Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи

Растворимые антитела, содержащие только тяжелые цепи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам выделения из трансгенных млекопитающих, не относящихся к человеку, широкого репертуара функциональных растворимых антител, содержащих только тяжелые цепи, и растворимых доменов VH, полученных из них, которые структурно отличны от доменов VH, полученных из антител, содержащих тяжелые и легкие цепи. Предпочтительно, антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH получают из долгоживущих плазматических клеток или В-клеток памяти.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Моноклональные антитела или их варианты составляют большую часть новых лекарственных средств, выпущенных в XXI веке. Терапия моноклональным антителами уже принята в качестве предпочтительного пути лечения ревматоидного артрита и болезни Крона, а также имеет место впечатляющий прогресс в лечении злокачественных опухолей. Также в разработке находятся продукты на основе антител для лечения сердечнососудистых и инфекционных заболеваний. Большинство представленных на рынке продуктов моноклональных антител распознают и связывают один четко определенный эпитоп на целевом лиганде (например, TNFα).

Структура антител хорошо известна в данной области. Большинство природных антител являются тетрамерами и содержат две тяжелых цепи и две легких цепи. Тяжелые цепи соединены друг с другом через дисульфидные связи между шарнирными доменами, расположенными приблизительно посередине каждой тяжелой цепи. Легкая цепь связана с каждой тяжелой цепью на N-концевой стороне шарнирного домена. Каждая легкая цепь обычно связана с соответствующей ей тяжелой цепью дисульфидной связью рядом с шарнирным доменом.

Когда молекула антитела уложена правильно, каждая цепь уложена в определенное число отдельных глобулярных доменов, соединенных более линейной полипептидной последовательностью. Например, легкая цепь уложена в вариабельный (VL) и константный (CL) домены. Тяжелая цепь имеет один вариабельный домен (VH) рядом с вариабельным доменом (VL) легкой цепи, первый константный домен (СН1), шарнирный домен и еще два или три константных домена. Взаимодействие вариабельных доменов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей приводит к образованию антигенсвязывающей области (Fv).

Взаимодействие между тяжелыми и легкими цепями опосредовано первым константным доменом тяжелой цепи (СН1) и константным доменом (CL) легкой цепи. Однако также существует поверхность контакта между вариабельным доменом тяжелой цепи (VH) и вариабельным доменом легкой цепи (VL), которая участвует во взаимодействии между тяжелой цепью и легкой цепью.

Поскольку вариабельные домены имеют различные аминокислотные последовательности, разработана система нумерации аминокислотных остатков в этих доменах. Эта система нумерации описана авторами Kabat et al. ((1991) US Public Health Services, NIH publication 91-3242) и использована в настоящем описании. В вариабельном домене тяжелой цепи каркасная область 1 (FR1) содержит остатки с 1 до 30, каркасная область 2 (FR2) содержит остатки с 36 до 49, каркасная область 3 (FR3) содержит остатки с 66 до 94, а каркасная область 4 (FR4) содержит остатки с 103 до 113. Также в вариабельном домене тяжелой цепи определяющие комплементарность области (CDR) содержат остатки с 30 до 35 (CDR1), остатки с 50 до 65 (CDR2) и с 95 до 102 (CDR3).

Нормальные В-клетки человека содержат один локус тяжелой цепи на хромосоме 14, из которого посредством перестройки возникает ген, кодирующий тяжелую цепь. У мышей локус тяжелой цепи расположен на хромосоме 12. Нормальный локус тяжелой цепи содержит несколько генных сегментов V, несколько генных сегментов D и несколько генных сегментов J. Наибольшую часть домена VH кодирует генный сегмент V, но С-конец каждого домена VH кодирует генный сегмент D и генный сегмент J. Антигенсвязывающую специфичность каждого домена VH обеспечивает перестройка VDJ в В-клетках и последующее созревание аффинности. Анализ последовательностей нормальных тетрамерных антител демонстрирует, что источником разнообразия в основном является сочетание перестройки VDJ и соматической гипермутации (Xu and Davies, (2000) Immunity, 13, 37-45). Существует более 50 генных сегментов V человека, присутствующих в геноме человека, из которых только 39 функциональны. Среди нормальных диплоидных антителопродуцирующих В-клеток каждая клетка продуцирует тетрамерное антитело из одного набора локусов тяжелой и легкой цепей антитела. Другой набор локусов используется, но не продуктивно, в результате процесса, называемого аллельным исключением (см. Singh et al., (2003) J. Exp. Med., 197, 743-750 и Immunology 5th edition, R.Goldsby, T.Kindt, B.Osborne, J.Kuby (2003) W.H.Freeman and Company NY, NY и цитируемые в них источники).

Способность «помнить» встречу с патогеном является определяющим признаком иммунной системы высших позвоночных. По-видимому, вклад В-клеток в «память» является функцией двух отдельных популяций В-клеток, долгоживущих плазматических клеток и В-клеток памяти (обзор см. в Tangye and Tarlinton (2009) Eur. J. Immunol., (2009) 39, 2065-2075). Их образование происходит в результате начального первичного иммунного ответа (антигенный стимул) наивных В-клеток. Одна популяция представлена долгоживущими плазматическими клетками, В-клетками, которые продолжают секретировать высокие уровни нейтрализующих антител в течение длительных периодов (месяцев) после элиминации антигена. Плазматические клетки прошли окончательную дифференциацию и содержат перестроенные локусы иммуноглобулинов, прошедшие созревание аффинности, которые кодируют антиген-специфические антитела с высокой аффинностью. Они отличаются от короткоживущих плазматических клеток со сроком жизни в несколько дней, которые погибают в результате стресса, вызванного интенсивным синтезом антиген-специфического антитела (см. Radbruch et al. (2006) Nature Reviews Immunology, 6, 741-750). В отличие от этого, вторая популяция антиген-специфических В-клеток памяти представляет популяцию В-клеток, также содержащих перестроенные локусы иммуноглобулинов, прошедших созревание аффинности, которые кодируют антиген-специфические антитела с высокой аффинностью, но которые не секретируют антитела в больших количествах. В-клетки памяти обладают способностью к быстрому делению и дифференциации в секретирующие антитела плазматические клетки после повторного воздействия начального иммунизирующего антигена. Это ведет к быстрому обогащению пула антиген-специфических иммуноглобулинов, доступных для ответа на данный антигенный стимул. Работа по вакцинации против натуральной оспы демонстрирует ответ В-клеток памяти у иммунизированных индивидуумов в течение периода в 50 лет (Grotty et al. (2003) J. Immunology, 171, 4969-4973).

У человека В-клетки памяти персистируют во вторичных лимфоидных органах, содержат перестроенные соматически мутировавшие гены иммуноглобулинов и опосредуют вторичный иммунный ответ на повторную сенсибилизацию (см. Bernasconi et al. (2002) Science, 298, 2199-2202). По-видимому, селезенка человека является одним из основных мест локализации клеток памяти (обзор см. в Tangye and Tarlinton (2009) Eur. J. Immunol., (2009) 39, 2065-2075).

Долгоживущие секретирующие антитела плазматические клетки персистируют во вторичных лимфоидных органах и костном мозге в течение месяцев. Например, антигензависимые секретирующие иммуноглобулины клетки персистируют в селезенке и костном мозге человека (Ellyard et al. (2004) Blood, 103, 3805-3812).

По-видимому, у других млекопитающих, таких как мыши, первичный длительный ответ с образованием антител является функцией долгоживущих плазматических клеток. Таким образом, у мышей окончательно дифференцированные долгоживущие плазматические клетки, присутствующие в костном мозге и селезенке, персистируют и продолжают секретировать антитела в течение длительных периодов времени, превышающих один год (см. Slifka et al. (1998) Immunity, 8, 363-372; Maruyama et al. (2000) Nature, 407, 636-641). Хотя у различных млекопитающих еще нужно достоверно установить точное взаимоотношение между клетками памяти и окончательно дифференцированными долгоживущими плазматическими клетками, у млекопитающих существует два пула долгоживущих В-клеток, каждый содержит перестроенные локусы иммуноглобулинов, прошедшие созревание аффинности, которые кодируют антиген-специфические антитела с высокой аффинностью. Один обладает способностью к быстрому делению. Другой не делится, но сохраняет способность секретировать антитело в течение длительных периодов.

Антиген-специфические тетрамерные антитела человека, продуцируемые пациентами, являются потенциальным источником клинически и коммерчески значимых антиген-специфических антител. Также их можно получить непосредственно из трансформированных EBV В-клеток человека, предпочтительно из трансформированных EBV В-клеток памяти человека, необязательно трансформированных в присутствие поликлональных активаторов В-клеток (PCT/IB04/01071).

До сих пор клетки памяти и долгоживущие плазматические клетки не были использованы в качестве источника кодируемых трансгенами антител с высокой аффинностью, в частности, антител человека или гибридных антител, содержащих VH и VL домены человека.

Создание доменов VН и антител, содержащих только тяжелые цепи

Способность антител, содержащих только тяжелые цепи и лишенных легких цепей, связывать антиген, установлена в 1960-х (см. Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). Тяжелые цепи иммуноглобулина, физически отделенные от легких цепей, сохраняют 8 0% антигенсвязывающей активности по отношению к тетрамерному антителу. Кроме того, активность связывания связывали с N-концевым фрагментом (Fd) тяжелой цепи. Пока в этих экспериментах использовали точно охарактеризованное антиген-специфическое поликлональное антитело кролика, они были репрезентативны для любой поликлональной популяции, которая содержит тетрамерное антитело, полученное у млекопитающего, включая человека. В димера тяжелых цепей сохранен связывающий домен СН1 легкой цепи.

Во многих публикациях 1980-х годов описаны манипуляции с генами тяжелых цепей in vitro с целью создания новых антител. Большинство этих работ основано на перестроенном гене µ антитела (IgM) мыши, который кодирует антитело, индуцированное против точно охарактеризованного антигена. Особенность этого антитела состоит в том, что известно, что антигенсвязывающую специфичность определяет домен VH, поскольку сборка и секреция с использованием несоответствующей легкой цепи показала сохранение связывания антигена (см. Neuberger and Williams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond., A317, 425-432). Используя эту систему, было показано, что антиген-специфический связывающий домен VH мыши можно использовать для получения нового антитела, которое содержит константную область ε человека, слитую с антиген-специфическим доменом VH мыши. Полученное химерное IgE сохраняло антигенную специфичность и проявляло эффекторную активность, ожидаемую от IgE (см. Neuberger et al. (1985) Nature, 314, 268-270).

Другие опубликованные примеры создания тяжелой цепи включают получение химерного антитела мыши-человека, которое содержит VH мыши, слитый с константными областями IgA или IgG человека (см. Morrison et al. (1984) PNAS, 81, 6851-6855; Sun et al. (1987) PNAS, 84, 214-218); и Heinrich et al. (1989) J. Immunol, 143, 3589-97). Таким образом, к концу 19080-х годов концепция создания тяжелых цепей была успешно сформулирована. Любой охарактеризованный связывающий домен VH можно слить с любой константной областью антитела с сохранением антиген-специфической активности связывания. Эффекторную функцию определяет выбранная константная область тяжелой цепи (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE и т.д.). Итоговое экспрессируемое химерное антитело во всех случаях содержит тетрамерное антитело.

Для создания целой тяжелой цепи человека необходим источник доменов VH человека с установленной связывающей специфичностью. Эта проблема частично решена посредством разработки библиотек последовательностей связывающих доменов VH человека, полученных с использованием сочетаний сегментов V, D и J наивной зародышевой линии человека или прошедших созревание аффинности доменов VH, полученных из тетрамерных антител, источником которых служат лимфоциты человека. Затем можно выделить антиген-специфические домены VH с аффинностями связывания в диапазоне от 20 нМ до 100 нМ из библиотек дисплеев связывающих доменов VH, полученных из мРНК антителопродуцирующих В-клеток периферической крови человека (см. Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546) или из случайных последовательностей VDJ, полученных из ДНК наивной зародышевой линии человека (см. ЕР-А-0368684). Эти подходы предоставляют источник антиген-специфических доменов VH млекопитающих и, в частности, доменов VH человека.

Предполагают, что:

«Выделенные вариабельные (VH) домены могут представлять собой альтернативу моноклональным антителам и выполняют ключевую функцию в связывании антител человека с высокой аффинностью»;

«Соединяя вариабельные домены с константными доменами легких или подходящих тяжелых цепей и экспрессируя собранные гены в клетках млекопитающих, можно получить целые антитела, которые будут выполнять естественные эффекторные функции, такие как лизис комплимента»; и

«Этот подход может подтвердить ценность создания терапевтически значимых антител человека» (см. Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546 и EP-A-0368684).

При использовании альтернативного подхода Sitia et al. ((1990) Cell, 60, 781-790) продемонстрировано, что удаление домена СН1 из перестроенного гена µ мыши приводит к синтезу и секреции антитела, содержащего только тяжелые цепи и лишенного легких цепей, клетками млекопитающих в культуре. В этом случае секретируемая тяжелая цепь, содержащая связывающий домен VH и константную область, состоящую из гибкого шарнирного домена и константных доменов СН2, СН3 и СН4 из IgM, обеспечивает димеризацию и эффекторную функцию тяжелых цепей.

Таким образом, к 1990 году стали доступны основные инструменты для создания гомодимеров антитела человека, содержащих только тяжелые цепи, in vitro (иногда их обозначают как Dabs-Fc) с установленными специфичностями связывания VH и для выбора эффекторных областей тяжелых цепей, лишенных СН1.

С этим подходом связано две проблемы:

домены VH, выбранные посредством массовых подходов, обладали относительно низкой антигенсвязывающей аффинностью (20-100 нМ); и

домены VH в отсутствие легких цепей были «липкими», нерастворимыми и склонными к агрегации и поэтому не приспособленными для фармацевтического применения.

Склонность выделенных доменов VH к агрегации является следствием отсутствия легкой цепи. Когда легкая цепь отсутствует, обнажены определенные гидрофобные боковые цепи, которые обычно скрыты в поверхности контакта тяжелой/легкой цепи. Кроме того, нарушена термодинамическая стабильность, поскольку стабильность доменов VH зависит от контактов на поверхности контакта легкой цепи (см. Worn and Pluckthun (1999) Biochemistry, 38, 8739-8750).

Приведенное авторами Hamers-Casterman описание встречающегося в природе гомодимерного антитела IgG, содержащего только тяжелые цепи и лишенного легких цепей, которое циркулирует у верблюдовых, в дополнение к нормальным тетрамерным антителам верблюдовых (см. Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363, 446-448) проливает свет на проблему растворимости. В соответствии с молекулой, созданной авторами Sitia et al. ((1990) Cell, 60, 781-790), функциональность CHI домена отсутствовала в антителах верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи, в связи с сайтом альтернативного сплайсинга, который устраняет СН1 из процессированной мРНК тяжелой цепи антитела.

Домены VH антител верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи (которые в соответствии с широким использованием далее в настоящем документе обозначают как домены VHH), полученные посредством сенсибилизации антигеном, проходили созревание аффинности в В-клетках in vivo, обладают аффинностями связывания в нижнем наномолярном диапазоне, растворимы и не склонны к агрегации (см. Ewert et al. (2002) Biochemistry, 41, 3628-3636). Как правило, домены VHH верблюдовых также проявляют повышенную тепловую стабильность по отношению к доменам VH, полученным из зародышевой линии и выделенным посредством подходов с использованием дисплеев, и в некоторой степени сохраняют активность связывания в присутствие денатурирующих средств, таких как детергенты и отбеливающие средства, а также после тепловой обработки (см. Dumoulin et al. (2002) Protein Science, 11, 500-511 и Dolk et al. (2005) Applied Environmental Microbiology, 71, 442-450).

Антиген-специфические антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно получить, используя мРНК В-клеток верблюдовых в стандартных способах клонирования или способами фаговых или других дисплеев (см. Riechmann and Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Антитела, содержащие только тяжелые цепи, полученные из верблюдовых, обладают высокой аффинностью. Анализ последовательностей мРНК, кодирующей антитело, содержащее только тяжелые цепи, демонстрирует, что источником разнообразия в первую очередь является сочетание перестройки VHHDJ и соматической гипермутации, что также наблюдают при образовании нормальных тетрамерных антител. Однако остается необходимым установить, образуют ли нормальные В-клетки верблюдовых антитела, содержащие только тяжелые цепи, в противоположность тетрамерным антителам. В действительности известно немногое о развитии пре-В клеток у верблюдовых (см. WO 2004/049794 и Zou et al. (2005) J. Immunology, 175, 3769-3779). Кроме того, остается необходимым установить, участвуют ли антитела верблюдовых, содержащие только тяжелые цепи, подобно тетрамерам иммуноглобулинов, содержащим тяжелые и легкие цепи, в длительном ответе с образованием антител посредством клеток памяти или посредством долгоживущих плазматических клеток.

Специфическим признаком антител верблюдовых, содержащих только тяжелые цепи, является то, что в домене VHH мутации подвергаются некоторые аминокислотные остатки, которые в нормальном домене VH взаимодействуют с VL доменом. Таким образом, лейцин в положении 45 в 98% VH последовательностей человека и мыши подвергается мутации. Предполагают, что эти мутации у верблюдовых, консервативные в зародышевой линии, согласуются с поддержанием растворимости VHH при отсутствии легкой цепи. Также описаны другие характерные мутации аминокислот в доменах VHH верблюдовых по сравнению с нормальными доменами VH. Среди них самые распространенные и важные изменения происходят в четырех положениях (тетрада VHH) во второй каркасной области, которые отвечают за снижение гидрофобности упомянутой поверхности контакта с легкой цепью. Как правило, выявляют Glu-44 и Arg-45 на месте менее гидрофильных Gly-44 и Leu-45, представленных в нормальных доменах VH, тогда как повышение гидрофильности в положении 4 7 происходит за счет замены Тyr на остатки меньшего размера. Четвертое изменение состоит в замене Val-37 на Phe или Тyr. Структурный анализ показывает, что это формирует малое гидрофобное ядро, типично включающее Tyr-91, Trp-103, Arg-45 и гидрофобные остатки, присутствующие в петле CDR3 домена VHH. Эти изменения повышают гидрофильность упомянутой поверхности контакта с легкой цепью посредством прямой замены на более гидрофильные боковые цепи или посредством извлечения гидрофобных боковых цепей из растворителя посредством взаимодействия между CDR3 и каркасными остатками (см. Bond et al. (2003) J. Mol. Biol., 332, 643-655).

В домене VHH петля CDR3 увеличена по отношению к той, что присутствует в тетрамерных антителах верблюдовых и других точно охарактеризованных тетрамерных антителах человека и мыши (см. Riechmann and Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Роль ключевых гидрофобных остатков, присутствующих в петле CDR3 VHH, например, в домене VHH ламы, демонстрирует структурную роль CDR3 в стабильности и растворимости доменов VHH (см. Bond et al. (2003) J. Mol. Biol, 332, 643-655). В совокупности структурные исследования доменов VHH демонстрируют, что стабильность и растворимость этих доменов зависят, в дополнение к каркасным остаткам, от CDR3, а также что требования к ключевым гидрофобным остаткам накладывает значительные ограничения на тип петли CDR3, совместимой с благоприятными биофизическими характеристиками доменов VHH по отношению к доменам VH (см. Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654).

Однако несмотря на высокую степень консервативности между последовательностями верблюдовых и человека, домены VHH верблюдовых сохраняют родство с верблюдовыми и поэтому являются потенциально антигенными для человека. Гуманизация in vitro может снизить этот риск, но ценой возможного снижения аффинности и растворимости в результате использования способов создания in vitro.

Связывающие домены УН человека и проблема растворимости

Плохие биофизические характеристики доменов VH человека и других млекопитающих, полученных из последовательностей зародышевой линии или из нормальных тетрамерных антител, по сравнению с доменами VHH верблюдовых, в частности, склонность к агрегации, в настоящее время ограничивают их полезность в качестве реактивов, диагностических и лекарственных средств (см. Rosenberg (2006) The AAPS Journal, 8(3), Article 59 E501-E507 и Fahrner et al. (2001) Biotechnol. Gen. Eng. Rev., 18, 301-327).

Первые попытки решить проблему растворимости были основаны на введении камелизирующих аминокислотных последовательностей в выбранные связывающие VH области человека на поверхности контакта VH/VL. Доказана несостоятельность этого подхода, поскольку на стабильность и растворимость нельзя повлиять посредством «камелизации» в положении 45 поверхности контакта VH/VL в отдельности (см. Domantis submissions, датированные 18-м мая 2007 года и 5-м июня 2007 года, в противовес ЕР-В-0656946). Действительно, введения направленных «камелизирующих» мутаций не достаточно для того, чтобы решить проблему «слипания» у выделенных доменов VH человека (см. Riechmann and Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38). Введение камелизирующих мутаций ведет к деформации β-складчатого слоя каркасной области, которая возможно отвечает за пониженную стабильность белка, наблюдаемую в результате этих экспериментов (см. Riechmann (1996) J. Mol. Biol., 259, 957-969). Кроме того, роль CDR3, содержащей ключевые гидрофобные остатки, в поддержании структурной стабильности и растворимости доменов VHH в отсутствие легкой цепи, добавляет сложности, что потенциально ограничивает разнообразие последовательностей CDR3 теми, что совместимы с каркасной областью верблюдовых (см. Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654).

Таким образом, домены VH млекопитающих, включая полученные у человека, которые получены из прошедших созревание аффинности природных тетрамерных антител или из последовательностей наивных сегментов VDJ зародышевой линии, в отсутствие легких цепей, относительно нерастворимым и подвержены агрегации. У таких доменов VH отсутствуют необходимые биофизические характеристики растворимого домена VH, подходящего для использования в качестве лекарственного средства.

Антитела, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены УН человека, полученные трансгенезом in vivo.

Растворимые связывающие домены VH для фармацевтического применения предпочтительно получены у человека и обладают признаками, такими как высокая антигенсвязывающая аффинность и растворимость при физиологических условиях при отсутствии агрегации. Такие растворимые связывающие домены VH также можно использовать в качестве диагностических средств и реактивов и они получат широкое распространение в промышленном и сельскохозяйственном применениях.

Альтернативный подход к получению антиген-специфических антител, содержащих только тяжелые цепи, состоит в использовании трансгенных мышей, которые содержат локусы тяжелых цепей, лишенных функциональности СН1 (см. Janssens et al. (2006) PNAS, 103:15130-5 и WO 02/085944).

Вначале не было известно, будут ли нормальные В-клетки мыши активироваться и секретировать антитела, содержащие только тяжелые цепи, в результате сенсибилизации антигеном или такие антитела будут обладать растворимостью. Кроме того, не было известно, необходимы ли IgM или, как у верблюдовых, ограничена ли экспрессия классами антител Igγ2 и Igγ3, или нормальные В-клетки мыши могут секретировать даже потенциально нерастворимые домены VH.

Авторы Janssens et al. ((2006) PNAS, 103:15130-5) описали локус гена химерной тяжелой цепи, который содержит два VHH генных сегмента ламы, все генные сегменты D и J человека и сочетания генных сегментов, кодирующих константные области Сµ и Сγ2 и Сγ3 человека, у которых отсутствует функциональность СН1. Выбор генных сегментов VHH ламы обеспечил то, что мутации каркасной области зародышевой линии, сохраняемые у верблюдовых на поверхности контакта VH/VL, также присутствуют в экспрессируемом камелизованном локусе человека с тем, чтобы увеличить возможность того, что полученный «камелизованный» домен VH может сохранять характеристики растворимости и стабильности, проявляемые VHH верблюдовых, таким образом повышая вероятность функционального ответа на сенсибилизацию антигеном даже в отсутствие петли CDR3, полученной у верблюдовых.

В результате было показано, что экспрессия трансгена антитела, содержащего только тяжелую цепь, происходит специфичным для В-клеток образом, что происходит размножение В-клеток и что в отсутствие функциональности СН1 присутствие любого функционального гена легкой цепи нецелесообразно. Трансгены, содержащие только тяжелые цепи, подвергаются перестройке VDJ, за которой следует активация В-клеток и созревание аффинности в ответ на сенсибилизацию антигеном. Также происходит переключение класса между IgM и IgG, содержащими только тяжелые цепи, равно как и переключение изотипа Сγ. В отсутствие Сµ в локусе, использование Сγ происходит с равным успехом. Специфичность антител в значительной степени определяется перестройкой VDJ (CDR3), тогда как анализ соматических мутаций показывает, что это происходит на всем протяжении области VH, предпочтительно в областях CDR1 и CDR2 экспрессируемого генного сегмента VHH ламы. Среди ограниченного числа охарактеризованных камелизованных антител человека, содержащих только тяжелые цепи, для всех подтвердили растворимость, будь они получены из В-клеток селезенки посредством фагового дисплея доменов VH или гибридомной селекцией, несмотря на тот факт, что петля CDR3, которую получали полностью из последовательностей человека, меньше тех, что найдены в доменах VHH верблюдовых.

Лучшие гибридные антитела ламы/человека, содержащие только тяжелые цепи, из этой ограниченной серии обладали аффинностями в диапазоне 1-3 нМ. Организм мыши также использует трансген в качестве другого локуса тяжелой цепи в этом размножении В-клеток, а селезенка имеет по существу нормальную структуру даже в отсутствие перестройки легкой цепи (см. Janssens et al. (2006) PNAS, 103:15130-5). Кроме того, механизмы аллельного исключения определяют продуктивную экспрессию эндогенного локуса тяжелой цепи мыши или трансгена тяжелой цепи, у которой отсутствует функциональность СН1 (см. WO 2007/09677).

К удивлению, наблюдения Janssens et al. ((2006) PNAS, 103:15130-5) указывают на то, что стабильные растворимые камелизованные антитела, содержащие только тяжелые цепи, можно получить с использованием каркасной области верблюдовых даже в отсутствие последовательностей верблюдовых, содержащих петлю CDR3.

В качестве расширения этих экспериментов (см. WO 2006/008548) созданы дополнительные линии трансгенных мышей, которые содержат полностью человеческие локусы генов только тяжелых цепей, у которых, таким образом, отсутствует последовательность, кодирующая каркасную область VHH верблюдовых, и которые, кроме того, содержат петли CDR3, полученные не из последовательностей верблюдовых.

В этом подходе вводили четыре естественных генных сегмента VH зародышевой линии человека (естественный локус V4), таким образом, полагаясь полностью на естественную селекцию посредством созревания аффинности для образования антигенной специфичности и структурной стабильности полученных растворимых доменов VH человека. Оба локуса содержат все генные сегменты D и J человека, генные сегменты Сγ2 и Сγ3 константной области человека, у каждого отсутствует СН1, энхансерные регуляторные элементы иммуноглобулина человека и, предпочтительно, LCR тяжелой цепи антитела.

Локус V4 человека функционален и антитела человека, содержащие только тяжелые цепи, циркулируют в плазме животных, которых не сенсибилизировали антигеном. После сенсибилизации антигеном, определяют антиген-специфические антитела человека, используя стандартный анализ ELISA. Локусы человека, содержащие сконструированные генные сегменты V (локус V17) (также см. WO 2008/035216), также функциональны (также см. Antibody Engineering and Antibody Therapeutics Meeting. F. Grosveld presentation, San Diego Antibody Meeting, December 3-4, 2007).

Кроме того, к удивлению сенсибилизация антигеном трансгенных мышей, содержащих локусы 44, позволяет выделить и охарактеризовать растворимые антиген-специфические домены VH человека с высокой аффинностью в отсутствие характерных мутаций каркасной области зародышевой линии верблюдовых и петли CDR3, похожей на петлю CDR3 верблюдовых, типичной для доменов VHH верблюдовых. Кроме того, домены VH, полученные из антиген-специфических антител человека, содержащих только тяжелые цепи, растворимы (см. WO 2006/008548). После сенсибилизации антигеном, перестройки VDJ и последующего размножения В-клеток, структура селезенки у мышей, содержащих локус V4 человека, по существу схожа с гуморальным ответом мышей дикого типа на сенсибилизацию антигеном. Световая микроскопия выявляет расщепление кластеризации Т-клеток в периартериолярном слое лимфоцитов (PALS), окруженном областями, богатыми В-клетками, включая фолликулы и краевые зоны, присутствующие на наружных границах белой пульпы. Также существуют структуры, схожие с терминальным центрами в В-клеточных фолликулах вторичных лимфоидных тканей, сопоставимые с мышами дикого типа в ходе Т-клеточно-зависимого гуморального ответа

Альтернативный подход к идентификации и конструированию синтетических доменов VH человека с использованием дисплея, который не зависит от прогностического анализа естественных последовательностей доменов VHH верблюдовых, также демонстрирует, что автономные домены VH со структурными свойствами, не входящие в спектр природных каркасных областей, можно получить, используя неприродные мутации, которые отличаются от тех, что выявлены у верблюдовых (см. Barthelemy et al. (2008) J. Biol. Chem., 283, 3639-3654 и патентную заявку США №11/102,502). Однако данные ничего не говорят о том, сохраняют ли такие домены VH биофизические характеристики растворимости при физиологических условиях при отсутствии агрегации в сочетании с аффинностями связывания в нижнем наномолярном диапазоне.

Несмотря на элегантность, подходы к идентификации и конструированию синтетических доменов VH человека посредством дисплея являются трудоемкими и ограничены объемом доступности доменов VH человека и трехмерной структурной информации о VHH верблюдовых. Тонкие различия возникают в зависимости от используемых сочетаний VDJ, которые ограничивают разработку библиотек VH на основе синтетических последовательностей с использованием разнообразий CDR3, не ограниченных структурными требованиями, которые обеспечивают связывание антигена с высокой аффинностью. В то время как результаты показывают, что в отличие от доменов VHH верблюдовых, растворимые стабильные конформации доменов VH человека не зависят от взаимодействий между петлей CDR3 и характерными заменами аминокислот верблюдовых в упомянутой поверхности контакта с легкой цепью, данные ограничены биофизическими, характеристиками. Например, в контексте этих изменений не учитывали сохранение связывания антигена с высокой аффинностью.

Изобретение

В настоящем изобретении описаны новые растворимые антитела с высокой аффинностью, содержащие только тяжелые цепи, и растворимые домены VH, структурно отличные от доменов VH, получаемых из нормальных тетрамерных антител или последовательностей зародышевой линии, подходящие для использования в качестве лекарственных средств, и предпочтительные пути для выделения таких новых антител, содержащих только тяжелые цепи, и растворимых доменов VH из трансгенных животных после сенсибилизации антигеном.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к новому антиген-специфическому растворимому антителу с высокой аффинностью, содержащему только тяжелые цепи, которое:

не содержит характерные замены аминокислот верблюдовых и содержит замены FR2, которые обнаружены в нормальных тетрамерных антителах;

обладает повышенной суммарной гидрофобностью в CDR1 и содержит увеличенное число заряженных аминокислот, присутствующих в CDR3; и

содержит одну или более замен аминокислот в β-складчатом слое каркасной области, которые ведут к повышению суммарной гидрофобности в FR1 и увеличению числа заряженных аминокислот, представленных в FR3.

Антитело, содержащее только тяжелые цепи, предпочтительно представляет собой антитело человека. Антитело человека, содержащее только тяжелые цепи, не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в нормальных тетрамерных антителах человека.

Антитело, содержащее только тяжелые цепи, предпочтительно имеет аффинность связывания 10 нМ или лучше и ведет себя как растворимый мономер при гель-фильтрации при физиологических буферных условиях.

Настоящее изобретение также относится к антиген-специфическому растворимому домену VH с высокой аффинностью, который:

не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в нормальных тетрамерных антителах;

обладает повышенной суммарной гидрофобностью в CDR1 и содержит увеличенное число заряженных аминокислот, присутствующих в CDR3; и

содержит одну или более замен аминокислот в β-складчатом слое каркасной области, которые выдут к повышению гидрофобности в FR1 и увеличению числа заряженных аминокислот, присутствующих в FR3.

Растворимый домен VH предпочтительно получен у человека. Растворимый домен VH человека не содержит характерные для верблюдовых замены аминокислот и содержит замены FR2, которые не найдены в нормальных тетрамерных антителах человека.

Растворимый домен VH предпочтительно имеет аффинность связывания 10 нМ или лучше и ведет себя как растворимый мономер при гель-фильтрации при физиологических буферных условиях.

Настоящее изобретение дополнительно относится к генному сегменту V, который после рекомбинации с генным сегментом D и генным сегментом J и последующего созревания аффинности, кодирует растворимый домен VH в соответствии с изобретением.

Необязательно, последовательность генного сегмента V можно сконструировать посредством по меньшей мере одной замены, вставки или делеции или их сочетания по отношению к естественной последовательности зародышевой линии генного сегмента V с тем, чтобы он содержал кодон(ы), кодирующие аминокислотные остатки или аминокислотные последовательности, которые отличны от последовательности зародышевой линии животного-хозяина, не представляют собой характерные для верблюдовых замены аминокислот, и могут представлять собой замены FR2, которые, как правило, не обнаруживают в нормальных тетрамерных антителах. Такие изменения могут содержать замены, вставки или делеции или их сочетание в областях CDR1 и/или CDR2 генного сегмента V с тем, чтобы увеличить разнообразие аминокислот, доступных для связывания антигена, по сравнению с последовательностями зародышевой линии.

Настоящее изобретение дополнительно относится к генному сегменту D, который после рекомбинации с генным сегментом V в соответствии с изобретением и генным сегментом J. кодирует домен VH в соответствии с изобретением.

Необязательно последовательность генного сегмента D можно сконструировать посредством по меньшей мере одной замены, вставки или делеции или их сочетания по отношению к естественной последовательности генного сегмента D зародышевой линии. Такая замена, вставка или делеция, или их сочетание, такова, что генный сегмент D может содержать кодоны, которые кодируют аминокислотные остатки, для которых установлено, что они содействуют сохранению растворимости и стабильности растворимого домена VH, включая последовательности, которые кодирует генный сегмент D, или альтернативно могут увеличивать разнообразие генного сегмента D в любой получаемой петле CDR3 по сравнению с последовательностями зародышевой линии.

Также настоящее изобретение дополнительно относится к генному сегменту J, который после рекомбинации с генным сегментом V в соответствии с изобретением и генным сегментом D, кодирует растворимый домен VH в соответствии с изобретением.

Необязательно последовательность генного сегмента J можно сконструирова