Способ и набор для детекции микроорганизмов

Способ и набор для детекции микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу и набору для детекции микроорганизмов, содержащихся в продуктах питания, биологических образцах и образцах окружающей среды, например образцах промышленных вод и водопроводной воды. Конкретно, настоящее изобретение относится к способу и набору для детекции микроорганизмов, которые обеспечивают селективную детекцию жизнеспособных клеток микроорганизмов, содержащихся в продуктах питания, биологических образцах, мазках и образцах окружающей среды, таких как промышленные воды и водопроводная вода.

Предшествующий уровень техники

Как правило, для определения общего количества жизнеспособных бактерий в продуктах питания, биологических образцах, мазках или образцах окружающей среды используют способ культуры на твердой среде. Однако в случае способа культуры на твердой среде для получения результата требуется приблизительно от двух суток до одного месяца.

В результате улучшения способов стерилизации и способов обработки продуктов питания возрастает необходимость различать жизнеспособное состояние микроорганизмов, находящихся в тестируемых образцах, от мертвого состояния микроорганизмов даже для случаев, когда клетки существуют в невероятно низком количестве. В областях санитарной проверки продуктов питания и клинического тестирования, в частности в качестве быстрого способа детекции бактерий, предпринимались попытки определить присутствие или отсутствие бактерий или количество бактерий с помощью амплификации генов, специфичных для бактерий, посредством ПЦР до такого количества, что эти гены можно наблюдать визуально. Однако если целью является бактериальная ДНК, также определяют фон из мертвых клеток, исходно содержащихся в тестируемом образце и, таким образом, положительный результат, получаемый посредством ПЦР, не обязательно означает присутствие жизнеспособных бактерий. Таким образом, текущая ситуация в областях пищевой санитарии и клинического тестирования такова, что ПЦР широко не используется, хотя она представляет собой высокочувствительный и быстрый способ.

В настоящее время предпринимаются попытки детектировать и определить количество в тестируемом образце только жизнеспособных клеток микроорганизмов, получая кДНК с использованием обратной транскриптазы с мРНК в качестве мишени и проводя ПЦР с праймерами, специфичными для различных бактерий. Однако в этом способе нет препятствий для обратной транскрипции мРНК погибших клеток, и когда в тестируемом образце содержится 10⁴ КОЕ/мл или 10⁴ КОЕ/г или более погибших клеток, детектируют фон погибших клеток. Таким образом, нельзя сказать, что этого способа достаточно в качестве способа определения жизнеспособного и мертвого состояний.

В частности, в качестве способа различения жизнеспособного состояния и мертвого состояния микроорганизмов, таких как бактерии, с использованием способа ПЦР, предоставлены способы, описанные в патентном документе 1 и 2. Однако в этих способах различения жизнеспособного и мертвого состояния микроорганизмов, таких как бактерии, с использованием способа ПЦР указанные ниже проблемы остаются.

В качестве способа, описанного в патентном документе 1, указаны примеры различения погибших клеток, содержащихся в кипяченых продуктах питания, подвергаемых долговременной температурной стерилизации при 100°C в течение от 10 до 30 минут, и микроорганизмов, содержащихся в продуктах питания, подвергаемых стерилизации этанолом или формальдегидом. Однако, особенно для обработки последнего типа, продуктов питания, в действительности подвергаемых пастеризационной обработке такого типа, не существует. Кроме того, не существует предполагаемого способа детекции только жизнеспособных микроорганизмов в продуктах питания, подвергаемых основным современным способам стерилизации в пищевой промышленности, низкотемпературной долговременной пастеризации (пастеризация LTLT), высокотемпературной кратковременной пастеризации (пастеризация HTST) или ультравысокотемпературной пастеризации (пастеризация UHT) и способа детекции только жизнеспособных специфических патогенных бактерий в клинических образцах у пациентов с инфекционными заболеваниями, которым вводят антибиотики. Кроме того, в случае тестируемого образца продукта питания или клинического образца, содержащего фон погибших клеток в концентрации 10⁴ КОЕ/мл или выше, количества конечных продуктов амплификации ПЦР, получаемые от погибших клеток, превосходят предел детекции способа по патентному документу 1, и, таким образом, определить получен ли положительный ответ в тестируемом образце, получаемом посредством ПЦР, от жизнеспособных клеток или погибших клеток невозможно.

Кроме того, в качестве способа по патентному документу 2 описан способ различения жизнеспособных клеток и погибших клеток с использованием относительного снижения молярного отношения РНК/ДНК погибших клеток по сравнению с молярным отношением РНК/ДНК жизнеспособных клеток. В этом способе выделяют тотальную РНК, получают комплементарную ДНК с использованием реакции обратной транскрипции, затем проводят ПЦР для расчета ее значения Ct и с использованием отдельно полученной калибровочной кривой получают молярную концентрацию РНК. Отдельно посредством ПЦР амплифицируют область хромосомной ДНК, соответствующую области РНК с получением ее значения Ct, и рассчитывают молярную концентрацию хромосомной ДНК на основе калибровочной кривой, получая молярное отношение РНК/ДНК. То есть указанный выше способ требует проведения сложного выделения тотальной РНК и использования двух стадий реакции обратной транскрипции и ПЦР. Таким образом, этот способ по эффективности и скорости количественного анализа хуже обычной ПЦР на основе ДНК. Кроме того, РНК в жизнеспособных клетках непрерывно синтезируется, тогда как РНК, получаемая из погибших клеток, разрушается с течением времени на ранней стадии. Таким образом, в этом способе отсутствует стабильность. Кроме того, этим способом в продукте питания или клиническом образце, содержащих погибшие клетки с высокой концентрацией, можно детектировать только 1/10 жизнеспособных клеток от этой концентрации. Таким образом, этот способ в областях санитарной проверки продуктов питания и клинического тестирования, где необходима скорость, высокая чувствительность и точность, использовать трудно.

В патентном документе 3 описан способ селективной детекции жизнеспособных клеток (жизнеспособные-и-культивируемые клетки) микроорганизмов посредством различения их с погибшими клетками и поврежденными клетками (жизнеспособные-но-некультивируемые клетки (клетки VNC)). Способ, описываемый в патентном документе 3, представляет собой способ, включающий стадию обработки тестируемого образца ингибитором топоизомеразы и/или ингибитором ДНК-гиразы, стадию выделения ДНК из тестируемого образца и амплификации области-мишени выделенной ДНК посредством ПЦР и стадию анализа продукта амплификации, и в качестве примера ингибитора топоизомеразы или ингибитора ДНК-гиразы приведен моноазид этидия.

Способ, в котором используют моноазид этидия, также описан в непатентном документе 1. Этот способ представляет собой способ, включающий стадию добавления в тестируемый образец моноазида этидия и облучения образца светом, стадию выделения ДНК из образца после облучения и стадию амплификации конкретной области посредством ПЦР с использованием выделенной ДНК в качестве матрицы. Кроме того, в непатентном документе 1 описан способ полуколичественного определения количества жизнеспособных клеток посредством комбинирования культивирования микроорганизмов и ПЦР с детекцией в реальном времени.

Кроме того, в качестве способа для еще более четкого различения жизнеспособных клеток и поврежденных клеток микроорганизмов описан способ, описанный в патентном документе 4. Этот способ представляет собой способ, включающий стадию добавления сшивающего линкера, способного к образованию поперечных сшивок ДНК при облучении тестируемого образца светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм, стадию облучения тестируемого образца, в который добавляют сшивающий линкер светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм, стадию удаления сшивающего линкера, содержащегося в тестируемом образце, облученном светом, стадию добавления в тестируемый образец, из которого удаляют сшивающий линкер, среды и инкубации тестируемого образца, стадию повторного добавления к инкубируемому тестируемому образцу сшивающего линкера, способного к образованию поперечных сшивок ДНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм, стадию облучения тестируемого образца, в который добавляют сшивающий линкер, светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм, стадию выделения ДНК из тестируемого образца и амплификации области-мишени выделенной ДНК способом амплификации нуклеиновых кислот и стадию анализа продукта амплификации.

При этом допускается возможность, что при амплификации нуклеиновых кислот посредством ПЦР подавлять активность ингибирования ингибитора ПЦР или способствовать реакциям ПЦР может альбумин (непатентный документ 2). Кроме того, также полагают, что реакции ПЦР ингибирует кальций, но ингибирование ПЦР кальцием можно сделать приемлемым, добавляя ионы магния (непатентный документ 3).

Кроме того, описан способ проведения реакций ПЦР с использованием в качестве матричной бактериальной ДНК, где реакции ПЦР проводят без выделения ДНК из бактерий (непатентный документ 4, патентный документ 5). В патентном документе 5 описано, что в бактериях в способе фингерпринтинга ДНК у бактерий проводят ПЦР с амплификацией случайных последовательностей и в качестве компонентов состава буфера для синтеза нуклеиновой кислоты указаны фосфаты и додецилсульфаты.

Ссылки на известный уровень техники

Патентные документы

Патентный документ 1: Внутренняя выложенная публикация японского перевода заявки PCT (KOHYO) № 2003-530118.

Патентный документ 2: Международная патентная публикация WO2002/052034.

Патентный документ 3: Международная патентная публикация WO2007/094077.

Патентный документ 4: Международная патентная публикация WO2009/022558.

Патентный документ 5: Международная патентная публикация WO2004/104196.

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Rudi, K., et al., Letters in Applied Microbiology, 2005, Vol. 40, pp.301-306.

Непатентный документ 2: Forbes, B. E., et al., Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34 (9), pp.2125-2128.

Непатентный документ 3: Bickley, J., et al., Letter in Applied Microbiology, 1996, 22, pp.153-158.

Непатентный документ 4: Kimberly, A., et al., BioTechniques, 31, 2001, pp.598-607.

Описание изобретения

Задачи, подлежащие решению посредством изобретения

С помощью указанного выше способа с использованием ингибитора топоизомеразы и/или ингибитора ДНК-гиразы или сшивающего линкера можно селективно с высокой чувствительностью детектировать жизнеспособные клетки микроорганизмов, особенно жизнеспособные клетки бактерий Klebsiella, Citrobacter, Listeria, Salmonella и т.д. Однако желателен новый улучшенный способ, особенно способ для высокочувствительной или высокоточной детекции жизнеспособных клеток бактерий Escherichia или Salmonella.

Целью настоящего изобретения является создание нового способа для более селективной детекции жизнеспособных клеток микроорганизмов, содержащихся в продукте питания или в биологическом образце в сравнении с погибшими клетками или поврежденными клетками микроорганизма, и набора для проведения такого способа.

Средства решения задач

Авторы настоящего изобретения провели широкие исследования на способах различения жизнеспособных и погибших микроорганизмов, которые можно использовать в различных способах стерилизации и которые подходят для санитарной проверки продуктов питания с высокой чувствительностью детекции, и на способах детекции специфических патогенов у пациентов с инфекцией в госпитальной и клинической практике. В результате авторы изобретения обнаружили, что высокочувствительное различие может быть достигнуто посредством добавления в тестируемый образец средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм; облучения тестируемого образца светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм; добавления средства для подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, соли магния и соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты и амплификации хромосомной ДНК микроорганизмов из клеток посредством реакции амплификации нуклеиновых кислот. Таким образом, осуществляют настоящее изобретение.

А именно, настоящее изобретение относится к способу детекции жизнеспособных клеток микроорганизмов в тестируемом образце, различая жизнеспособные клетки и погибшие клетки или поврежденные клетки, который включает стадии:

a) добавления в тестируемый образец средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм;

b) облучения тестируемого образца, в который добавляют средство, светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм;

c) амплификации области-мишени ДНК или РНК микроорганизма, содержащегося в тестируемом образце, способом амплификации нуклеиновых кислот в присутствии средства подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, без выделения нуклеиновых кислот из клеток; и

d) анализа продуктов амплификации.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения амплификацию области-мишени проводят в клетках микроорганизмов.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа на указанной выше стадии c) амплификацию области-мишени проводят в присутствии одного или нескольких классов, выбранных из поверхностно-активного вещества, соли магния и соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа перед указанной выше стадией c) повторно проводят стадии a) и b).

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа, перед указанной выше стадий a), проводят следующую стадию e):

e) обработка тестируемого образца ферментом с активностью разрушения клеток, отличных от клеток микроорганизма, коллоидных частиц белка, липидов или сахаридов, присутствующих в тестируемом образце.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа фермент выбран из протеазы, фермента, разрушающего липиды, и фермента, разрушающего сахариды.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа тестируемый образец представляет собой любой из продукта питания, биологического образца, питьевой воды, промышленных вод, воды из окружающей среды, сточных вод, почвы и мазка.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа микроорганизм представляет собой бактерию или вирус.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа бактерия представляет собой грамотрицательную бактерию.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа средство, способное к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм, выбрано из моноазида этидия, диазида этидия, моноазида пропидия, псоларена, 4,5',8-триметилпсоларена и 8-метоксипсоларена.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа средство для подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, состоит из одного или нескольких классов, выбранных из альбумина, декстрана, белка гена 32 T4, ацетамида, бетаина, диметилсульфоксида, формамида, глицерина, полиэтиленгликоля, соевого ингибитора трипсина, α2-макроглобулина, тетраметилхлорида аммония, лизоцима, фосфорилазы и лактатдегидрогеназы.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа соль органической кислоты выбрана из соли уксусной кислоты, соли пропионовой кислоты и соли лимонной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа соль фосфорной кислоты представляет собой соль пирофосфорной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа область-мишень представляет собой область-мишень, содержащую от 50 до 5000 нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа область-мишень представляет собой область-мишень, соответствующую гену, выбранному из гена 5S рРНК, гена 16S рРНК, гена 23S рРНК и гена тРНК ДНК тестируемого образца.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа способ амплификации нуклеиновых кислот представляет собой ПЦР, LAMP, SDA, LCR, TMA, TRC, HC или способ с применением микропанелей.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа ПЦР проводят в виде ПЦР с детекцией в реальном времени с одновременном проведением ПЦР и анализа продукта амплификации.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше способа анализ продуктов амплификации проводят с использованием стандартной кривой, представляющей собой зависимость количества микроорганизмов и продуктов амплификации и полученной с использованием стандартных образцов микроорганизмов.

В качестве набора по настоящему изобретению предоставлен набор для детекции жизнеспособных клеток микроорганизмов в тестируемом образце при различении жизнеспособных клеток и погибших клеток или поврежденных клеток способом амплификации нуклеиновых кислот, содержащий следующие компоненты:

1) средство, способное к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм;

2) средство для подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот; и

3) праймер или праймеры для амплификации области-мишени ДНК или РНК микроорганизма, подлежащего детекции способом амплификации нуклеиновых кислот.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора набор дополнительно содержит один или несколько классов, выбранных из поверхностно-активного вещества, соли магния и соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора набор дополнительно содержит фермент с активностью разрушения клеток, отличных от клеток микроорганизма, коллоидных частиц белка, липидов или сахаридов, присутствующих в тестируемом образце.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора способ амплификации нуклеиновых кислот представляет собой ПЦР, ПЦР-РВ, LAMP, SDA, LCR, TMA, TRC, HC или способ с использованием микропанелей.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора средство, способное к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм, выбрано из моноазида этидия, диазида этидия, моноазида пропидия, псоларена, 4,5',8-триметилпсоларена и 8-метоксипсоларена.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора средство для подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, состоит из одного или нескольких классов, выбранных из альбумина, декстрана, белка гена 32 T4, ацетамида, бетаина, диметилсульфоксида, формамида, глицерина, полиэтиленгликоля, соевого ингибитора трипсина, α2-макроглобулина, тетраметилхлорида аммония, лизоцима, фосфорилазы и лактатдегидрогеназы.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора соль органической кислоты выбрана из соли уксусной кислоты, соли пропионовой кислоты и соли лимонной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора соль фосфорной кислоты представляет собой соль пирофосфорной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления указанного выше набора фермент выбран из протеазы, фермента, разрушающего липиды, и фермента, разрушающего сахариды.

Краткое описание чертежей

[Фиг. 1] Фотографии электрофореза продуктов амплификации ПЦР, полученных способом по настоящему изобретению, "жизнеспособные" означает жизнеспособные клетки, "поврежденные" означает поврежденные клетки.

[Фиг. 2] Фотографии электрофореза, демонстрирующие результаты детекции жизнеспособных клеток микроорганизмов, проводимой способом по настоящему изобретению.

[Фиг. 3] Фотографии электрофореза, демонстрирующие результаты детекции жизнеспособных клеток микроорганизмов, проводимой общепринятым способом. "Жизнеспособные" представляет собой жизнеспособные клетки, "поврежденные" представляет собой поврежденные клетки.

[Фиг. 4] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография не подвергнутой нагреванию суспензии бактерий Enterobacter sakazakii в физиологическом растворе.

[Фиг. 5] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография супернатанта не подвергнутой нагреванию суспензии бактерий Enterobacter sakazakii в физиологическом растворе.

[Фиг. 6] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография суспензии бактерий Enterobacter sakazakii в физиологическом растворе после повторения термических циклов.

[Фиг. 7] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография супернатанта суспензии бактерий Enterobacter sakazakii в физиологическом растворе после повторения термических циклов.

[Фиг. 8] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография бактерии Enterobacter sakazakii, суспендированной в растворе средства для предварительной обработки без нагревания.

[Фиг. 9] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография супернатанта бактерии Enterobacter sakazakii, суспендированной в растворе средства для предварительной обработки без нагревания.

[Фиг. 10] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография бактерии Enterobacter sakazakii, суспендированной в растворе средства для предварительной обработки после повторения термических циклов.

[Фиг. 11] Микрофотография флуоресценции и стереоскопическая микрофотография супернатанта бактерии Enterobacter sakazakii, суспендированной в растворе средства для предварительной обработки после повторения термических циклов.

[Фиг. 12] Диаграммы, демонстрирующие результаты проточной цитометрии суспензий бактерии Enterobacter sakazakii в физиологическом растворе или их супернатантов в состоянии без нагревания или после повторения термических циклов.

[Фиг. 13] Диаграммы, демонстрирующие результаты проточной цитометрии бактерии Enterobacter sakazakii, суспендированной в растворе средства для предварительной обработки, или его супернатанта в состоянии без нагревания или после повторения термических циклов.

[Фиг. 14] Фотография электрофореза продуктов амплификации генов 16S-23S рРНК, полученных способом по настоящему изобретению с использованием бактерии Enterobacter sakazakii, обработанной различными фиксирующими растворами. Значения Ct указаны в виде среднего и SD, а SD указан в круглых скобках.

L: Лестничный маркер ДНК с шагом 100 п.н.

A: Фиксирующий раствор A

B: Фиксирующий раствор B

C: Фиксирующий раствор C

S: Отсутствие фиксации

[Фиг. 15] Фотография электрофореза продукта амплификации гена ompA, полученного способом по настоящему изобретению с использованием бактерии Enterobacter sakazakii, обработанной различными фиксирующими растворами. Значения Ct указаны в виде среднего и SD, а SD указан в круглых скобках.

A: Фиксирующий раствор A

B: Фиксирующий раствор B

L: Лестничный маркер ДНК с шагом 100 п.н.

[Фиг. 16] Фотографии электрофореза, полученные перед и после ПЦР (реакция амплификации генов 16S-23S рРНК) с использованием бактерии Enterobacter sakazakii.

Дорожки 2 и 3: супернатант реакционной смеси ПЦР.

Дорожки 5 и 6: ДНК, выделенная из осадка дважды отмытого с помощью центрифугирования после реакции ПЦР.

Дорожки 7 и 8: ДНК, непосредственно выделенная из клеток.

Дорожки 9 и 10: ДНК, выделенная из клеток, фактически используемых в тесте, непосредственно перед ПЦР.

Дорожки 13 и 14: ДНК, выделенная из клеток, отмытых после добавления продукта ПЦР.

L: Лестничный маркер ДНК с шагом 100 п.н.

B: Фиксирующий раствор B

S: Отсутствие фиксации

[Фиг. 17] Фотографии электрофореза суспензий бактерии Enterobacter sakazakii, подвергнутой тепловой обработке в присутствии физиологического раствора или средства для предварительной обработки, и их супернатантов после центрифугирования.

L: Лестничный маркер ДНК с шагом 100 п.н.

Способы осуществления изобретения

Далее в настоящем документе подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничено приведенными ниже предпочтительными вариантами осуществления, и его можно без ограничений модифицировать в объеме настоящего изобретения. Если не указано иначе, проценты в настоящем описании выражены в виде процентов по массе.

Мишень для детекции способом по настоящему изобретению включает все классы нуклеиновых кислот, а именно: одноцепочечная ДНК, двухцепочечная ДНК, одноцепочечная РНК и двухцепочечная РНК, при условии, что мишень в конечном итоге можно амплифицировать. Из них мишенью для детекции предпочтительно является ДНК, особенно предпочтительно двухцепочечная ДНК.

<1> Способ по настоящему изобретению

Способ по настоящему изобретению представляет собой способ детекции жизнеспособных клеток микроорганизма в тестируемом образце при различении жизнеспособных клеток и погибших клеток или поврежденных клеток, который включает стадии:

a) добавления средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм в тестируемом образце;

b) облучения тестируемого образца, в который добавляют средство, светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм;

c) амплификации области-мишени ДНК или РНК микроорганизма, содержащегося в тестируемом образце, способом амплификации нуклеиновых кислот в присутствии средства подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, без выделения нуклеиновых кислот из клеток; и

d) анализ продуктов амплификации.

В описании настоящего изобретения термин "тестируемый образец" относится к объекту, содержащему жизнеспособные клетки микроорганизма для детекции. Тестируемый образец конкретно не ограничен при условии, что присутствие микроорганизма можно детектировать с помощью амплификации конкретной области хромосомной ДНК или РНК способом амплификации нуклеиновых кислот. Его предпочтительные примеры включают продукты питания, биологические образцы, питьевую воду, промышленные воды, воду из окружающей среды, сточные воды, почву, мазки и т.д.

В частности, предпочтительные примеры продуктов питания включают: напитки, такие как безалкогольные напитки, газированные безалкогольные напитки, жидкие пищевые добавки, напитки на основе фруктовых соков и молочнокислые напитки (включая концентраты и порошки этих напитков); мороженные кондитерские изделия, такие как мороженое, фруктовое мороженое и ледяная стружка; молочные продукты, такие как переработанное молоко, молочные напитки, молочнокислые продукты и масло; энтеральное питание, жидкая пища, молоко для младенцев, спортивные напитки; функциональное питание, такое как питание для применения при определенном состоянии здоровья, и пищевые добавки, и т.д.

Примеры биологических образцов включают образцы крови, образцы мочи, образцы цереброспинальной жидкости, образцы синовиальной жидкости, образцы плеврального выпота, образцы мокроты, образцы кала, образцы слизистой полости носа, образцы слизистой гортани, образцы после промывания желудка, образцы гноя, образцы слизистой оболочки кожи, образцы слизистой полости рта, образцы слизистой оболочки органов дыхания, образцы слизистой оболочки пищеварительных органов, образцы конъюнктивы глаза, образцы плаценты, образцы репродуктивных клеток, образцы родового канала, образцы материнского молока, образцы слюны, рвоты, содержимого волдырей и т.д.

Примеры воды из окружающей среды включают водопроводную воду, грунтовую воду, речную воду, дождевую воду и т.д.

В настоящем изобретении тестируемый образец может представлять собой любой из продуктов питания, биологических образцов, питьевой воды, промышленных вод, воды из окружающей среды, сточных вод, почвы, мазков, как указано выше, и т.д. или может представлять собой любой из их разведенных или концентрированных продуктов или любой из продуктов, получаемых с помощью предварительной обработки, отличной от способа по настоящему изобретению. Примеры предварительной обработки включают тепловую обработку, фильтрование, центрифугирование и т.д.

Кроме того, в тестируемом образце можно удалять примеси, такие как клетки, отличные от микроорганизмов, коллоидные частицы белка, липиды, сахариды и т.д., или снижать их содержание посредством обработки ферментов с разрушающей их активностью или т.п. В случае, когда тестируемый образец представляет собой любой из молока, молочных продуктов и продуктов питания, получаемых из молока или молочных продуктов, примеры клеток в тестируемом образце, отличных от микроорганизмов, включают лейкоциты коровы, эпителиоциты молочной железы и т.д. При этом, в случае, когда тестируемый образец представляет собой любой из биологических образцов, таких как образцы крови, образцы мочи, образцы цереброспинальной жидкости, образцы синовиальной жидкости и образцы плеврального выпота, примеры клеток включают эритроциты, лейкоциты (такие как гранулоциты, нейтрофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), тромбоциты и т.д.

Фермент при условии, что он может разрушать примеси и не повреждает жизнеспособные клетки микроорганизма, подлежащего детекции, конкретно не ограничен, и его примеры включают, например, ферменты, разрушающие липиды, ферменты, разрушающие белки и ферменты, разрушающие сахариды. Из них можно использовать один фермент, или два, или более ферментов, но предпочтительно использовать и фермент, разрушающий липиды, и фермент, разрушающий белки, или все из фермента, разрушающего липиды, фермента, разрушающего белки и фермента, разрушающего сахариды.

Примеры ферментов, разрушающих липиды, включают липазу, фосфатазу и т.д., примеры ферментов, разрушающих белки, включают сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, протеиназу K, проназу и т.д., и примеры фермента, разрушающего сахариды, включают амилазу, целлюлазу и т.д.

"Микроорганизм" представляет собой объект, подлежащий детекции способом по настоящему изобретению, и он конкретно не ограничен при условии, что его можно детектировать способом амплификации нуклеиновой кислоты, и средство, способное к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм действует на жизнеспособные клетки микроорганизма способом, отличным от способа для погибших клеток и поврежденных клеток микроорганизма. Предпочтительные примеры включают бактерии, грибы, дрожжи, вирусы и т.д. Бактерии включают грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии. Примеры грамположительных бактерий включают бактерии Staphylococcus, такие как Staphylococcus epidermidis, бактерии Streptococcus, такие как Streptococcus pneumoniae, бактерии Listeria, такие как Listeria monocytogenes, бактерии Bacillus, такие как Bacillus cereus и Bacillus anthracis, бактерии Mycobacterium, такие как Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium, бактерии Clostridium, такие как Clostridium botulinum и Clostridium perfringens и т.д. Примеры грамотрицательных бактерий включают энтеробактерии, из которых типичными примерами являются бактерии Escherichia, такие как Escherichia coli, бактерии Enterobacter, такие как Enterobacter sakazakii, бактерии Citrobacter, такие как Citrobacter koseri, и бактерии Klebsiella, такие как Klebsiella oxytoca, и бактерии Salmonella, бактерии Vibrio, бактерии Pseudomonas, бактерии Legionella и т.д. Примеры вирусов включают вирусы с оболочкой, такие как вирус гриппа, и вирусы без оболочки, а только с нуклеокапсидом, такие как норовирусы, ротавирусы и аденовирусы.

В отношении вирусов существует известный способ определения активации и инактивации вируса в воде, в котором фотореактивному линкеру, сшивающему нуклеиновые кислоты (EMA), позволяют взаимодействовать с тестируемым образцом, а затем посредством ПЦР-РВ определяют только активированные вирусы (http://www.recwet.t.u-tokyo.ac.jp/furumailab/j/sotsuron/H21/H21sotsuron.html, Development of ethidium monoazide (EMA)-RT-PCR for selective detection of enteric viruses, 15th International Symposium on Health-Related Water Microbiology, (May 31-Jun 05, 2009, Ursulines Conference Centre, Naxos, Greece)). То есть полагают, что EMA не проникает в активированные вирусы, но проникает только в инактивированные вирусы с сильными физическими поврежденными нуклеокапсидами, и, таким образом, с применением EMA можно различать активированные вирусы (жизнеспособные) и неактивированные вирусы (погибшие). Таким образом, полагают, что настоящее изобретение можно применять не только для бактерий, нитевидных грибов и дрожжей, но также и для вирусов.

В настоящем изобретении "жизнеспособная клетка" относится к клетке в состоянии, в котором клетка может пролиферировать и демонстрирует метаболическую активность микроорганизма (жизнеспособное-и-культивируемое состояние), когда ее культивируют в основном в предпочтительных условиях культивирования, и по существу у клетки отсутствует повреждение клеточной стенки. В метаболической активности, указанной выше, можно привести примеры активности АТФ, эстеразной активности и т.д. В настоящем изобретении вирусные частицы для удобства также называют "клетками". В отношении вирусов, "жизнеспособная клетка" относится к вирусу в состоянии, когда он может инфицировать клетку млекопитающего и пролиферировать.

"Погибшая клетка" представляет собой клетку в состоянии, когда она не может пролиферировать и не проявляет метаболической активности (мертвое состояние), даже если ее культивируют в оптимальных условиях культивирования. Кроме того, она находится в состоянии, в котором хотя структура клеточной стенки сохраняется, сама клеточная стенка сильно повреждена, и средства, окрашивающие ядро, демонстрирующие слабую проницаемость, такие как йодид пропидия, могут входить или проникать через клеточную стенку. В отношении вирусов "погибшая клетка" относится к вирусу в состоянии, когда он не может инфицировать клетку млекопитающего.

"Поврежденная клетка" (поврежденная клетка или жизнеспособная-но-не культивируемая клетка) представляет собой клетку в состоянии, в котором даже когда ее культивируют в основном в предпочтительных условиях культивирования, почти не пролиферирует вследствие того, что она повреждена в результате искусственного стресса или стресса вследствие воздействия окружающей среды, и она демонстрирует метаболическую активность на меньшем уровне по сравнению с жизнеспособной клеткой, но на значительном уровне по сравнению с погибшей клеткой. В отношении вирусов "поврежденная клетка" относится к вирусу в состоянии, когда даже если он инфицирует клетку млекопитающего, он не может пролиферировать в клетке.

В этом описании, если конкретно не указано, "жизнеспособная клетка", "погибшая клетка" и "поврежденная клетка" означают соответственно жизнеспособную клетку, погибшую клетку и поврежденную клетку микроорганизма.

Привлекает внимание детекция бактерий, демонстрирующих состояние повреждения клеток вследствие умеренной тепловой обработки или введения антибиотиков, в частности в областях санитарной проверки продуктов питания и клинического тестирования, и настоящее изобретение относится к способу детекции микроорганизмов, позволяющему не только детектировать жизнеспособные клетки, но также и различать жизнеспособные клетки и погибшие клетки или поврежденные клетки.

Единицы количества клеток, как правило, представляют собой количество клеток (клетки)/мл для всех жизнеспособных клеток, поврежденных клеток и погибших клеток. В этом описании количество клеток представлено логарифмом, и "log₁₀ клеток/мл" означает 10^a клеток/мл.

Количество жизнеспособных клеток можно аппроксимировать количеством образуемых колоний (КОЕ/мл (колониеобразующие единицы/мл)), получаемых при культивировании клеток в оптимальных условиях на подходящей среде для