Использование альгинатных олигомеров в борьбе с биопленками

Использование альгинатных олигомеров в борьбе с биопленками

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу борьбы с биопленками. В частности, настоящее изобретение относится к использованию конкретного класса альгинатов и, в частности, некоторых альгинатных олигомеров в борьбе с биопленками как на биотических, так и на абиотических поверхностях. Таким образом, предлагаются как медицинские, так и немедицинские применения и способы для борьбы с биопленочной инфекции или для борьбы с образованием биопленки на неживых поверхностях, например для целей дезинфекции и очистки. Изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что некоторые альгинатные олигомеры способны взаимодействовать с биопленкой и оказывать на нее воздействие.

В общих выражениях биопленка представляет собой совокупность или сообщество микроорганизмов в окружении матрицы из внеклеточных полимеров (также известных в данной области техники как гликокаликс). Эти внеклеточные полимеры обычно представляют собой полисахариды, особенно полисахариды, продуцируемые самими организмами, но они также могут содержать другие биополимеры. Биопленка обычно прикрепляется к поверхности, которая может быть инертной или живой, но, кроме того, наблюдали, что биопленки могут образоваться из микроорганизмов, прикрепленных друг к другу или к любой поверхности раздела. Таким образом, в общем случае биопленка характеризуется как высокоорганизованное многоклеточное сообщество микроорганизмов, заключенных во внеклеточную полимерную матрицу, обычно полисахаридную матрицу, или окруженное ею, и обычно в тесной связи с поверхностью или поверхностью раздела. Такой характер роста является защитным для микроорганизмов и делает трудным их удаление или уничтожение (например, как дополнительно рассматривается ниже, стойкость или устойчивость к противомикробным агентам, или иммунной защите хозяина, или механизмам очищения). Считается, согласно настоящему изобретению, что альгинатные олигомеры могут взаимодействовать с полимерной матрицей биопленки, и таким образом ослаблять биопленку. Как дополнительно рассматривается ниже, биопленки вызывают значительные коммерческие, промышленные и медицинские проблемы, в части инфекций, заражения, загрязнения и повреждения, и, таким образом, настоящее изобретение обеспечивает значительное преимущество в обеспечении возможности или облегчения борьбы с такими биопленками, включая как уменьшение или предупреждение их образования, так и перевод их в состояние более чувствительное к удалению или уменьшению, например более чувствительное к действию противомикробных агентов (включая дезинфицирующие средства или антибиотики) или же, в случае инфекции, к иммунному ответу инфицированного хозяина. Таким образом, может быть усилена эффективность противомикробных агентов как терапевтических, так и нетерапевтических и включая, в частности, антибиотики.

Биопленки обнаруживаются повсеместно на большом множестве поверхностей или поверхностей раздела (например, поверхности раздела вода/твердое вещество и вода/газ (например, вода/воздух)), если существуют условия, способствующие микробной колонизации. По существу биопленка будет образовываться повсюду, где присутствуют микроорганизмы и поверхность раздела или поверхность, в частности поверхность, подвергающаяся воздействию воды или влажности, и биопленки в настоящее время признаны в качестве естественного состояния микробного роста на таких поверхностях или поверхностях раздела. В сущности, как отмечалось выше, биопленка представляет собой комплекс и организованное расположение микробных колоний на поверхности, или на поверхности раздела, которое может иметь место, в частности, в присутствии воды или влажности. Организация таких колоний является результатом способности микроорганизмов продуцировать организованную внеклеточную матрицу, в которую «внедрены» клетки. Такая матрица образуется из биополимеров, продуцируемых микроорганизмами, причем основным полимером являются полисахариды.

Микроорганизмы в биопленочном сообществе проявляют свойства на клеточном уровне (фенотип), которые не имеют их планктонные (свободноплавающие) эквиваленты. Действительно, полагают что микроорганизмы в биопленке сильно отличаются от планктонных свободноплавающих клеток. Дополнительные различия также можно наблюдать на уровне сообщества, и они относятся к эффектам внеклеточной матрицы. Возможно, наиболее примечательным является обычно наблюдаемое явление, что микроорганизмы в биопленочном окружении не проявляют такой же чувствительности к противомикробным агентам, например антибиотикам, противогрибковым и бактерицидным средствам, и иммунной защите хозяина или механизмам очистки. Считается, что данная устойчивость обусловлена барьерным эффектом внеклеточной матрицы и/или фенотипическим изменением в самих микроорганизмах. Например, когда образуются биопленки, антитела более не связываются с микроорганизмами (например, бактериями) в биопленке. Эксперименты показали, что антитела плотно покрывают биопленку снаружи, но их нет в самой биопленке. Исследования активности лейкоцитов против биопленок продемонстрировали похожие результаты. Токсинообразование также может отличаться у планктонного микроорганизма и его эквивалента, находящегося в биопленочной колонии, наводя на мысль о фенотипических изменениях у микроорганизмов. Кроме того, полагают, что микроорганизмы в биопленках могут расти медленнее и в результате медленнее поглощать противомикробные агенты.

Биопленки легко образуются на водных окружающих поверхностях и сформировавшаяся микробная колония на любой поверхности, подверженной действию воды (любая "влажная" поверхность), будет почти обязательно существовать в виде биопленочной структуры. Кроме того, в настоящее время становится очевидным и во все большей степени задокументировано, что биопленки также могут образовываться в случае микробных инфекций, то есть внутри инфицированного хозяина или на нем. Таким образом образование биопленок также может иметь место на "физиологической" или "биологической" поверхности, то есть на живой или биотической поверхности, или поверхности на инфицированном организме-хозяине или в нем (например, человека или животном субъекте, отличном от человека), например на внутренней или внешней поверхности организма или ткани. Во все большей степени считается, что такое образование биопленки (или инфекция) на тканях организма участвует в различных инфекционных заболеваниях, включая, например, врожденный эндокардит сердечного клапана (митральный, аортальный, правый атриовентикулярный, легочный сердечные клапаны), острый средний отит (среднее ухо), хронический бактериальный простатит (простата), муковисцидоз (легкие), пневмонию (дыхательные пути), периодонтит (ткани, поддерживающие зубы, например десна, периодонтальная связка, альвеолярная кость). Конечно, обе эти биопленочные ниши присутствуют при имплантации медицинских устройств, и образование биопленки на таких имплантированных ("встроенных") устройствах может вызвать клинические проблемы с инфекцией на таких участках, такой как эндокардит искусственного клапана и инфекция, связанная с устройством, например с внутриматочными устройствами, контактными линзами, протезами (например, протезным суставам), и в участках катетеризации, например при наличии центрального венозного или мочевого катетеров.

Значительная проблема и риск при наличии таких биопленочных инфекций заключаются в том, что микроорганизмы (или более конкретно микроколонии) могут оторваться или отделиться от биопленки и проникнуть в другие ткани, включая в значительной мере кровообращение. Такие циркулирующие микроорганизмы из биопленки могут быть причиной дополнительных инфекций и вызывать значительные клинические проблемы, особенно в виду того, что отделившиеся циркулирующие микроорганизмы могут иметь все характеристики устойчивости родительского сообщества.

Биопленочная инфекция обычно развивается постепенно, и явные симптомы могут проявляться медленно. Однако, после образования биопленки, как отмечалось выше, трудны для очищения, и биопленочная инфекция обычно является устойчивой и редко разлагается посредством иммунитета хозяина или иммунных механизмов даже у лиц со здоровыми врожденными и адаптивными иммунными ответами. Активные хозяйские ответы в действительности могут быть губительными, например клеточно-опосредованный иммунитет (например, инвазивные нейтрофилы) может вызывать сопутствующее повреждение соседней здоровой ткани хозяина. Биопленочные инфекции реагируют только кратковременно на терапию антибиотиками. Таким образом, в то время как планктонные микробные клетки могут быть ликвидированы с помощью антител или фагоцитов и они более чувствительны к противомикробным средствам, микроорганизмы в биопленках проявляют устойчивость к антителам, фагоцитам и противомикробным средствам. Фагоциты прикрепляются к биопленке, но фагоцитоз не завершается. Фагоцитарные ферменты однако высвобождаются и могут повреждать ткань вокруг биопленки. Планктонные бактерии могут высвобождаться из биопленки, и такое высвобождение может вызывать их распространение и острую инфекцию в соседней ткани.

Поверхности организма или ткани, которые являются погибшими или поврежденными (например, некротические или воспаленные), особенно подвержены биопленочной инфекции. Раны являются подверженными инфекции, и в ранах, которые за короткое время не зажили, может иметь место образование биопленки. Раны являются идеальной средой для образования биопленок вследствие их подверженности бактериальной колонизации, доступности субстрата и поверхности для прикрепления биопленки. Проблематично то, что инфицирование раны часто дополнительно задерживает заживление и таким образом делает рану более подверженной образованию биопленки и образовавшейся инфекции. Раны, заживление которых задерживается (так называемые хронические раны), являются объектами особого внимания в отношении образования биопленки. Хроническая рана находится в воспалительном состоянии, с повышенными уровнями провоспалительных цитокинов. Эффектом таких цитокинов является создание области скопления иммунных клеток (нейтрофилов и макрофагов). Если такая система защиты из-за чего-либо запаздывает (как в хронических ранах), бактерии или другие микроорганизмы имеют время, чтобы прикрепиться к поверхности и войти в биопленочную стадию роста. Все больше растут свидетельства того, что как хронические, так и кратковременные раны могут являться областями биопленочной инфекции, с доказательством присутствия разнообразных микробных сообществ или популяций в ранах, особенно в хронических ранах, включая анаэробные бактерии в хронических ранах. Хронические раневые инфекции имеют два общих важных признака с другими биопленочными инфекциями: устойчивую инфекцию, которая не устраняется иммунной системой хозяина даже у лиц со здоровыми врожденными и адаптивными иммунными реакциями, и повышенную устойчивость к системным и местным противомикробным агентам. Таким образом, биопленочную инфекцию очень трудно лечить и биопленочное заражение очень трудно ликвидировать. Частая санация является одним из наиболее клинически эффективных лечений для облегчения заживления хронических ран. Это представляет собой эффективное лечение отчасти в виду того, что оно физически удаляет биопленку из раны. Это похоже, в принципе, на разрушение инфекций из колонизированных биопленками медицинских устройств «введенного» (например, катетеров), где антибиотическая терапия является неэффективной, наиболее эффективный подход представляет собой удаление или замена инфицированного биопленкой устройства.

Хронические раны представляют собой значительную проблему для здоровья во всем мире и требуют значительного расхода клинических ресурсов. Три основных типа хронических ран представляют собой язвы диабетической стопы, язвы венозных ног и пролежни, хотя и другие раны, включая хирургические раны, могут стать хроническими. Уход за такими ранами требует огромных материальных затрат и терпения, и вследствие этого эффективное антибиопленочное лечение или фактически любое лечение, которое содействует или облегчает лечение биопленок и таким образом ускоряет или облегчает заживление раны, будет иметь большое значение.

В более широком смысле, при таком широком распространении биопленок и медицинских, связанных с окружающей средой, промышленных или других коммерческих проблем, которые они вызывают, любые способы улучшения или облечения борьбы с биопленкам будут очень важными как с клинической, так и с коммерческой точки зрения.

Следовательно, существует потребность в новых способах борьбы с биопленкам как в клинических, так и в промышленных или коммерческих ситуациях, и настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой потребности.

В частности, и как отмечалось выше, было обнаружено, что конкретный класс альгинатов, а именно некоторые альгинатные олигомеры, является эффективным в качестве антибиопленочных агентов. Альгинатные олигомеры могут взаимодействовать с внеклеточными полимерами биопленки и тем самым ослаблять ее, делая возможным или облегчая ее удаление или разрушение (или деструкцию), и/или облегчая доступ к биопленке противомикробных агентов, тем самым усиливая их эффективность против биопленки. Таким образом, согласно настоящему изобретению предлагается новый способ или средства борьбы с биопленкой, включающие использование альгинатных олигомеров.

Альгинаты представляют собой линейные полимеры (1-4)-связанной β-D-маннуроновой кислоты (М) и/или ее С5-эпимера, α-L-гулуроновой кислоты (G). Первичная структура альгинатов может значительно варьироваться. Остатки М и G могут быть организованы в виде гомополимерных блоков соседних М или G остатков, в виде блоков чередующихся М- и G-остатков и в промежутках таких блочных структур можно обнаружить единичные М- или G- остатки. Молекула альгината может содержать некоторые или все такие структуры, и такие структуры могут быть неравномерно распределены по всему полимеру. В предельном случае существует гомополимер гулуроновой кислоты (полигулуронат) или гомополимер маннуроновой кислоты (полиманнуронат).

Альгинаты были выделены из морских бурых водорослей (например некоторых видов Durvillea, Lessonia и Laminaria) и бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandii. Другие псевдомонады (например, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida и Pseudomonas mendocina) сохраняют генетическую способность продуцировать альгинаты, но в природе они не продуцируют обнаруживаемых уровней альгината. Посредством мутации такие непродуцирующие псевдомонады можно побудить вырабатывать стабильно большие количества альгината.

Альгинат синтезируется в виде полиманнуроната, и G-остатки образуются под действием эпимераз (особенно С5-эпимераз) на М-остатки в полимере. В случае альгинатов, экстрагированных из водорослей, G-остатки в основном организованы в виде G-блоков, так как ферменты, вовлеченные в биосинтез альгината в водорослях, преимущественно вводят G в соседнее положение с другим G, таким образом превращая участки М-остатков в G-блоки. Понимание таких биосинтетических систем позволяет продуцировать альгинаты с конкретными первичными структурами (WO 94/09124, Gimmestad, М et al, Journal of Bacteriology, 2003, Vo1 185(12) 3515-3523 и WO 2004/011628).

Альгинаты обычно выделяют из естественных источников в виде больших высокомолекулярных полимеров (например, средняя молекулярная масса в интервале от 300000 до 500000 Да). Известно, однако, что такие большие альгинатные полимеры могут быть разрушены или расщеплены, например, посредством химического или ферментного гидролиза с получением альгинатных структур с меньшей молекулярной массой. Альгинаты, которые используются в промышленном масштабе, обычно имеют среднюю молекулярную массу в интервале от 100000 до 300000 Да (то есть такие альгинаты все еще считаются большими полимерами), хотя и альгинаты со средней молекулярной массой приблизительно 35000 Да использовали в фармацевтических средствах.

Было обнаружено, что альгинатные олигомеры способны влиять на внеклеточную матрицу биопленок. Без желания быть связанным какой-либо конкретной теорией полагают, что такое влияние вызывает разрушение внеклеточной матрицы биопленки, и это, таким образом, приводит к физической деструкции биопленки. Кроме того, разрушение усиливает воздействие на микроорганизмы в биопленке (или их иммуногенные компоненты, например LPS и пептидогликановые структуры) иммунной защиты инфицированного хозяина и/или каких-либо противомикробных агентов, которые применялись или будут применяться. Кроме того, разрушение уменьшает тесную связь между внеклеточной матрицей и микроорганизмами, и это приводит к увеличению чувствительности микроорганизма к противомикробным агентам на фенотипическом уровне.

Таким образом, в изобретении предложен способ борьбы с биопленкой, включающий взаимодействие указанной биопленки с альгинатным олигомером.

Как отмечалось выше, альгинаты обычно существуют в виде полимеров со средней молекулярной массой по меньшей мере 35000 Да, то есть приблизительно 175-190 мономерных остатков, хотя обычно гораздо более высокой, и альгинатный олигомер по настоящему изобретения можно определить как вещество, полученное фракционированием (то есть уменьшением размера) альгинатного полимера, обычно природного альгината. Альгинатный олигомер можно рассматривать как альгинат со средней молекулярной массой менее 35000 Да (то есть менее чем приблизительно 190 или менее 175 мономерных остатков), в частности альгинат со средней молекулярной массой менее 30000 Да (то есть менее чем приблизительно 175 или менее 150 мономерных остатков), более конкретно со средней молекулярной массой менее 25000 или 20000 Да (то есть менее чем приблизительно 135 или 125 мономерных остатков или менее чем приблизительно 110 или 100 мономерных остатков).

Альтернативно, олигомер в основном содержит 2 или более единицы или остатка, и альгинатный олигомер для применения по изобретению обычно содержит от 2 до 100 мономерных остатков, предпочтительно от 2 до 75, предпочтительно от 2 до 50, более предпочтительно от 2 до 40, от 2 до 35 или от 2 до 30, то есть альгинатный олигомер для применения по изобретению обычно имеет среднюю молекулярную массу от 350 до 20000 Да, предпочтительно от 350 до 15000 Да, предпочтительно от 350 до 10000 Да и более предпочтительно от 350 до 8000 Да, от 350 до 7000 Да или от 350 до 6000 Да.

Альтернативно, альгинатный олигомер может иметь степень полимеризации (DP), или среднечисловую степень полимеризации (DPn) от 2 до 100, предпочтительно от 2 до 75, предпочтительно от 2 до 50, более предпочтительно от 2 до 40, от 2 до 35 или от 2 до 30.

Как указано выше, биопленки обычно образуются на поверхностях или поверхностях раздела, и биопленка, которую обрабатывают согласно настоящему изобретению, может находиться на любой поверхности или поверхности раздела. Таким образом, в способе по изобретению биопленка может находиться на любой живой или неживой (или биотической или абиотической) поверхности, то есть на любой живой поверхности или поверхности, происходящей из живого вещества (например, мертвой или поврежденной ткани, например некротической ткани), (термин "живой" используют в данном описании изобретения как включающий любую живую поверхность или любую поверхность, происходящую из живого вещества, в частности живую поверхность, которая умерла), или любой инертной или неживой поверхности (поверхности, которая в прошлом не была живой или оживленной).

Термин "приведение в контакт" охватывает любые способы доставки альгинатного олигомера к биопленке, как непосредственно, так и косвенно, и таким образом любые способы нанесения альгинатного олигомера на биопленку или подвергание биопленки воздействию альгинатного олигомера, например нанесение альгинатного олигомера непосредственно на биопленку, или введение альгинатного олигомера субъекту с биопленочной инфекцией. Следовательно, следует понимать, что включены как in vitro, так и in vivo способы.

Более конкретно биопленка будет контактировать с эффективным количеством альгинатного олигомера, более конкретно с количеством альгинатного олигомера, эффективным для борьбы с биопленкой.

Альгинатный олигомер, как отмечалось выше, включает (или содержит) остатки или единицы гулуроната или гулуроновой кислоты (G), и/или маннуроната или маннуроновой кислоты (М). Альгинатный олигомер по изобретению предпочтительно состоит из одних или по существу одних (то есть по существу состоит из них) остатков уроната/урониевой кислоты, более конкретно одних или по существу одних G и/или М-остатков. Выражаясь альтернативно, в альгинатном олигомере для применения в настоящем изобретении по меньшей мере 80%, более конкретно по меньшей мере 85, 90, 95 или 99% мономерных остатков, могут представлять собой остатки уроната/урониевой кислоты, или, более конкретно, G- и/или М-остатки. Другими словами, предпочтительно альгинатный олигомер не содержит другие остатки или единицы (например, другие сахаридные остатки, или, более конкретно, другие остатки урониевой кислоты/уроната).

Альгинатный олигомер предпочтительно представляет собой линейный олигомер.

Более конкретно, в предпочтительном воплощении по меньшей мере 30% мономерных остатков альгинатного олигомера представляют собой G-остатки (то есть гулуронат или гулуроновую кислоту). Другими словами, альгинатный олигомер содержит по меньшей мере 30% остатков гулуроната (или гулуроновой кислоты). Конкретные воплощения, таким образом, включают альгинатные олигомеры (например, содержащие) от 30 до 70% G-(гулуронатных) остатков или от 70 до 100% G (гулуронатных) остатков. Таким образом, типичный альгинатный олигомер для применения по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере 70% G-остатков (то есть по меньшей мере 70% мономерных остатков альгинатного олигомера являются G-остатками).

Предпочтительно по меньшей мере 60%, более конкретно по меньшей мере 70% или 75%, еще более конкретно по меньшей мере 80, 85, 95 или 99% мономерных остатков представляют собой гулуронат. В одном воплощении альгинатный олигомер может представлять собой олигогулуронат (то есть гомоолигомер G или 100% G)

В еще одном предпочтительном воплощении описанные выше альгинаты по изобретению имеют первичную структуру, где большинство G-остатков находятся в так называемых G-блоках, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70 или 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% единичных G-остатков находятся в G-блоках. G-блок представляет собой непрерывную последовательность из по меньшей мере двух G-остатков, предпочтительно по меньшей мере 3 соседних G-остатков, более предпочтительно по меньшей мере 4 или 5 соседних G-остатков, наиболее предпочтительно по меньшей мере 7 соседних G-остатков.

В частности по меньшей мере 90% G-остатков соединены связью 1-4 с другим G-остатком. Более конкретно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% G-остатков альгината соединены связью 1-4 с другим G-остатком.

Альгинатный олигомер для применения по изобретения предпочтительно является 3-35-мерным, более предпочтительно 3-28-мерным, в частности 4-25-мерным, особенно 6-22-мерным, в частности 8-20-мерным, особенно 10-15-мерным, например имеющим молекулярную массу в интервале от 350 до 6400 Да или от 350 до 6000 Да, предпочтительно от 550 до 5500 Да, предпочтительно от 750 до 5000 Да и особенно от 750 до 4500 Да.

Он может представлять собой одно соединение или может представлять собой смесь соединений, например с интервалом степеней полимеризации. Как отмечалось выше, мономерные остатки в альгинатном олигомере могут быть одинаковыми или разными, и не все должны нести электрически заряженные группы, хотя предпочтительно, чтобы большинство (например,по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%) несло их. Предпочтительно, чтобы существенное большинство, например по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% заряженных групп имели одинаковую полярность. В альгинатном олигомере отношение гидроксильных групп к заряженным группам предпочтительно составляет по меньшей мере 2:1, более конкретно по меньшей мере 3:1.

Альгинатный олигомер по изобретениюможет иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DP_n) 3-28, 4-25, 6-22, 8-20 или 10-15, или от 5 до 18, или от 7 до 15, или от 8 до 12, особенно 10.

Распределение молекулярной массы предпочтительно такое, при котором не более 5 мол.% имеют DP в два раза выше соответствующего верхнего предела для DP_n. Аналогично, предпочтительно, чтобы не более 5 мол.% имело DP ниже числа в два раза меньшего соответствующего нижнего предела для DP_n. Подходящие альгинатные олигомеры описаны в WO 2007/039754, WO 2007/039760 и WO 2008/125828, описания которых прямо включены посредством ссылки в данное описание изобретения во всей их полноте.

Типичные подходящие альгинатные олигомеры имеют DP_n в интервале 5-30, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80, фракцию маннуроната (F_м) не более 0,20 и по меньшей мере 95 мол.% с DP не более 25.

Кроме того, подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 7-15 (предпочтительно 8-12), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,85 (предпочтительно по меньшей мере 0,90), фракцию маннуроната (F_м) не более 0,15 (предпочтительно не более 0,10) и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 17 (предпочтительно менее 14).

Кроме того, подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 5-18 (особенно 7-15), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80 (предпочтительно по меньшей мере 0,85, особенно по меньшей мере 0,92), фракцию маннуроната (F_м) не более 0.20 (предпочтительно не более 0,15, особенно не более 0,08) и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 20 (предпочтительно менее 17).

Кроме того, подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 5-18, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,92, фракцию маннуроната (F_м) не более 0,08 и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 20. Кроме того, подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 5-18 (предпочтительно 7-15, более предпочтительно 8-12, особенно примерно 10), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80 (предпочтительно по меньшей мере 0,85, более предпочтительно по меньшей мере 0,90, в частности по меньшей мере 0,92, особенно по меньшей мере 0,95), фракцию маннуроната (F_м) не более 0,20 (предпочтительно не более 0,15, более предпочтительно не более 0,10, в частности не более 0,08, особенно не более 0,05) и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 20 (предпочтительно менее 17, более предпочтительно менее 14).

Кроме того, подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 7-15 (предпочтительно 8-12), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,92 (предпочтительно по меньшей мере 0,95), фракцию маннуроната (F_м) не более 0,08 (предпочтительно не более 0,05) и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 17 (предпочтительно менее 14).

Кроме того? подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 5-18, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80, фракцию маннуроната (F_м) не более 0,20 и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 20.

Кроме того,подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 7-15, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,85, фракцию маннуроната (F_м) не более 0,15 и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 17.

Кроме того, подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в интервале 7-15, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,92, фракцию маннуроната (F_м) не более 0,08 и имеют по меньшей мере 95 мол.% со степенью полимеризации менее 17.

Альгинатный олигомер обычно несет заряд и, следовательно, противоионы для альгинатного олигомера могут представлять собой любой физиологически приемлемый ион, особенно те, которые обычно используют для заряженных лекарственных веществ, например натрий, калий, аммоний, хлорид, мезилат, меглумин и так далее. Также можно использовать ионы, которые способствуют гелеобразованию альгината, например ионы металлов 2 группы.

Хотя альгинатный олигомер может представлять собой синтетическое вещество, образованное полимеризацией подходящего количества остатков гулуроната и маннуроната, альгинатные олигомеры для применения по изобретению можно удобно получать, продуцировать или производить из естественных источников, таких как источники, указанные выше, а именно вещества - источники природного альгината.

Расщепление полисахарида до олигосахарида для получения альгинатного олигомера, используемого согласно настоящему изобретению, можно выполнять используя обычные методы лизиса полисахаридов, такие как ферментативное расщепление и кислотный гидролиз. Затем олигомеры можно хроматографически отделить от продуктов разрушения полисахаридов, используя ионообменную смолу или посредством фракционного осаждения, или солюбилизации, или фильтрации. В US 6121441 и WO 2008/125828, которые прямо включены посредством ссылки в данное описание изобретения во всей их полноте, описан способ, подходящий для получения альгинатных олигомеров для применения по изобретению. Дополнительную информацию и обсуждение можно найти, например, в "Handbooks of Hydrocolloids", Ed. Phillips и Williams, CRC, Boca Raton, Florida, USA, 2000, которое прямо включено в данное описание изобретения посредством ссылки во всей его полноте.

Альгинатные олигомеры также могут быть химически модифицированными, включая, но не ограничиваясь модификацией для добавления заряженных групп (таких как карбоксилированные или карбоксиметилированные гликаны), и альгинатные олигомеры, модифицированные с целью изменения пластичности (например, с помощью окисления периодатом).

Альгинатные олигомеры (например, олигогулуроновые кислоты), подходящие для применения по изобретению, можно удобно получать посредством кислотного гидролиза альгиновой кислоты из Laminaria hyperbora и Lesson/a nigrescens, но не ограничиваясь ими, путем растворения при нейтральном рН, добавления неорганической кислоты для снижения рН до 3,4 для осаждения альгинатного олигомера (олигогулуроновой кислоты), промывания слабой кислотой, ресуспендирования при нейтральном рН и сушки вымораживанием.

Альгинаты для получения альгинатных олигомеров по изобретению также могут быть получены непосредственно из подходящих бактериальных источников, например Pseudomonas aeruginosa или Azotobacter vinelandii, хотя ожидается, что водорослевые источники являются наиболее подходящими в связи с тем, что альгинаты, продуцируемые этими организмами, обычно имеют первичные структуры, в которых большинство G-остатков организованы в G-блоки, а не находятся в виде отдельных остатков.

Был клонирован и описан молекулярный аппарат, участвующий в биосинтезе альгината у Pseudomonas fluorescens и Azotobacter vinelandii (WO 94/09124; Ertesvag, H., et al., Metabolic Engineering, 1999, Vol. 1, 262-269; WO 2004/011628; Gimmestad, M., et al (смотри выше); Remminghorst and Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol. 28, 1701-1712; Gimmestad, M. et al., Journal of Bacteriology, 2006, Vol. 188(15), 5551-5560), и альгинаты с заданными первичными структурами могут быть легко получены посредством управления такими системами.

Содержание G в альгинатах (например, веществе - источнике альгината) можно увеличить посредством эпимеризации, например с помощью С5-эпимераз маннурана из A.vinelandii или других эпимеразных ферментов. Таким образом, например, эпимеризацию in vitro можно выполнять с помощью эпимераз, выделенных из Pseudomonas или Azotobacter, например AlgG из Pseudomonas fluorescens или Azotobacter vinelandii, или ферментов AlgE (от AlgE1 до AlgE7) из Azotobacter vinelandii. Использование эпимераз из других организмов, которые обладают способностью продуцировать альгинат, в частности водорослей, также конкретно рассмотрено. In vitro эпимеризация альгинатов с низким содержанием G при помощи AlgE эпимераз Azotobacter vinelandii подробно описана в Ertesvag et al. (смотри выше) и Strugala et al. (Gums and Stabilisers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84-94). Предпочтительной является эпимеризация при помощи одной или более эпимераз AlgE Azotobacter vinelandii, отличных от AlgE4, так как данные ферменты способны продуцировать G-блочные структуры. Мутантные варианты или гомологи из других организмов также специально рассмотрены как полезные для применения. В WO 94/09124 описаны рекомбинантные или модифицированные ферменты С5-эпимеразы маннуронана (ферменты AlgE), например кодируемые эпимеразными последовательностями, в которых последовательности ДНК, кодирующие разные домены или модули эпимераз, были перемещены или удалены и рекомбинированы. Альтернативно, можно использовать мутанты природных эпимеразных ферментов (AlgG или AlgE), полученные например посредством сайт-направленного или случайного мутагенеза генов AlgG или AlgE.

Другим подходом является создание организмов Pseudomonas и Azotobacter, которые подвергнуты мутации в некоторых или всех их эпимеразных генах таким образом, чтоб эти мутанты продуцируют альгинаты с требуемой структурой продукта альгинатного олигомера, или даже альгинатные олигомеры с требуемой структурой и размером (или молекулярной массой). Создание ряда организмов Pseudomonas fluorescens с мутантными генами AlgG подробно описано в WO 2004/011628 и Gimmestad, M., et al., 2003 (смотри выше). Создание ряда организмов Azotobacter vinelandii с мутантными генами AlgE раскрыто в Gimmestad, M., et al., 2006 (смотри выше). Специалист может использовать данное руководство для создания новых мутантов, которые могли бы вырабатывать альгинатные олигомеры по изобретению без больших издержек.

Еще один подход состоит в удалении или инактивации эндогенных эпимеразных генов из организма Azotobacter или Pseudomonas и затем введения одного или более экзогенных эпимеразных генов, которые могут быть или могут не быть мутированными (то есть могут быть дикого типа или модифицированными) и экспрессию которых можно контролировать, например, путем использования индуцибельных или других "управляемых промоторов". Выбирая подходящие комбинации генов, можно продуцировать альгинаты с заданной первичной структурой.

Еще одним подходом может стать введение некоторого или всех механизмов биосинтеза альгината у Pseudomonas и/или Azotobacter в непродуцирующий альгинат организм (например, Е соli) и индукция продуцирования альгината этими генетически модифицированными организмами.

При использовании таких систем на основе культуры на первичную структуру альгината или альгинатного олигомера можно оказывать влияние с помощью условий культивирования. В рамках квалификации специалиста можно скорректировать параметры культивирования, такие как температура, осмолярность, уровни/источники питательных веществ и атмосферные параметры, чтобы манипулировать первичной структурой альгинатов, продуцируемых конкретным организмом.

Ссылки на "С-остатки/О" и "М-остатки/М", или на гулуроновую кислоту, или маннуроновую кислоту, или гулуронат, или маннуронат следует понимать взаимозаменяемо как ссылки на гулуроновую кислоту/гулуронат и маннуроновую кислоту/маннуронат (конкретно α-L-гулуроновую кислоту/гулуронат и P-D- маннуроновую кислоту/маннуронат) и также включают их производные, в которых одна или более из доступных боковых цепей или групп была модифицирована, не приводя к тому, что антибиопленочная активность становится по существу ниже, чем у немодифицированного полимера. Обычные группы, модифицирующие сахарид, могут включать группы ацетил, сульфат, амино, дезокси, спиртовые, альдегидные, кетонные, эфирные и ангидро. Альгинатный олигомеры также можно химически модифицировать с целью добавления заряженных групп (таких как карбоксилированные или карбоксиметилированные гликаны) и для изменения пластичности (например, с помощью окисления периодатом). Специалисту известны дополнительные химические модификации, которые можно осуще