Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк

Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии.

Предшествующий уровень техники.

Биологические жидкости и ткани животных и растений содержат большое число ингибиторов протеаз. Большая часть хорошо изученных в настоящее время белковых ингибиторов содержит 60-70 аминокислотных остатков. Наряду с ингибиторами широкого спектра действия, такими, как альфа-2 макроглобулин, большая часть ингибиторов проявляет определенную групповую специфичность. Особенно распространены ингибиторы сериновых протеиназ. Их предложено классифицировать, как минимум, на 10 семейств. Сюда входят ингибиторы семейства панкреатического трипсинового ингибитора Куница, семейства панкреатического секреторного ингибитора (Казаля).

Семейство ингибиторов Казаля принадлежит к семейству ингибиторов I1, клан IA по классификации публичной базы данных MEROPS [Rawlings, Tolle and Barrett, Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem J, v.378, p.705-16 (2004)]. Ингибиторы Казаля воздействуют на сериновые пептидазы семейства S1, например на трипсин и эластазу. Ингибиторы Казаля в основном встречаются у многоклеточных животных, типичные представители семейства - овомукоид птиц, ингибитор акрозина и ингибитор эластазы. Известные ингибиторы этого семейства включают от одного до семи "доменов Казаля" или "повторов Казаля" [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984), Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Структура домена Казаля включает значительную долю несвернутой полипептидной цепи, две короткие альфа-спирали и один бета-слой, состоящий из трех антипараллельных цепей [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984)]. В установлении прямого межмолекулярного контакта домена Казаля и ингибируемого фермента вовлечено 11 аминокислотных остатков, при этом 8 из них являются гипервариабельными [Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Варьирование аминокислот, участвующих в образовании контактов с ингибируемым ферментом, изменяет как константу ингибирования, так и специфичность ингибитора [Empie and Laskowski, Thermodynamics and kinetics of single residue replacements in avian ovomucoid third domains: effect on inhibitor interactions with serine proteinases // Biochemistry, v.21, p.2274-84 (1982)].

Известен домен Казаля в составе белка инфестин из желудка кровососущего клопа Triatoma infestans, специфично блокирующий активированный фактор свертывания крови XII (фактор Хагемана, фXIIa) [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)]. Домен, блокирующий фХIIa, имеет порядковый номер 4, остальные домены Казаля в составе инфестина специфически ингибируют другие факторы свертывания крови. Аминокислотная последовательность инфестина и границы доменов приведены в публичной базе данных UniProt (http://www.uniprot.org/), номер записи Q95P16. Для изолированного рекомбинантного домена 4 инфестина был получен кристалл комплекса с фХIIa [Campos, Guimaraes, Medrano, Tanaka and Barbosa, Crystallization, data collection and phasing of infestin 4, a factor XIIa inhibitor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.60, p.2051-3 (2004)] и определена пространственная структура комплекса.

Свойство инфестина-4 ингибировать фХIIa делает его перспективным ингибитором контактной активации свертывания крови для применения в гемостазиологии, в том числе, в качестве лекарственного препарата для лечения и профилактики тромбозов и других заболеваний, связанных с гиперкоагуляционным состоянием системы свертывания крови. Из источника [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, р.512-6 (2004)] известна способность инфестина-4 ингибировать другой фактор системы свертывания, фХа, с константой ингибирования 53 нМ. Данное неспецифическое действие серьезно ограничивает возможность применения инфестина-4, поскольку фХа является одним из главных ферментов каскада свертывания. Ингибирование данного фактора может приводить к серьезным гемостатическим осложнениям, например кровотечениям [Koscielny J, Beyer-Westendorf J, von Heymann С, Braun J, Klamroth R, Lindhoff-Last E, Tiede A, Spannagl M., Risk of bleeding and haemorrhagic complication with rivaroxaban - Periprocedural management of haemostasis // Hamostaseologie; 32(4):287-93 (2012), Esmon CT, What did we learn from new oral anticoagulant treatment? // Thromb Res. Suppl 1:S41-3 (2012)].

Известны два метода получения рекомбинантного инфестина-4: в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris с дополнительным С-концевым пептидом и в составе слитого белка с сывороточным альбумином человека. Оба метода описаны в работе [Hagedorn, Schmidbauer, Pleines, Kleinschnitz, Kronthaler, Stoll, Dickneite and Nieswandt, Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding // Circulation, v.121, p.1510-7 (2010)]. Продуктивность дрожжевой системы экспрессии инфестина-4 составляет 4 мг/л культуры, продуктивность системы экспрессии слитого белка альбумина и инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих неизвестна.

Указанные системы экспрессии инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих не могут быть использованы из-за высокой стоимости культивирования, а известная система экспрессии инфестина-4 в дрожжах обладает слишком низкой продуктивностью. При этом указанные системы экспрессии инфестина-4 не могут быть использованы из-за неспецифического ингибирования фХа продуцируемым белком. Известен способ получения целевых белков в активной и растворимой форме с высокой продуктивностью (патент US 5270181, Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules, выдан 14.12.1993), который заключается в экспрессии целевого гетерологического белка, слитого с белком тиоредоксином или тиоредоксинподобным белком, в клетках хозяина. Однако описанный способ получения целевого белка не предполагает изменения функциональной активности целевого белка при экспрессии в виде слитого белка с тиоредоксином.

Краткое изложение изобретения

Технический результат, который может быть получен при реализации данного изобретения, заключается в эффективном и специфичном блокировании контактной активации свертывания за счет ингибирования фактора ХIIa и отсутствия ингибирования фактора Ха с упрощенной технологией получения белка, обеспечивающего указанную специфичность.

Указанный технический результат обеспечивается за счет получения слитого белка, включающего тиоредоксин I Е.coli и инфестин-4, обладающего повышенной специфичностью ингибирования фХIIa и имеющего пониженную активность ингибирования фХа по сравнению с нативным инфестином-4.

А также за счет получения экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей упомянутый слитый белок и находящейся под контролем промотера, функционирующего в бактериальной клетке.

А также за счет получения бактерии-продуцента упомянутого слитого белка, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной указанной плазмидной ДНК.

А также за счет создания способа получения упомянутого слитого белка, включающего культивирование упомянутой бактерии в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку указанного слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии.

Существо заявляемого решения

В основе заявляемого решения лежат разработанные авторами, в частности, плазмидная ДНК pET32a-Inf4 длиной 6106 п.о., кодирующая расщепляемый слитый белок, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера, линкерный участок, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и расположенный на С-конце молекулы полипептид домена 4 инфестина Т. Infestans. Открытая рамка считывания указанного домена инфестина содержит оптимальные для E.coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. Наличие белка-партнера обеспечивает поддержание слитого белка в растворимой форме в цитоплазме E.coli, правильное замыкание дисульфидных связей, позволяет проводить очистку слитого белка с помощью металлохелатного сорбента, что приводит к значительному увеличению выхода очищенного слитого белка, а также упрощению процедур выделения и очистки продукта.

В процессе получения указанного белка авторами неожиданно было установлено, что инфестин-4 в бактериях E.coli в форме белка-предшественника или слитого белка с тиоредоксином существенно увеличивает специфичность целевого белка по отношению к фХIIa, понижая активность ингибирования фXa, а также может быть достигнута высокая продуктивность системы экспрессии инфестина-4.

Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее гена, например, такие как промотор, терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.

Фрагментом ДНК, кодирующим рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans в составе слитого белка, включающего последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий, в свою очередь, тиоредоксин I E.coli, олигогистидиновые кластеры, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и домен 4 инфестина T.infestans. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в Е.coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей слитый белок и в особенности рекомбинантный домен 4 инфестина Т.infestans, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися в генах Е.coli кодонами. Последовательность гена Trx-Inf4, кодирующего домен 4 инфестина Т.infestans в составе слитого белка согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность слитого белка, включающего домен 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность интактного рекомбинантного домена 4 инфестина Т.infestans представляет собой последовательность под номером SEQ ID NO: 2 без 182 первых аминокислот (т.е. аминокислоты 183 - 238).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1), кодирующего слитый белок, включающий домен 4 инфестина Т.infestans, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами ингибитора фактора ХIIа, определяются по его способности ингибировать свертывание крови, инициированное по "внутреннему" пути. Так, например, активность домена 4 инфестина Triatoma infestans можно детектировать в коагулометрическом тесте "каолиновое время", как описано в Примере 6. Считается, что вариант белка обладает свойствами домена 4 инфестина Т.infestans при условии, что указанный вариант увеличивает время свертывания плазмы крови не менее чем на 30% при концентрации не выше чем 5 мкМ.

Термин «специфичность ингибирования фХIIа» означает свойства ингибитора фХIIa, заключающиеся в ингибировании фХIIa с высокой эффективностью (константой ингибирования порядка 1 нМ или ниже) и отсутствии заметного ингибирования (константа ингибирования намного больше 1 нМ, предпочтительно больше 1 мкМ) других протеаз свертывания, таких как факторы XIa, IXa, Ха, IIa (он же тромбин), и VIIa. Нативный инфестин-4 ингибирует фХIIa с константой 0,1 нМ, при этом белок ингибирует фХa с константой 53 нМ. Слитый белок тиоредоксина и инфестина-4 обладает такой же константой ингибирования фХIIa, как и нативный ингибитор, но константа ингибирования фХa составляет 2,5 мкМ, т.е. в 50 раз выше. Таким образом, полученный слитый белок обладает повышенной специфичностью к фХIIa по сравнению с нативным белком.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, содержащий домен 4 инфестина Т.Infestans и включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера (6 и 10 гистидинов), 2 последовательности узнавания специфической эндопротеиназой (DDDDK) и расположенный на С-конце слитого белка непосредственно за последним сайтом узнавания DDDDK домен 4 инфестина Т.infestans, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, рЕТ32а, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.

Одним из вариантов реализации настоящего изобретения является плазмида pET32a-Inf4 размером 6106 п.о., которая состоит из:

1) фрагмента HindIII-NheI (1-204) длиной 204 п.о., содержащего участок, кодирующий домен 4 инфестина Т.infestans и слитую с ним в рамке последовательность FLAG-эпитопа, включающую в себя сайт узнавания энтерокиназы

2) фрагмента NheI-NcoI (205-245)-длиной 41 п.о., содержащего участок, кодирующий пептид SAGHHHHHHHHHHG, содержащий декагистидиновый кластер

3) фрагмента NcoI-HindIII (246-6106) вектора рЕТ32а(+) длиной 5861 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую бета-лактамазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона; последовательность, кодирующую тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновый таг и сайт расщепления энтерокиназой. Указанная плазмида содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: HindIII (1), NheI (205), NcoI (246), XbaI (736), PciI (3656), PvuI (4919).

Структура плазмиды pET32a-Inf4 приведена на Фиг.3 и в SEQ ID 3.

При помощи созданной плазмиды можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию рода Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии слитого белка, содержащего домен 4 инфестина Т.infestans, может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой необходима для экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac А. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) //Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» также означает клетку, которая способна накапливать слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans в количестве не менее чем 2 мг/л культуры, более предпочтительно, не менее чем 20 мг/л культуры. Указанный слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans накапливается в указанной клетке предпочтительно в цитоплазме в растворимой форме.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].

Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки, образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, ампициллина 50 мкг/мл.

Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F^- ompT gal dcm lon hsdS_B(r_B ^-m_B ⁺) λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).

Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидой pET32a-Inf4 приводит к получению штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, который обеспечивает синтез рекомбинантного слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) Т.infestans в количестве более 5% от суммарного содержания белка клеток.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4 кодирует слитый белок Trx-Inf4, состоящий из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера (тиоредоксина E.coli), содержащего сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой домена 4 инфестина Т.infestans.

Способ получения слитого белка Trx-Inf4, состоящего из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера тиоредоксина I E.coli согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, индукцию промотора гена слитого белка Trx-Inf4, сбор биомассы клеток, их разрушение, отделение нерастворимых белков и дебриса, очистку слитого белка Trx-Inf4 металлохелатной хроматографией в нативных условиях и последующей анионообменной хроматографией.

Особенности плазмиды и результаты практического применения приведены на следующих фигурах.

Краткое описание фигур:

На Фиг.1 показана схема сборки синтетического гена домена 4 инфестина Triatoma infestans из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионных плазмид p10E- Inf4 и pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения:

Inf4 - домен 4 инфестина Triatoma infestans, соответствующий домену 4 типа Казаль. В скобках указаны первая и последняя аминокислоты фрагментов. Пунктирная линия обозначает полимеразную цепную реакцию, сплошная - рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК.

На Фиг.2 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322» - точка начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop, контролирующего копийность плазмиды; «fl ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - ген устойчивости к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «Т7 term» - участок терминации транскрипции целевого гена; «lacI» - ген репрессора лактозного оперона; Inf4 - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида домена 4 инфестина Triatoma infestans; "FLAG" - эпитоп моноклонального антитела FLAG; "EK-PRO" - сайт узнавания энтерокиназы, "10Е tag" - отделяемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер, эпитоп FLAG и сайт узнавания энтерокиназы; «stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

На Фиг.3 показана карта экспрессионной плазмиды pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322 origin» - область начала репликации плазмиды pBR322; «f1 origin» - участок инициации репликации бактериофага f1; «BIa (AmpR)» - последовательность, обеспечивающую устойчивость бактерий к ампициллину; «Т7 promoter» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «Т7 terminator» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «Trx-Inf4» - ОРС слитого белка; «Inf4» - ОРС домена 4 инфестина Triatoma infestans; «Trx» - ОРС тиоредоксина I E.coli; «10xHis» - декагистидиновый кластер; «6xHis» - гексагистидиновый кластер; «ЕК-PRO» - участок, кодирующий сайт узнавания энтерокиназой; «FLAG» - эпитоп моноклонального антитела FLAG; «stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

На Фиг.4 показана электрофореграмма тотального белка из клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4 (4 колонии) и контрольного штамма BL21 [DE3]/pET32a при индукции ИПТГ.

Индукция 1 мМ ИПТГ, 30°C; 0,4 и 16 ч. Обозначения: Inf cl. - соответствующая колония штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, Trx (К-) - колония контрольного штамма BL21[DE3]/pET32a, 0h - 16h - время индукции, ч; М - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка и контрольного белка-партнера указано стрелками. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Вычисленная продуктивность для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4: 20-40 мг/л, доля целевого белка: >5% (по денситометрии геля).

На Фиг.5 приведены электрофореграммы белковых фракций, полученных при выделении и одностадийной хроматографической очистке слитого белка Trx-Inf4 и контрольного белка-партнера Trx.

Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; «IP» - тотальный белок после индукции, «IB» - нерастворимые белки, «SO» - растворимые белки, «7R» - осадок после термокоагуляции, «7S» - супернатант после термокоагуляции, «AS» - супернатант при осаждении сульфатом аммония, «IM» - перерастворенный осадок после осаждения сульфатом аммония, «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии, «100», «200», «500» - фракции элюатов с металлохелатной колонки соответствующими концентрациями имидазола, «Е» - фракция элюции ЭДТА-Na, «NA» - фракция элюции при регенерации колонки NaOH. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Положение целевого белка Trx-Inf4 указано стрелкой.

На Фиг.6 показана электрофореграмма белковых фракций, полученных при градиентной элюции слитого белка Trx-Inf4 с сорбента Capto Q. Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; «200» - полуочищенный Trx-Inf4 перед нанесением; «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии; «F1»-«F8» - соответствующие собранные фракции элюата. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Положение целевого белка указано стрелкой.

На Фиг.7 показана хроматограмма ОФ-ВЭЖХ анализа очищенного слитого белка Trx-Inf4 и результаты интеграции пиков. Канал детекции 280 нм, чистота белка 99,06%.

На Фиг.8 показана электрофореграмма дорожки с очищенным Trx-Inf4 и результаты ее денситометрии. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим, чистота белка 99,48%.

На Фиг.9 приведен график зависимости времени свертывания плазмы крови в "каолиновом тесте" от концентрации в плазме Trx-Inf4.

На Фиг.10 приведен график зависимости активности фХа, определяемой по скорости расщепления хромогенного субстрата, от концентрации Trx-Inf4.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие, не ограничивающие настоящее изобретение, примеры.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-Inf4

Для аминокислотной последовательности, включающей 56 аминокислот домена 4 инфестина Triatoma infestans (аминокислоты 167-222 из записи Q95P16 публичной базы данных UniprotKB, расположенной по адресу http://www.uniprot.org/uniprot/Q95P16) с добавленным аминокислотным N-концевым пептидом (SEQ ID NO: 4, ASDYKDDDDK), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в Е.coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов. В последовательность ДНК также были включены стоп-кодоны и сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:5. Физический фрагмент EKsite-Kaz-4 (SEQ ID NO:5) собирали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из перекрывающихся олигонуклеотидных праймеров AS-KAZ-1F AS-KAZ-2R AS-KAZ-3F AS-KAZ-4R AS-KAZ-5R, приведенных в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, соответственно.

ПЦР проводили на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Препаративные реакции проводили в объеме 50 мкл. Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пмоль каждого праймерного олигонуклеотида; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация 94°C, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°C, 30 сек, отжиг 62°C, 30 сек, достройка 72°C, 120 сек; 1 цикл - достройка 72°C, 10 мин. Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего дотировали в Т-вектор pAL-TA («Евроген», РФ) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r_k-, m_k+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°C на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут. Затем добавляли 800 мкл питательного бульона LB и инкубировали при 37°C 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара и помещали в термостат на 37°C 18 часов. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды: M13dir (SEQ ID NO:11) и M13rev (SEQ ID NO:12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона LB и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность конструкции верифицировали методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и SP6 (SEQ ID NO:14).

Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК p10E-Inf4.

Реципиентную плазмиду p10E рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°C в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°C в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10^-2 мкг/мкл. Реакцию лигирования очищенного фрагмента NheIHindIII плазмиды pAL-Inf4, соответствующего минигену домена 4 инфестина и реципиентной плазмиды, проводили, как описано в примере 1. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5 альфа, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и T7term (SEQ ID NO:15).

Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT с канамицином, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США). При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-Inf4 определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom и T7term. В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена домена 4 инфестина. Карта экспрессионной конструкции приведена на Фиг.2 и в SEQ ID NO:16, аминокислотная последовательность продукта экспрессии приведена в SEQ ID NO:17.

Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pET32a-Inf4.

Реципиентную плазмиду рЕТ32а (+) (Novagen, США) рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и HindIII, как описано в примере 2. Донорную плазмиду p10E-Inf4 рестрицировали NcoI и HindIII и очищали из 1,5% агарозного геля набором «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США). Выделенные фрагменты лигировали, трансформировали лигаты в Е.coli штамма DH5-альфа и производили селекцию клонов, как описано в примере 2. Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT-Amp, выделяли плазмидную ДНК набором «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» и определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7term. Карта конструкции приведена на Фиг.3, последовательность в SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность целевого белка приведена в SEQ ID NO:2.

Пример 4. Получение штаммов-продуцентов Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4 и Е.coli BL21[DE3]/pET32a-Inf4, оценка продуктивности штаммов-продуцентов и локализация целевого белка.

Для получения штаммов-продуцентов слитого белка тиоредоксина E.coli, линкерного участка и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) и белка-предшественника 10Е-Inf4 конструкции, полученные по примерам 2 и 3, использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) (с генотипом F- oтpT hsdS_B (r-m-) gal dcm (DE3)).

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4-продуцента белка-предшественника домена 4 инфестина Triatoma infestans в составе клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой p10E-Inf4.

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4-продуцента слитого белка Trx-Inf4 клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET32a-Inf4.

Аналогично получали контрольный штамм Е.coli BL21[DE3]/pET32a-продуцент тиоредоксина I E.coli (Trx), трансформируя клетки Е.coli BL21[DE3] плазмидой рЕТ32а.

Трансформанты Е.coli высевали на агаризованную среду 2xYT с добавлением глюкозы до 2% и селективных антибиотиков - 30 мкг/мл канамицина для BL21[DE3]/p10E-Inf4 или 50 мкг/мл ампициллина для BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и BL21[DE3]/pET32a; проводили индукцию экспрессии целевых белков для четырех случайно выбранных колоний с типичным фенотипом. Колонии подращивали в питательном бульоне с добавлением соответствующего антибиотика и раствора глюкозы до 2% в течение 14 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 1-1,5 О.Е., индуцировали изопропилтио-р-D-галактозидом и культивировали еще 16 ч, отобрав аликвоты суспензии после 4 ч индукции. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4 приведены на Фиг.4. Электрофоретическая подвижность целевого белка соответствует расчетным значениям. По данным гель-электрофореза белковых фракций (Фиг.5) целевой белок Trx-Inf4 и контрольный белок-партнер Trx практически полностью были локализованы в растворимой фракции белков. В случае штамма BL21[DE3]/p10E-Inf4 электрофоретический анализ показал отсутствие видимого продукта экспрессии.

Пример 5. Выделение и очистка слитого белка Trx-Inf4

Штамм-продуцент BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и контрольный штамм BL21[DE3]/pET32a высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 1% глюкозы, растили 14 часов при +37°C. Одну отдельную колонию каждого штамма переносили в 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы и растили на качалке 14 часов при +37°C. Содержимым инокулировали 2 колбы, содержащие по 250 мл среды Terrific broth, дополнительно содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, растили на качалке 3,5 часа при +37°C, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 4 ч при +30°C. Осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис pH 7,4, 2 мМ ЭДТА), добавили лизоцим до 0,1 мг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Проводили термокоагуляцию примесных белков в полученном осветленном лизате инкубацией при температуре +70°C (максимально возможная для Trx-Inf4) в течение 10 мин. Отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин. Осаждали целевые белки добавлением равного объема насыщенного раствора сульфата аммония, выдерживали 30 мин на льду, центрифугировали 20 мин на 5000 об/мин, супернатант отбрасывали. Осадок суспендировали в 10 мл раствора В (50 мM Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7,4), отделяли денатурированные белки центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин. Супернатант фильтровали через дисковый фильтр с порами 0,45 мкм и наносили на 1 мл колонку с сорбентом Chelating Sepharose Fast Flow («GE Healthcare», США), содержащим хелатированные ионы никеля, и уравновешенным раствором В. Нанесение вели на скорости 0,5 мл/мин. Проскок собирали для дальнейшего анализа. Проводили ступенчатую элюцию адсорбированных белков раствором В с концентрацией имидазола 100, 200, 500 мМ на скорости потока 1 мл/мин. Удаляли иммобилизованные ионы никеля раствором B+50 мМ ЭДТА-Na, рН 8,0. Регенерировали колонку 10 мл раствора 0,1 М гидроксида натрия. Элюат при промывке гидроксидом натрия немедленно нейтрализовали 1,2 моль-эквивалента уксусной кислоты. Аликвоты всех полученных белковых фракций анализировали при помощи ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (Фиг.5).

Окончательную очистку целевого белка