Рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма

Рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности, к рекомбинантным штаммам бактерий Escherichia coli - продуцентам янтарной кислоты, способным к эффективной продукции янтарной кислоты из глюкозы, а так же к способу получения янтарной кислоты, с использованием этих штаммов, с улучшенными показателями коэффициента конверсии субстрата в целевой продукт.

Янтарная кислота, традиционно получаемая нефтехимическим синтезом, является одним из соединений, продукция которых из возобновляемого сырья является наиболее востребованной в связи ростом цен на нефть и ограниченностью ее запасов. Янтарная кислота служит одним из важнейших "строительных блоков" для получения широкого спектра химических веществ с высокой добавленной стоимостью, также синтезируемых в настоящее время из нефтепродуктов. Ожидаемый рынок янтарной кислоты составляет более 300000 тон/год.

В силу относительной дешевизны и значительных объемов производства предпочтительным субстратом для микробиологического получения янтарной кислоты является глюкоза (Song H. and Lee S.Y., Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enz. Microbial TechnoL, 2006, 39(3), 352-361). Однако эффективно конвертировать глюкозу в янтарную кислоты способны лишь некоторые виды бактерий, такие как Actinobacillus succinogenes (Urbance S.E. et al., Evaluation of succinic acid continuous and repeat-batch biofilm fermentation by Actinobacillus succinogenes using plastic composite support bioreactors. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65, 664-670), Anaerobiospirillum succiniproducens (Nghiem N.P. et al., Production of succinic acid by Anaerobiospirillum succiniciproducens. Appl. Biochem. Biotechnol., 63-65, 565-576.) и Mannheimia succiniproducens (Lee P.C. et al., Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, from bovine rumen. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 58, 663-668). Вместе с тем, данные бактерии требуют для своего культивирования дорогостоящих комплексных питательных сред, что резко ограничивает возможность их экономически оправданного применения в промышленном производстве янтарной кислоты.

Факультативно анаэробная бактерия Escherichia coli способна к формированию лишь незначительных количеств янтарной кислоты в анаэробном процессе смешаннокислотного брожения. Тем не менее, изученность метаболизма и развитость доступного генно-инженерного инструментария позволили создать на основе клеток Е.coli, как с привлечением генно-инженерных методов, так и мутагенеза, рекомбинантные продуценты янтарной кислоты, превосходящие по своим характеристикам природные продуценты (Cheng K.K. et al., Biotechnological production of succinic acid: current state and perspectives. Biofpr. Journal, 2012, 6, 302-318).

Наиболее эффективным процессом микробиологического получения янтарной кислоты и ее солей является анаэробное сбраживание глюкозы, с формированием целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. В данном процессе максимально возможный коэффициент конверсии субстрата в продукт в расчете на углерод составляет 2 моль/моль. Это обуславливается фиксацией CO₂ на стадии образования из гликолитических интермедиатов оксалоацетата - предшественника в анаэробном пути сбраживания глюкозы в янтарную кислоту. Однако практической реализуемости данного процесса, препятствует его окислительно-восстановительная несбалансированность. Конверсия каждой из двух молекул оксалоацетата, полученных из интермедиатов гликолитической утилизации глюкозы, в янтарную кислоту требует 2-х восстановленных эквивалентов (NADH), в то время как в ходе гликолиза формируется лишь половина необходимых эквивалентов (1 NADH на одну молекулу оксалоацетата).

Этим обуславливается то, что лучшие показатели продукции янтарной кислоты специально полученными мутантными штаммами достигаются в процессах биосинтеза, представляющих сочетание двух биохимических путей - восстановительной части цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта. Соотношение вкладов каждого из путей в биосинтез янтарной кислоты определяет конечный выход целевого вещества.

С участием глиоксилатного шунта две молекулы янтарной кислоты могут быть синтезированы из одной молекулы оксалоацетата, двух молекул Ацетил-CoA и одного NADH. Глиоксилатный шунт, потребляющий меньшее количество NADH на каждую синтезируемую молекулу янтарной кислоты выступает в данном случае как донор "остаточных" гликолитических NADH для высокопродуктивного формирования целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. Однако, поскольку в глиоксилатный шунт, наряду с оксалоацетатом, вовлечены 2 молекулы Ацетил-CoA, формирующиеся из гликолитического предшественника с потерей CO₂, вклад этого процесса в общий биосинтез янтарной кислоты приводит к снижению суммарного выхода продукта.

Исходя из электронного и углеродного балансов, принято считать, что максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,71 моль/моль (McKinlay J.B., et al., Prospects for a bio-based succinate industry. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 76(4), 727-740). Действительно, если считать, что глюкоза содержит 24 электрона, а янтарная кислота, исходя из степени ее восстановленности, 14, то образование янтарной кислоты из глюкозы можно представить следующей нетто-формулой:

C₆H₁₂O₆+0,86 CO₂→1,714 C₄H₆O₄+0,86 H₂O.

Однако в действительности, в зависимости от участия конкретных ферментов в формировании ключевых метаболитов-предшественников в биосинтезе целевого вещества, окислительно-восстановительно сбалансированный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы может достигаться при различных максимально возможных коэффициентах конверсии субстрата в продукт. Иными словами, участие конкретного фермента в пути биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы задает необходимость соблюдения клеткой окислительно-восстановительного баланса, определяющего теоретически возможный выход продукта.

В клетках Е.coli Ацетил-CoA, необходимый для функционирования глиоксилатного шунта, может образовываться из пировиноградной кислоты под действием пируватформатлиазы или под действием пируватдегидрогеназы. Конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA под действием пируватформатлиазы не сопровождающаяся формированием NADH, в то время как действие пируватдегидрогеназы приводит к формированию дополнительной молекулы NADH на каждый образующийся Ацетил-CoA.

В анаэробных условиях гликолитическая конверсия одной молекулы глюкозы в две молекулы пировиноградной кислоты сопровождается формированием двух NADH. Синтез одной молекулы янтарной кислоты из оксалоацетата в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот сопровождается расходом 2-х восстановленных эквивалентов NADH. Синтез двух молекул янтарной кислоты из одной молекулы оксалоацетата и двух молекул Ацетил-CoA с участием глиоксилатного шунта сопровождается расходом одного восстановленного эквивалента NADH. Таким образом, окислительно-восстановительно сбалансированный анаэробный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы, при формировании Ацетил-CoA под действием пируватформатлиазы, возможен при образовании 8-ми молекул янтарной кислоты из 5-ти молекул глюкозы и 2-х молекул CO₂. В данном случае максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,6 моль/моль. При формировании Ацетил-CoA под действием как пируватформатлиазы, так и пируватдегидрогеназы окислительно-восстановительно сбалансированный анаэробный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы возможен при образовании 10-ти молекул янтарной кислоты из 6-ти молекул глюкозы и 4-х молекул CO₂. В данном случае максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,66 моль/моль. При формировании Ацетил-CoA исключительно под действием пируватдегидрогеназы окислительно-восстановительно сбалансированный анаэробный биосинтез янтарной кислоты из глюкозы возможен при образовании 12-ти молекул янтарной кислоты из 7-ти молекул глюкозы и 6-ти молекул CO₂. В данном случае максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту составляет 1,71 моль/моль. В данной связи следует отметить, что в Е.coli конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA в анаэробных условиях осуществляется под действием пируватформатлиазы, в то время как пируватдегидрогеназа активна в аэробных условиях и экспрессия генов пируватдегидрогеназного комплекса в условиях анаэробиоза репрессирована (см., например, Soini J. et al., Norvaline is accumulated after a down-shift of oxygen in Escherichia coli W3110. Microb Cell Fact., 2008, 7:30, doi: 10.1186/1475-2859-7-30).

Эффект активации пируватдегидрогеназы для анаэробного биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы клетками Е.coli был продемонстрирован в RU 2010146281. Однако, соответствующий штамм SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC] демонстрировал коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту на уровне ~0,57 моль/моль. Достижению высоких показателей коэффициента конверсии глюкозы в янтарную кислоту данным штаммом препятствовало наличие в нем активности алкоголь/альдегид дегидрогеназы AdhE, конкурирующей с биосинтезом целевого вещества за метаболит-предшественник Ацетил-CoA.

Действительно, рациональное конструирование рекомбинантных микробных продуцентов янтарной кислоты предполагает необходимость инактивации конкурентных, по отношению к целевым, биохимических путей утилизации ключевых метаболических предшественников и восстановленных эквивалентов NADH. Эти конкурентные пути представляют собой:

А) конверсию, под действием лактатдегидрогеназы, пировиноградной кислоты, являющейся предшественником биосинтеза Ацетил-CoA и потенциальным предшественником в биосинтезе оксалоацетата, в молочную кислоту с расходом восстановленного эквивалента NADH;

Б) конверсию, под действием пируватоксидазы, пировиноградной кислоты в уксусную кислоту;

В) конверсию, под действием альдегид/алкоголь дегидрогеназы, Ацетил-CoA, субстрата глиоксилатного шунта, в этанол с расходом двух восстановленных эквивалентов NADH;

Г) конверсию, под действием фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы, Ацетил-CoA в уксусную кислоту.

Среди штаммов Е.coli продуцентов янтарной кислоты полученных с помощью методов направленной генетической инженерии и без привлечения методов мутагенеза и селекции в наибольшей степени данным критериям соответствует штамм SBS550MG [pHL413] (Sanchez AM et al., Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng. 2005, 7(3), 229-239.). Этот штамм рассматриваем в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ получения янтарной кислоты на основе штамма SBS550MG [pHL413] в качестве ближайшего аналога заявляемого способа. В штамме SBS550MG [pHL413] инактивированны гены ackA, pta, IdhA, adhE, iclR, кодирующие ацетаткиназу, фосфотрансацетилазу, лактатдегидрогеназу, альдегид/алкоголь дегидрогеназу и белок транскрипционный репрессор экспрессии генов, кодирующих ферменты глиоксилатного шунта. Однако, данный штамм содержит интактный ген рохВ, кодирующий пируватоксидазу, конкурирующую с биосинтезом янтарной кислоты за метаболит-предшественник пировиноградную кислоту. Конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA в штамме SBS550MG [pHL413] осуществляется под действием пируватформатлиазы, что обуславливает максимально возможный коэффициент конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль (Сох S.J. et al., Development of a metabolic network design and optimization framework incorporating implementation constraints: a succinate production case study. Metab. Eng., 2006, 8, 46-57). В богатых комплексных средах штамм SBS550MG [pHL413] синтезирует янтарную кислоту из глюкозы с коэффициентом конверсии 1,59 (Sanchez AM et al., Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng. 2005, 7(3), 229-239.), 1,4 (PCT/FR2010/050230) и 1,25 (Martinez I. et al., Metabolic impact of the level of aeration during cell growth on anaerobic succinate production by an engineered Escherichia coli strain. Metab Eng., 2010, 12, 499-509) в зависимости от условий культивирования. Данные коэффициенты конверсии достигнуты при продукции штаммом янтарной кислоты в среде LB, содержащей значительное количество аминокислот. В условиях анаэробиоза окислительное дезаминирование аминокислот, сопровождающееся генерацией NADH, способно обеспечить дополнительные к гликолитическим восстановленные эквиваленты необходимые для формирования янтарной кислоты в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. При исчерпании в среде аминокислот, штамм лишается дополнительного источника восстановленных эквивалентов для эффективного биосинтеза янтарной кислоты. Действительно, при осуществлении процесса анаэробного биосинтеза янтарной кислоты из глюкозы штаммом SBS550MG [pHL413] в минимальной солевой среде с глюкозой коэффициент конверсии субстрата в целевой продукт составляет 1,3 моль/моль (WO 2009/083756).

Задача заявляемого изобретения состоит в расширении ассортимента штаммов бактерий Escherichia coli продуцентов янтарной кислоты и способов получения янтарной кислоты с использованием этих штаммов. Задача решена путем

- конструирования рекомбинантных штаммов Escherichia coli - продуцентов янтарной кислоты:

1. SGM1.0 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE и активностью пируваткарбоксилазы;

2. SGM1.1 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и активностью пируваткарбоксилазы;

3. SGM2.0 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы;

4. SGM2.1 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы;

5. SGM3.0 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы;

6. SGM3.1 [pPYC], обладающего инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и активностью пируваткарбоксилазы.

- разработки способа получения янтарной кислоты с использованием заявляемых штаммов.

В отличие от штамма SBS550MG [pHL413], в заявляемых штаммах помимо генов ackA, pta, ldhA, adhE инактивирован ген poxB. Конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-CoA осуществляется в заявляемых штаммах либо под действием пируватформатлиазы, либо под действием пируватформатлиазы и пируватдегидрогеназы, либо под действием исключительно пируватдегидрогеназы что обуславливает максимально возможные коэффициенты конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль, 1,66 моль/моль, 1,71 моль/моль. Заявляемые штаммы способны анаэробно синтезировать янтарную кислоту из глюкозы с высокими коэффициентами конверсии как в комплексной, так и в минимальной солевой средах.

Объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные штаммы бактерий вида Escherichia coli, обладающие способностью к эффективной конверсии глюкозы в янтарную кислоту.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, IdhA, adhE, iclR, обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,6 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,66 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,66 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,71 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR, усиленной экспрессией генов асеЕ, aceF и lpdA, и обладающий активностью пируваткарбоксилазы - продуцент янтарной кислоты с максимально возможным коэффициентом конверсии глюкозы в янтарную кислоту - 1,71 моль/моль.

Также объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные штаммы бактерий Escherichia coli, описанные выше, при этом активность пируваткарбоксилазы обеспечивается за счет введения в бактерию молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф. 6.4.1.1..

Также объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные штаммы бактерий Escherichia coli, в которых экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA усилена за счет замены в хромосомах штаммов нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

Также объектом настоящего изобретения является способ получения янтарной кислоты, включающий стадии культивирования рекомбинантных штаммов, описанных выше, в питательной среде; и выделения произведенной и накопленной янтарной кислоты из культуральной жидкости.

Также объектом настоящего изобретения является, описанный выше способ, в котором процесс культивирования рекомбинантных штаммов включает в себя аэробную стадию накопления биомассы и анаэробную стадию продукции янтарной кислоты.

Рекомбинантный штамм, согласно настоящему изобретению, - это штамм бактерий вида Escherichia coli, сконструированный в результате направленных генно-инженерных манипуляций в рамках подхода рациональной метаболической инженерии.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и iclR по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и iclR.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и PflB по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE и PflB.

Термин «рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, pflB, iclR» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, PflB и iclR по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, PflB и IclR.

Термин «инактивация генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE» означает, что естественная экспрессия модифицированных участков ДНК невозможна из-за делеций данных генов или их частей или модификации примыкающих к генам областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию соответствующих генов, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.

Термин «инактивация гена iclR» означает, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеций данного гена или его части или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.

Термин «инактивация гена pflB» означает, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеций данного гена или его части или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.

Наличие или отсутствие генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, а также iclR и/или pflB на хромосоме бактерии можно определить известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну, и т.п. Кроме того, уровни экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п.Количества или молекулярные массы кодируемых генами белков могут быть определены известными методами, включая SDS-ПААГ - электрофорез с последующим иммуноблоттингом ПЦР (блоттинг по Вестерну) и т.п..

Ген ackA (синонимы: ЕСК2290, b2296) кодирует белок AckA (синоним: В2296), проявляющий активность ацетаткиназы, классифицируемую как К.Ф. 2.7.2.1. Ген ackA (нуклеотиды с 2,411,492 по 2,412,694 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания yfbV и геном pta на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ackA и аминокислотная последовательность AckA, кодируемого геном ackA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно. Ten pta (синонимы: ЕСК2291, b2297) кодирует белок Pta (синоним: В2297), проявляющий активность фосфотрансацетилазы, классифицируемую как К.Ф. 2.3.1.8. Ген pta (нуклеотиды с 2,412,769 по 2,414,913 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ackA и открытой рамкой считывания yfcC на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность теш pta и аминокислотная последовательность Pta, кодируемого геном pta, приведены в Перечне последовательностей под номерами 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) соответственно. Ген рохВ (синонимы: ЕСК0862, b0871) кодирует белок РохВ (синоним: В0871), проявляющий активность пируватоксидазы, классифицируемую как К.Ф. 1.2.5.1. Ген рохВ (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 908,554 по 910,272 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ltaE и геном her на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена рохВ и аминокислотная последовательность РохВ, кодируемого геном рохВ, приведены в Перечне последовательностей под номерами 5 (SEQ ID NO:5) и 6 (SEQ ID NO:6) соответственно. Ген ldhA (синонимы: ЕСК1377, b1380) кодирует белок LdhA (синоним: В1380), проявляющий активность лактатдегидрогеназы, классифицируемую как К.Ф. 1.1.1.28. Ген ldhA (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 1,439,878 по 1,440,867 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном hslJ и открытой рамкой считывания ydbH на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ldhA и аминокислотная последовательность LdhA, кодируемого геном ldhA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 7 (SEQ ID NO: 7) и 8 (SEQ ID NO: 8) соответственно. Ген adhE (синонимы: ЕСК1235, b1241) кодирует белок AdhE (синоним: В1241), проявляющий активность алкоголь дегидрогеназы и альдегид дегидрогеназы, классифицируемые как К.Ф. 1.1.1.1. и К.Ф. 1.2.1.3. Ген adhE (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 1,294,669 по 1,297,344 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания ychG и открытой рамкой считывания ychE на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена adhE и аминокислотная последовательность AdhE, кодируемого геном adhE, приведены в Перечне последовательностей под номерами 9 (SEQ ID NO: 9) и 10 (SEQ ID NO: 10) соответственно. Ген iclR (синонимы: ЕСК4010, b4018) кодирует белок iclR (синоним: В4018) являющийся транскрипционным репрессором асеВАК оперона, кодирующего ферменты глиоксилатного шунта. Ген iclR (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 4,220,827 по 4,221,651 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном arpA и геном metHm хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена iclR и аминокислотная последовательность iclR, кодируемого геном iclR, приведены в Перечне последовательностей под номерами 11 (SEQ ID NO: 11) и 12 (SEQ ID NO: 12) соответственно. Ген pflB (синонимы: ЕСК0894, b0903) кодирует белок PflB (синоним: В0903), проявляющий активность пируватформатлиазы, классифицируемую как К.Ф. 2,3.1.54. Ген pflB (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 950,495 по 952,777 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном pflA и геном focA на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена pflB и аминокислотная последовательность PflB, кодируемого геном pfl, приведены в Перечне последовательностей под номерами 13 (SEQ ID NO: 13) и 14 (SEQ ID NO: 14) соответственно.

Поскольку у представителей различных штаммов вида Escherichia coli возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена не ограничивается генами, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1), 3 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No:5 ), 7 (SEQ ID No: 7), 9 (SEQ ID No: 9), 11 (SEQ ID No: 11), 13 (SEQ ID NO: 13), но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID No:1, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, (SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11, SEQ ID NO: 13, кодирующие варианты белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, IclR и PflB. Термин «вариант белка» в значении, в котором он используется в настоящем изобретении, означает белок, имеющий изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Количество изменений в варианте белка зависит от положения аминокислотного остатка в трехмерной структуре или его типа. Количество изменений может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательностях SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14. Данные изменения в вариантах белка являются консервативными мутациями, при которых сохраняется функция белка. Другими словами, данные изменения могут иметь место в областях белка, некритичных для его трехмерной структуры. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, и поэтому третичная структура при таких заменах не нарушается. Консервативная мутация - это мутация, при которой имеют место взаимные замены среди Phe, Trp, Tyr, если сайт замены - ароматическая аминокислота; среди Leu, He, Val, если сайт замены - гидрофобная аминокислота; между Gin, Asn, если сайт замены - положительно заряженная аминокислота; среди Lys, Arg, His, если сайт замены - основная аминокислота; между Asp, Glu, если сайт замены - кислая аминокислота и между Ser, Thr, если это аминокислота с гидроксильной группой. Консервативные замены являются типичными консервативными мутациями. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Tyr, замену He на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на He, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на He, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, He или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, He или Leu. Описанные выше замены, делеции, вставки, добавления, перестановки и т.п. одного или нескольких аминокислотных остатков включают природные мутации (мутант или вариант) в зависимости от видовых различий или индивидуальных различий микроорганизмов, содержащих гены ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и pflB. Такие гены могут быть получены модифицированием нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, (SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11 и SEQ ID NO: 13 с использованием, например, сайт-специфического мутагенеза, таким образом, что сайт-специфический аминокислотный остаток в соответствующем кодируемом белке включает замены, делеции, вставки или добавления.

Следовательно, варианты белков, кодируемых генами ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и pflB, могут иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, показанной в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, соответственно.

В связи с этим гены ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, iclR и pflB могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, приведенными в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1), 3 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 5), 7 (SEQ ID No: 7), 9 (SEQ ID No: 9), 11 (SEQ ID No: 11), 13 (SEQ ID NO: 13), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+(Amersham) при строгих условиях-15 минут. Предпочтительна двух- трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно от 100 н.п. до 1000 н.п.

Гомология между последовательностями аминокислот может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0.

Экспрессия генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, а также iclR и/или pflB может быть ослаблена введением мутации в соответствующий ген на хромосоме, при которой внутриклеточная активность белка, кодируемого геном, снижена или отсутствует по сравнению с немодифицированным штаммом. Такой мутацией гена может быть вставка гена устойчивости к антибиотику, или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.R, J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия генов ackA, pta, poxB, ldhA, adhE, а также iclR и/или pflB также может быть ослаблена модификацией регуляторных последовательностей, таких как промотор или последовательность Shine-Dalgamo (SD) (заявка РСТ W095/34672; Carrier, Т.А. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 12, 6640-6645 (2000)) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491A). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.

Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).

Инактивация гена также может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации, или/и мутагенез вставкой-делецией (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45) также называемый "Red-зависимая интеграция".

Приведенное выше описание, касающееся вариантов белков, инактивации гена и других методов, может быть применимо к другим белкам, генам и конструированию бактерий, приведенным ниже.

Термин "усиление экспрессии гена" может означать, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например, в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций могут включать увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, усиление экспрессии гена и т.д. Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации т situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Кроме того, штаммы, которые могут быть использованы в качестве контроля, включают, например, Escherichia coli К-12.

Гены асеЕ, aceF и lpdA (синонимы: b0114, ЕСК0113; b0115, ECK0114; b0116, ЕСК0115) кодируют белки АсеЕ, AceF и LpdA - компоненты ферментативного комплекса NAD⁺-восстанавливающей пируватдегидрогеназы. Гены aceEF-lpdA оперона (нуклеотиды, гомологичные нуклеотидам с 123017 по 129336; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположены между генами pdhR и уасН на хромосоме Е.coli К-12. Нуклеотидные последовательности генов aceEF-lpdA оперона и аминокислотные последовательности белков АсеЕ, AceF и LpdA, кодируемых генами асеЕ, aceF и lpdA представлены в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, соответственно.

Понятие "вариант белка" также применимо белков АсеЕ, AceF и LpdA - компонентов ферментативного комплекса NAD⁺-восстанавливающей пируватдегидрогеназы. Термин "вариант белка" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

В связи с этим гены асеЕ, aceF и lpdA также могут существовать в виде вариантов, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, или с зондами, которые могут быть синтезированы на основе указанных нуклеотидных последовательностей, при условии, что они кодируют функциональные белки АсеЕ, AceF и LpdA. Термин "жесткие условия" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

Методы, которые могут быть использованы для усиления экспрессии гена, включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в бактерии вида Escherichia coli, может увеличивать число копий гена. Могут использоваться низкокопийные векторы. Примеры низкокопийных векторов включают, но не ограничиваются ими, pSC101, pMW118, pMW119, и т.п. Термин "низкокопийный вектор" используется для векторов, число копий которого в клетке достигает пяти.

Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и т.п. Например, один акт Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.

Число копий гена также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому может быть выполнена гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.

Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага λ. Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий ге