нерастворимые композиции, содержащие ацилированный инсулин, комплексообразующее соединение протамина, гексамер-стабилизирующее фенольное соединение и двухвалентный катион металла.

Существующие подходы специально предназначены для кристаллизации нативного соединения инсулина, или аналогов соединений инсулинов, или для ацилированных соединений инсулинов, имеющих повышенную липофильность по сравнению с неацилированными соединениями инсулинами. В данной области техники существует необходимость в фармацевтически приемлемых комплексах, включающих производные соединений инсулинов, отличные от ацилированного соединения инсулина, такие как гидрофильные и/или амфифильные производные соединений инсулинов, и в стабилизации неацилированных липофильных аналогов соединений инсулинов. В данной области техники существует необходимость также в новых белковых конъюгатах, имеющих повышенную биодоступность или другие улучшенные фармацевтические свойства по сравнению с существующими конъюгатами. В данной области техники существует необходимость в новых препаратах, которые облегчают пероральную доставку белков и белковых конъюгатов. Наконец, существует необходимость в комбинированном подходе для улучшения пероральной биодоступности белка, такого как соединение инсулин, который включает улучшенный пероральный белковый конъюгат, предложенный в виде твердого вещества в улучшенном препарате для максимизации преимуществ пероральной доставки белков.

4. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В общем, в изобретении предложен комплекс, включающий конъюгат соединения инсулина, в котором соединение инсулин конъюгировано с модифицирующей группировкой, и катион, где конъюгат соединения инсулина образует комплекс с катионом. Соединение инсулин может представлять собой, например, нативный инсулин или аналоги инсулина. Примеры соединений инсулинов включают в себя инсулин человека, лизпроинсулин, des30 инсулин, нативный проинсулин, искусственный проинсулин и так далее. Катионный компонент может представлять собой, например, двухвалентный катион металла, выбранный из группы, состоящей из Zn⁺⁺, Mn⁺⁺, Са⁺⁺, Fe⁺⁺, Ni⁺⁺, Cu⁺⁺, Co⁺⁺ и Mg⁺⁺.

Модифицирующая группировка может быть выбрана так, чтобы сделать конъюгат соединения инсулина более, менее или таким же растворимым, как соответствующее неконъюгированное соединение инсулин. Предпочтительно, модифицирующая группировка выбрана так, чтобы сделать конъюгат соединения инсулина по меньшей мере в 1,05; 1,25; 1,5; 1,75; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5; 10; 10,5; 11; 11,5; 12; 12,5; 13; 13,5; 14; 14,5 или 15 раз более растворимым, чем соответствующее неконъюгированное соединение инсулин, в водном растворе при рН приблизительно 7,4. Предпочтительно, модифицирующая группировка выбрана так, чтобы конъюгат соединения инсулина имел растворимость в воде, которая превышает приблизительно 1 г/л, 2 г/л, 3 г/л, 4 г/л, 5 г/л, 10 г/л, 15 г/л, 20 г/л, 25 г/л, 50 г/л, 75 г/л, 100 г/л, 125 г/л или 150 г/л при рН приблизительно 7,4. Кроме того, модифицирующая группировка выбрана так, чтобы сделать конъюгат соединения инсулина таким же или более растворимым, чем соответствующее неконъюгированное соединение инсулин, и растворимость в воде конъюгата соединения инсулина уменьшена путем добавления цинка. В другом воплощении модифицирующая группировка выбрана так, чтобы сделать конъюгат соединения инсулина таким же или более растворимым, чем соответствующее неконъюгированное соединение инсулин; растворимость в воде конъюгата соединения инсулина уменьшена путем добавления цинка; и растворимость в воде комплекса выше растворимости в воде соединения инсулина. В еще одном воплощении относительная липофильность конъюгата соединения инсулина по сравнению с соответствующим исходным соединением инсулином (k_отн) равна 1 или меньше 1.

В изобретении также предложены новые конъюгаты соединений инсулинов, содержащие соединение инсулин, конъюгированное с модифицирующей группировкой. Например, в изобретении предложены соединения инсулины, связанные с модифицирующей группировкой, имеющей формулу:

где:

X, Y и Z представляют собой независимо выбранные связывающие группы, и каждая из них возможно присутствует, и X, когда присутствует, связан с соединением инсулином ковалентной связью,

по меньшей мере один из R¹ и R² присутствует и представляет собой низший алкил и возможно может включать карбонильную группу,

R² представляет собой блокирующую группу, такую как -CH₃, -Н, тозилат, или активирующую группу, и

PAG представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, включающую одну или более алкаленгликолевых группировок (т.е. оксиалкаленовых группировок) и возможно включающую одну или более дополнительных группировок, выбранных из группы, состоящей из -S-, -O-, -NH- и -С(O)-, и

где наибольшее число тяжелых атомов, имеющихся в модифицирующей группировке, составляет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25.

В воплощениях изобретения любой один или более из X, Y и Z могут отсутствовать. Кроме того, X, Y и/или Z, когда присутствуют, независимо могут быть выбраны из -С(O)-, -O-, -S-, -С- и -NH-. В одном воплощении Z представляет собой -С(O)-. В другом воплощении Z не присутствует.

В некоторых воплощениях R¹ представляет собой низший алкил, и R² не присутствует. В других воплощениях R² представляет собой низший алкил, и R¹ не присутствует.

В другом воплощении модифицирующая группировка может включать линейную или разветвленную группировку, представляющую собой замещенную углеродную цепь, имеющую основную цепь из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 атомов, выбранных из группы, состоящей из -C, -C-, -O-, =O, -S-, -NH-, -Si-. Тяжелые атомы обычно включают в себя один или более атомов углерода и один или более неуглеродных тяжелых атомов, выбранных из группы, состоящей из -O-, -S-, -NH- и =O. Атомы углерода и неуглеродные тяжелые атомы обычно присутствуют в соотношении по меньшей мере 1 атом углерода на каждый неуглеродный тяжелый атом, предпочтительно по меньшей мере 2 атома углерода на каждый неуглеродный тяжелый атом, более предпочтительно по меньшей мере 3 атома углерода на каждый неуглеродный тяжелый атом. Атомы углерода и атомы кислорода обычно присутствуют в соотношении по меньшей мере 1 атом углерода на каждый атом кислорода, предпочтительно по меньшей мере 2 атома углерода на каждый атом кислорода, более предпочтительно по меньшей мере 3 атома углерода на каждый атом кислорода. Модифицирующая группировка может включать одну или более блокирующих групп, таких как разветвленный или линейный C_1-6, разветвленный или линейный или карбонил. Модифицирующая группировка обычно включает атомы водорода, и один или более из данных атомов водорода может быть замещен фтором (который является тяжелым атомом, но не следует его рассматривать в качестве тяжелого атома в вышеприведенной формуле). В некоторых случаях модифицирующая группировка, в частности, может исключать незамещенные алкильные группировки. Модифицирующая группировка может быть связана, например, с подходящей группой на аминокислоте, такой как аминогруппа, гидроксильная группа или свободная карбоновокислотная группа полипептида, например, посредством связывающей группы, такой как карбаматная, карбонатная, простая эфирная, сложноэфирная, амидная группа или вторичная аминная группа, или посредством дисульфидной связи. Молекулы в связывающей группе считаются частью модифицирующей группировки. В предпочтительном воплощении молекулярная масса модифицирующей группировки меньше молекулярной массы модифицирующей группировки HIM2.

Изобретение включает конъюгаты соединений инсулинов, имеющие модифицирующие группировки формулы:

,

где n равно 1, 2, 3 или 4, и m равно 1, 2, 3, 4 или 5; и/или

,

где n равно 1, 2, 3, 4 или 5, и m равно 1, 2, 3 или 4.

Следует принимать во внимание, что новые модифицирующие группировки, а также применение таких группировок для модификации инсулина и других полипептидов сами являются аспектами данного изобретения.

В изобретении также предложены новые препараты, содержащие конъюгаты соединений инсулинов и/или конъюгаты катиона и соединения инсулина по изобретению. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые композиции жирных кислот являются особенно полезными, в частности, для пероральной доставки полипептидов и полипептидных конъюгатов, таких как инсулин и конъюгаты соединений инсулинов, и/или для пероральной доставки комплексов конъюгатов соединений инсулинов с катионами по изобретению. В одном аспекте в изобретении предложены композиции жирных кислот с одной или более насыщенными или ненасыщенными С₄, С₅, С₆, С₇, С₈, С₉ или С₁₀ жирными кислотами и/или солями таких жирных кислот. Предпочтительными жирными кислотами являются каприловая, каприновая, миристиновая и лауриновая. Предпочтительными солями жирных кислот являются натриевые соли каприловой, каприновой, миристиновой и лауриновой кислот. Содержание жирных кислот в композиции обычно находится в диапазоне, имеющем в качестве нижнего предела приблизительно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9 или 3,0% масс./масс., и имеющем в качестве верхнего предела приблизительно 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 3,8; 3,9; 4,0; 4,1; 4,2; 4,3; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9; 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9; 7,0; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; 8,6; 8,7; 8,8; 8,9; 9,0; 9,1; 9,2; 9,3; 9,4; 9,5; 9,6; 9,7; 9,8; 9,9; 10,0; 10,1; 10,2; 10,3; 10,4; 10,5; 10,6; 10,7; 10,8; 10,9; 11,0; 11,1; 11,2; 11,3; 11,4; 11,5; 11,6; 11,7; 11,8; 11,9 и 12,0% масс./масс. В еще одном воплощении содержание жирных кислот в композиции обычно находится в диапазоне, имеющем в качестве нижнего предела приблизительно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9 или 3,0% масс./масс., и имеющем в качестве верхнего предела приблизительно 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 3,8; 3,9; 4,0; 4,1; 4,2; 4,3; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9; 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9; 7,0; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; 8,6; 8,7; 8,8; 8,9; 9,0; 9,1; 9,2; 9,3; 9,4; 9,5; 9,6; 9,7; 9,8; 9,9; 10,0; 10,1; 10,2; 10,3; 10,4; 10,5; 10,6; 10,7; 10,8; 10,9; 11,0; 11,1; 11,2; 11,3; 11,4; 11,5; 11,6; 11,7; 11,8; 11,9 или 12,0% масс./масс., и содержание одной жирной кислоты, предпочтительно каприловой, каприновой, миристиновой или лауриновой, или ее соли в содержании жирных кислот в композиции обычно выше приблизительно 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 99,5; 99,6; 99,7; 99,8 или 99,9% масс./масс.

В изобретении также предложен способ лечения недостаточности инсулина или иного пополнения инсулина у субъекта с использованием конъюгатов соединений инсулинов, комплексов конъюгатов соединений инсулинов с катионами и/или препаратов по изобретению. Данные способы обычно включают введение терапевтически эффективного количества одного или более конъюгатов соединений инсулинов, комплексов конъюгатов соединений инсулинов с катионами и/или препаратов по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

5. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1-15Б представлены микрофотографии различных кристаллических твердых веществ по изобретению. На фиг.1 и 2 представлены микрофотографии, полученные с использованием микроскопа Zeiss Axiovert, показывающие Zn-комплекс Т-типа для HIM2 в концентрации 30 г/л, кристаллы выращивали в течение 24 ч. На фиг.3 представлена микрофотография, полученная с использованием микроскопа Zeiss Axiovert, показывающая Zn-комплекс Т-типа для HIM2 в концентрации 30 г/л, кристаллы выращивали в течение 5 суток. На фиг.4 представлена микрофотография, полученная с использованием микроскопа Zeiss Axiovert, показывающая Zn-комплекс R-типа для HIM2 в концентрации 30 г/л, кристаллы выращивали в течение 4 суток. На фиг.5 представлена микрофотография кристаллического Zn-комплекса R-типа для IN105, содержащего 30% органического вещества. На фиг.6А-10Б представлены микрофотографии различных Zn-комплексов R-типа для HIM2, полученных с использованием органического растворителя. На фиг.11А-14Б представлены микрофотографии кристаллов различных Zn-комплексов R-типа, полученных в результате сокристаллизации HIM2 и IN105. На фиг.15А-15Б представлены микрофотографии кристаллов различных Zn-комплексов R-типа, полученных в результате сокристаллизации HIM2 и инсулина человека. Данное изобретение включает кристаллы, имеющие морфологию, показанную на любой из фиг.1-15Б.

На фиг.16-20 представлены результаты анализа глюкозы в крови у мышей (MBGA от англ. Mouse Blood Glucose Assay) для HIM2 и различных комплексов Zn-HIM2. На фиг.16 показаны MBGA-профили биологической активности для HIM2. На фиг.17 показаны MBGA-профили биологической активности для продукта Zn HIM2 соединения инсулина R-типа. На фиг.18 показаны MBGA-профили биологической активности для продукта Zn HIM2 соединения инсулина Т-типа. На фиг.19 показаны MBGA-профили биологической активности для продукта Zn HIM2 соединения инсулина с протамином. На фиг.20 показан эффект протаминового комплекса R-типа на снижение уровня глюкозы через 30 и 90 минут после введения дозы.

На фиг.21-24 показаны MBGA-профили биологической активности для IN-186, IN-192, IN-190, IN-191, IN-189, IN-178, IN-193, IN-194, IN-185, IN-196 и IN-197.

На фиг.25 и 26 приведены результаты исследований с фиксированным уровнем глюкозы у собак для комплексов Zn-HIM2 по изобретению.

На фиг.27 и 28 приведены результаты исследований с фиксированным уровнем глюкозы у собак для комплексов Zn-IN105 по изобретению.

На фиг.29 и 30 приведены результаты исследований с фиксированным уровнем глюкозы у собак, которым вводили IN105 в дозе 0,25 мг/кг в пероральном жидком препарате [820], содержащем 3% (масс./об.) натриевой соли каприновой кислоты в фосфатном буфере без дополнительных эксципиентов.

На фиг.31-33 приведены результаты исследований с фиксированным уровнем глюкозы у собак, которым давали таблетки, содержащие 6 мг IN105 и 150 мг маннита, 30 мг Exlotab с 143 мг капрата с или без 143 мг лаурата (пероральная доза составляла 0,25 мг/кг).

На фиг.34-37 приведены результаты исследований с фиксированным уровнем глюкозы у собак, которым давали таблетки-прототипы, содержащие 150 мг и 280 мг капрата, и таблетки, содержащие 140 мг/140 мг капрата/лаурата (доза ZN IN-105 составляла 6 мг или 0,25 мг/кг) и сравнение с подкожным* и ингаляционным* введением стандартного инсулина.

На фиг.38-42 приведены результаты исследований с фиксированным уровнем глюкозы у собак, которым давали таблетки, содержащие 150 мг и 286 мг капрата, и таблетки, содержащие 140 мг/140 мг капрата/лаурата (доза ZN IN-105 составляла 0,25 мг/кг).

6. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ниже приведены определения терминов, используемых в данном описании изобретения и в формуле изобретения. Предложенные определения, если не оговорено особо, использованы везде в описании настоящего изобретения. Термины, не определенные в данном описании, имеют значение, которое обычно подразумевается в той области техники, к которой относится данный термин.

Термин "вставка", когда его используют в отношении аминокислотной последовательности, включает добавления одной или более аминокислот с одного или обоих концов последовательности, а также инсерции в пределах данной последовательности.

Термин "комплекс" относится к ассоциации молекул, в которой одно или более соединений инсулинов или конъюгатов соединений инсулинов образуют координационные связи с одним или более атомами или ионами металла. Комплексы могут существовать в растворе или в виде твердого вещества, такого как кристалл, микрокристалл, или аморфного твердого вещества. Термин "смесь комплексов" означает смесь, содержащую два или более различных комплексов, либо в растворе, либо в твердой форме. Смеси комплексов могут включать в себя, например, комплексы с разными соединениями инсулинами, разными конъюгатами соединений инсулинов, разными гибридными комплексами, разными катионами, комбинации вышеупомянутого и тому подобное. Термин "гибридный комплекс" означает комплекс конъюгата соединения инсулина с катионом, содержащий два или более разных соединений инсулинов и/или конъюгатов соединений инсулинов.

Термин "комплексообразующий агент" означает молекулу, которая имеет множество зарядов и которая связывается или образует комплекс с конъюгатами соединений инсулинов. Примеры комплексообразующих агентов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают в себя протамины, сурфен, глобиновые белки, спермин, спермидин, альбумин, аминокислоты, карбоновые кислоты, поликатионные полимерные соединения, катионные полипептиды, анионные полипептиды, нуклеотиды и антисенс. Смотри Brange, J., Galenics of Insulin compound, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987), полное описание которого включено в данное изобретение посредством ссылки.

Термин "консервативный", используемый в отношении вставки, делеции или замены аминокислоты, означает вставку, делецию или замену в аминокислотной цепи, которая не уменьшает полностью терапевтическую эффективность соединения инсулина, т.е. данная эффективность может уменьшаться, оставаться такой же или увеличиваться относительно терапевтической эффективности приемлемого с научной точки зрения контроля, такого как соответствующее соединение нативного инсулина.

Термин "гидрофильный" означает проявление свойств растворимости в воде, и термин "гидрофильная группировка" относится к группировке, которая является гидрофильной, и/или которая, при присоединении к другой химической структурной единице, увеличивает гидрофильность такой химической структурной единицы. Примеры включают в себя сахара и полиалкиленовые группировки, такие как полиэтиленгликоль, но не ограничиваются этим. Термин "липофильный" означает проявление свойств растворимости в жирах, таких как накопление в жире или жировых тканях, способность растворяться в липидах и/или способность проникать в биологические мембраны, взаимодействовать с ними и/или проходить через них, и термин "липофильная группировка" означает группировку, которая является липофильной, и/или которая, при присоединении к другой химической структурной единице, увеличивает липофильность такой химической структурной единицы. Термин "амфифильный" означает проявление свойств гидрофильности и липофильности, и термин "амфифильная группировка" означает группировку, которая является амфифильной, и/или которая, при присоединении к полипептидному или неполипептидному лекарственному препарату, увеличивает амфифильность (т.е. увеличивает как гидрофильность, так и амфифильность) полученного конъюгата, например некоторые PEG-жирнокислотные модифицирующие группировки и сахар-жирнокислотные модифицирующие группировки.

Термин "низший алкил" означает замещенные или незамещенные, линейные или разветвленные алкильные группировки, содержащие от одного до шести атомов углерода, т.е. C₁, С₂, С₃, С₄, С₅ или С₆. Термин "высший алкил" означает замещенные или незамещенные, линейные или разветвленные алкильные группировки, содержащие шесть или более атомов углерода, например С₇, C₈, С₉, С₁₀, С₁₁, С₁₂, С₁₃, С₁₄, С₁₅, С₁₆, С₁₇, C₁₈, С₁₉, С₂₀ и так далее.

Термин "монодисперсный" описывает смесь соединений, где приблизительно 100 процентов соединений в смеси имеют одинаковую молекулярную массу. Термин "по существу монодисперсный" описывает смесь соединений, где по меньшей мере приблизительно 95 процентов соединений в смеси имеют одинаковую молекулярную массу. Термин "чисто монодисперсный" описывает смесь соединений, где приблизительно 100 процентов соединений в смеси имеют одинаковую молекулярную массу и имеют одинаковую молекулярную структуру. Соответственно, чисто монодисперсная смесь является монодисперсной смесью, но монодисперсная смесь не обязательно является чисто монодисперсной смесью. Термин "по существу чисто монодисперсный" описывает смесь соединений, где по меньшей мере приблизительно 95 процентов соединений в смеси имеют одинаковую молекулярную массу и одинаковую молекулярную структуру. Соответственно, по существу чисто монодисперсная смесь является по существу монодисперсной смесью, но по существу монодисперсная смесь не обязательно является по существу чисто монодисперсной смесью. В композициях конъюгатов соединений инсулинов с катионами компоненты конъюгатов соединений инсулинов предпочтительно являются монодисперсными, по существу монодисперсными, чисто монодисперсными или по существу чисто монодисперсными, но могут быть также полидисперсными. Термин "полидисперсный" означает имеющий дисперсность, которая не является монодисперсной, по существу монодисперсной, чисто монодисперсной или по существу чисто монодисперсной.

Термин "соединение нативный инсулин", специфически используемый в данном описании, означает соединение инсулин млекопитающего (например инсулин человека, соединение бычий инсулин, соединение инсулин свиньи или соединение инсулин кита), полученное из природного, искусственного или генно-инженерного источника. Инсулин человека состоит из А-цепи, имеющей двадцать одну аминокислоту, и В-цепи, имеющей тридцать аминокислот, которые сшиты дисульфидными связями. Правильно сшитый инсулин человека содержит три дисульфидных мостика: один - между А7 и В7, второй- между А20 и В19, и третий - между А6 и А11. Инсулин человека имеет три свободные аминогруппы: В1-фенилаланин, А1-глицин и В29-ЛИЗИН. Свободные аминогруппы в положениях А1 и В1 представляют собой α-аминогруппы. Свободная аминогруппа в положении В29 представляет собой е-аминогруппу. Термин "аналог инсулина" означает полипептид, проявляющий частичную, полную или повышенную активность относительно соответствующего нативного инсулина, или полипептид, который превращается in vivo или in vitro в полипептид, проявляющий частичную, полную или повышенную активность относительно соответствующего нативного инсулина, например полипептид, имеющий структуру инсулина человека со вставками, делециями и/или заменами одной или более консервативных аминокислот. Аналоги инсулина могут быть идентифицированы с использованием известных методов, таких как методы, описанные в патентной публикации США №20030049654, "Protein design automation for protein libraries", поданного 18 марта 2002 г. на имя Dahiyat с соавт. Проинсулины, препроинсулины, предшественники инсулина, одноцепочечные предшественники инсулина человека и животных, не относящихся к человеку, и аналоги любого из вышеперечисленного в данном описании также называются аналогами инсулина, как и инсулины немлекопитающих. В данной области техники известно много аналогов инсулина (смотри обсуждение ниже). Если в контексте не оговорено особо (например, кроме тех случаев, где указан конкретный инсулин, такой как "инсулин человека" или тому подобное), термин "соединение инсулин" используют в широком смысле для включения нативных инсулинов и аналогов инсулинов.

Термин "полиалкиленгликоль" или PAG относится к замещенным или незамещенным, линейным или разветвленным полиалкиленгликолевым полимерам, таким как полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль (PPG) и полибутиленгликоль (PBG), и их комбинациям (например линейным или разветвленным полимерам, включающим комбинации двух или более различных PAG-субъединиц, такие как комбинации двух или более различных PAG-субъединиц, выбранных из PEG-, PPG-, PPG- и PBG-субъединиц) и включает простые моноалкилэфиры полиалкиленгликоля. Термин PAG-субъединица означает одну структурную единицу PAG, например термин "PEG-субъединица" относится к одной полиэтиленгликолевой структурной единице, например к -(СН₂СН₂О)-, термин "PPG-субъединица" относится к одной полипроленгликолевой структурной единице, например к -(СН₂СН₂СН₂О)-, и термин "PBG-субъединица" относится к одной полибутиленгликолевой структурной единице, например к -(СН₂СН₂СН₂СН₂О)-. PAG и/или PAG-субъединицы также включают в себя замещенные PAG и/или PAG-субъединицы, например PAG, содержащие алкильные боковые цепи, такие как метильные, этильные или пропильные боковые цепи, или карбонильные боковые цепи, а также PAG, содержащие одну или более разветвленных PAG-субъединиц, таких как изо-PPG или изо-PBG.

Термин "соединение проинсулин" означает соединение инсулин, в котором С-конец В-цепи связан с N-концом А-цепи посредством природного или искусственного С-пептида, имеющего 5 или более аминокислот. Термин "соединение препроинсулин" означает соединение проинсулин, дополнительно содержащее лидерную последовательность, соединенную с N-концом В-цепи, такую как последовательность, выбранную для стимуляции экскреции в виде растворимого белка, или последовательность, выбранную для предотвращения конъюгирования N-конца, или последовательность, выбранную для улучшения очистки (например последовательность со сродством связывания к колонке для очистки). Термин "одноцепочечный предшественник соединения инсулина" или "соединение минипроинсулин" означает соединение инсулин, в котором С-конец В-цепи (или укороченной В-цепи, у которой на С-конце удалены 1, 2, 3 или 4 аминокислоты) связан с N-концом А-цепи или укороченной А-цепи, которая укорочена на N-конце на 1, 2, 3 или 4 аминокислоты, без промежуточного С-пептида или через укороченный С-пептид, имеющий 1, 2, 3 или 4 аминокислоты.

Термин "протамин" относится к смеси сильно основных белков, полученных из природных (например из спермы рыб) или рекомбинантных источников. Смотри Hoffmann, J. A., et al., Protein Expression and Purification, 1:127-133 (1990). Композиция протамина может быть представлена в виде препарата данных белков, относительно свободного от солей, часто называемого как "протаминовое основание" или в виде препарата, содержащего соли данных белков.

Термины "белок", "пептид" и "полипептид" используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к соединениям, имеющим аминокислотные последовательности любой длины, но по меньшей мере из двух аминокислот.

Термин "R-тип" означает конформацию комплекса, образованного в присутствии конъюгата соединения инсулина, катиона и стабилизирующего соединения, такого как фенол. Термин "Т-тип" означает конформацию комплекса, образованного в присутствии конъюгата соединения инсулина и катиона без стабилизирующего соединения, такого как фенол. Комплекс Т-типа или R-типа может включать или исключать протамин.

Термин "приемлемый с научной точки зрения контроль" означает экспериментальный контроль, который является приемлемым для среднего специалиста в той области техники, к которой относится предмет эксперимента.

Термин "твердое" относится к состоянию вещества, у которого существует трехмерная регулярная структура; в данном описании этот термин широко используется для упоминания как кристаллических твердых веществ, аморфных твердых веществ, так и комбинаций кристаллических твердых веществ и аморфных твердых веществ. Термин "твердый конъюгат соединения инсулина с катионом" относится к твердому веществу, которое включает конъюгат соединения инсулина с катионом, предпочтительно координированный одновалентным или поливалентным катионом. Термин "кристалл" означает твердое вещество в форме правильного многогранника. Термин "кристаллический" относится к твердым веществам, имеющим свойства кристаллов. Термин "микрокристалл" означает твердое вещество, которое образовано, главным образом, из вещества в кристаллическом состоянии, которое является микроскопическим по размерам, наибольший размер которого обычно находится в диапазоне от 1 микрона до 100 микрон. В некоторых случаях отдельные кристаллы, имеющие микрокристаллическую структуру, представляют собой кристаллы, имеющие преимущественно одну кристаллографическую структуру. В некоторых воплощениях кристаллы по изобретению не являются микрокристаллами. Термин "микрокристаллический" относится к состоянию вещества, являющегося микрокристаллом. Термин "аморфный" относится к твердому веществу, которое не находятся в кристаллической форме. Средний специалист в данной области может отличить кристаллы от аморфных веществ, используя стандартные методы, например, используя рентгеновские кристаллографические методы, сканирующую электронную микроскопию или оптическую микроскопию. Термин "смесь твердых веществ" означает смесь двух разных твердых веществ Термин "смесь кристаллов" означает смесь двух разных кристаллов. Термин "сокристалл" означает кристалл, содержащий два или более различных соединений инсулинов и/или конъюгатов соединений инсулинов. Комплексы конъюгатов соединений инсулинов с катионами по изобретению могут быть представлены в любой из вышеупомянутых форм или в виде смесей двух или более таких форм.

Термин "замена" означает замену одного или более аминокислотных остатков в последовательности соединения инсулина другой аминокислотой. В некоторых случаях аминокислотная замена действует как функциональный эквивалент, что приводит к "молчащему" изменению. Замены могут быть консервативными; например, консервативные замены могут быть выбраны из других представителей того же класса, к которому принадлежит замещенная аминокислота. Примеры неполярных (гидрофобных) аминокислот включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Примеры полярных нейтральных аминокислот включают в себя глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Примеры положительно заряженных (основных) аминокислот включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Примеры отрицательно заряженных (кислых) аминокислот включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

"Растворимость в воде" или "водная растворимость", если не оговорено особо, определяют в водном буферном растворе при рН 7,4.

7. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложены комплексы конъюгатов соединений инсулинов с катионами и различные композиции, содержащие такие комплексы, а также способы получения и применения таких комплексов и композиций. Данные комплексы являются полезными для введения соединения инсулина для лечения различных медицинских состояний, таких как состояния, которые характеризуются дефицитом соединений инсулинов. Комплексы обычно включают в себя катионный компонент и компонент, представляющий собой конъюгат соединения инсулина. Компонент, представляющий собой конъюгат соединения инсулина, обычно включает соединение инсулин, связанное с модифицирующей группировкой. Примеры других подходящих компонентов данных комплексов и/или композиций включают в себя стабилизирующие агенты, комплексообразующие агенты и другие известные в данной области компоненты для применения в получении катион-белковых комплексов. В изобретении также предложены новые конъюгаты соединений инсулинов и препараты жирных кислот, содержащие такие конъюгаты соединений инсулинов и/или комплексы конъюгатов соединений инсулинов с катионами.

7.1. Соединение инсулин

Конъюгат соединения инсулина с катионом включает компонент, представляющий собой соединение инсулин. Соединение инсулин может представлять собой, например, соединение инсулин млекопитающего, такое как инсулин человека, или аналог соединения инсулина.

В данной области техники известно большое количество различных аналогов соединений инсулинов. Предпочтительными аналогами соединений инсулинов являются те аналоги, которые содержат лизин, предпочтительно лизин в пределах 5 аминокислот С-конца В-цепи, например в положении В26, В27, В28, В29 и/или В30. Группа подходящих аналогов, имеющих последовательность соединения инсулина, за исключением того, что аминокислотный остаток в положении В28 представляет собой Asp, Lys, Leu, Val или Ala; аминокислотный остаток в положении В29 представляет собой Lys или Pro; аминокислотный остаток в положении В10 представляет собой His или Asp; аминокислотный остаток в положении В1 представляет собой Phe, Asp или делетирован один или в комбинации с делецией остатка в положении В2; аминокислотный остаток в положении В30 представляет собой Thr, Ala или делетирован; и аминокислотный остаток в положении В9 представляет собой Ser или Asp; при условии, что в положении либо В28, либо В29 находится Lys, описана в ЕР-А 1227000107 (полное описание которого включено в данное изобретение посредством ссылки).

Другие примеры подходящих аналогов соединений инсулинов включают в себя Asp^В28 инсулин человека, Lys^B28 инсулин человека, Leu^B28 инсулин человека, Val^В28 инсулин человека, Ala^В28 инсулин человека, Asp^B28Pro^В29 инсулин человека, Lys^В28Pro^B29 инсулин человека, Leu^В28Pro^В29 инсулин человека, Val^B28Pro^В29 инсулин человека, Ala^В28Pro^В29 инсулин человека, а также аналоги, полученные с использованием описанных выше принципов замещения. Фрагменты соединений инсулинов включают в себя В22-В30 инсулин человека, В23-В30 инсулин человека, В25-В30 инсулин человека, В26-В30 инсулин человека, В27-В30 инсулин человека, В29-В30 инсулин человека, В1-В2 инсулин человека, В1-В3 инсулин человека, В1-В4 инсулин человека, В1-В5 инсулин человека, А-цепь инсулина человека и В-цепь инсулина человека, но не ограничиваются этим.

Другие дополнительные примеры подходящих аналогов соединений инсулинов можно найти в патентной публикации США №20030144181 А1 под названием "Insoluble compositions for controlling blood glucose", 31 июля 2003 г.; патентной публикации США №20030104983 А1 под названием "Stable insulin formulations", 5 июня 2003 г.; патентной публикации США №20030040601 А1 под названием "Method for making insulin precursors and insulin analog precursors", 27 февраля 2003 г.; патентной публикации США №20030004096 А1 под названием "Zinc-free and low-zinc insulin preparations having improved stability", 2 января 2003 г.; патенте США №6551992 В1 под названием "Stable insulin formulations", 22 апреля 2003 г.; патенте США №6534288 В1 под названием "С peptide for improved preparation of insulin and insulin analogs", 18 марта 2003 г.; патенте США №6531448 В1 под названием "Insoluble compositions for controlling blood glucose", 11 марта 2