Вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток

Вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявок на патент США № 60/975104 от 25 сентября 2007 г., № 60/989840 от 22 ноября 2007 г. и № 60/989841 от 22 ноября 2007 г., содержание каждой из которых включено в настоящее описание в виде ссылок в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к компонентам микробных клеток, которые могут быть использованы для выработки антител, в том числе к пептидам, к полипептидам, в состав которых входят эти пептиды, к полинуклеотидам, которые кодируют эти пептиды или полипептиды, и к антителам, направленным к этим пептидам, полипептидам или полинуклеотидам. Изобретение также относится к векторам экспрессии и клеткам-хозяевам для продуцирования этих пептидов, полипептидов, полинуклеотидов и антител. Изобретение, кроме того, относится к способам и композициям, особенно к композициям вакцин, для детекции, таргетирования и подавления микробных клеток, особенно клеток-метанопродуцентов, с помощью одного или нескольких раскрытых пептидов, полипептидов, полинуклеотидов, антител, векторов экспрессии и клеток-хозяев.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В Новой Зеландии сельскохозяйственная деятельность учитывает выбросы большинства парниковых газов. Таким образом, сокращение сельскохозяйственных выбросов парниковых газов является важным для выполнения обязательств Новой Зеландии в рамках Киотского протокола. Протокол требует сокращения выбросов парниковых газов до уровня 1990 года к концу первого периода действия обязательств (2008-2012 годы). Для этого сельскохозяйственный комплекс и правительство Новой Зеландии создали научно-исследовательское объединение пастбищных парниковых газов (PGGRC), чтобы найти способы сокращения выбросов Новой Зеландией сельскохозяйственных парниковых газов.

Важной частью деятельности PGGRC были исследования в области сокращения выбросов метана пастбищным животноводством жвачных в Новой Зеландии. Снижение выбросов метана жвачными представляет коммерческий интерес по двум причинам. Во-первых, невыполнение обязательств в рамках Киотского протокола заставит правительство покупать дополнительные объемы разрешенных выбросов углерода. В настоящее время эта стоимость оценивается в 350 млн. долларов. Во-вторых, производство метана приводит к потере 8-12% суммарной энергии, производимой в рубце. Вместо этого эта энергия может быть использована для улучшения продуктивности жвачных.

Метан образуется в рубце бактериями, называемыми метанопродуцентами, которые являются частью типа Euryarchaeota в царстве Archaea. Большинство метанопродуцентов растут на CO₂ и H₂ в качестве единственного источника энергии, но некоторые из них для роста могут использовать ацетатные или метиловые соединения. В рубце существует несколько различных родов метанопродуцирующих архей, но виды рода Methanobrevibacter, особенно M. ruminantium и M. smithii, считаются преобладающими метанопродуцентами у жвачных Новой Зеландии. M. ruminantium в настоящее время является объектом проекта секвенирования генома, финансируемого PGGRC. Этот проект является первым секвенированием генома метанопродуцентов из рубца, и он направлен на создание лучшего понимания биологии Methanobrevibacter, чтобы обнаружить мишени для подавления образования метана.

Для снижения производства метана в рубце необходимо подавление метанопродуцентов или инактивация их метаболического пути метаногенеза. Средство для подавления производства метана заключается в определении конкретных молекул, которые подавляют клетки-метанопродуценты. Это может быть достигнуто, например, путем использования средств, таргетирующих метанопродуценты. В одном из подходов можно получить вакцины, таргетирующие микробные клетки. Таким образом, было бы полезно идентифицировать компоненты, в особенности, компоненты клеточных поверхностей микробных клеток, в том числе пептиды и полипептиды, а также связанные с ними полинуклеотиды и антитела, которые могут быть использованы для противомикробных вакцин.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно изобретению описаны выделенные пептиды, полипептиды и полинуклеотиды М. ruminantium, в частности компоненты клеточных поверхностей М. ruminantium, равно как и векторы экспрессии, клетки-хозяева и антитела, а также способы их применения, как это подробно описано в настоящем описании.

Согласно изобретению конкретно описан выделенный пептид, включающий, например, по меньшей мере фрагмент одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702. В конкретном аспекте этот пептид включает по меньшей мере фрагмент аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:45-260 и 332-702. В еще одном аспекте пептид включает по меньшей мере фрагмент аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:10-17. В другом аспекте пептид представляет собой фрагмент, например, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, включающую внеклеточный домен любой из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702.

Согласно изобретению конкретно описан выделенный полипептид, включающий, например, по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702. В конкретном аспекте полипептид включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:45-260 и 332-702. В еще одном аспекте полипептид включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:10-17. В другом аспекте полипептид представляет собой фрагмент, например, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, включающую внеклеточный домен любой из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702.

Согласно изобретению дополнительно описан выделенный полинуклеотид, включающий кодирующую последовательность по меньшей мере одного пептида. В одном аспекте полинуклеотид содержит кодирующую последовательность по меньшей мере фрагмента аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702. В конкретном аспекте полинуклеотид содержит кодирующую последовательность по меньшей мере фрагмента любой из SEQ ID NO:45-260 и 332-702. В еще одном аспекте полинуклеотид содержит кодирующую последовательность по меньшей мере фрагмента любой из SEQ ID NO:10-17. В другом аспекте полинуклеотид содержит фрагмент последовательности, кодирующей, например, по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, включающую внеклеточный домен любой из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702.

Согласно изобретению дополнительно описан выделенный полинуклеотид, включающий кодирующую последовательность по меньшей мере одного полипептида. В одном аспекте полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702. В конкретном аспекте полинуклеотид содержит кодирующую последовательность любой из SEQ ID NO:45-260 и 332-702. В еще одном аспекте полинуклеотид содержит кодирующую последовательность для любой из SEQ ID NO:10-17. В другом аспекте полинуклеотид содержит фрагмент последовательности, кодирующей, например, по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, включающую внеклеточный домен любой из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702.

В дополнительном аспекте согласно изобретению описан выделенный полинуклеотид, включающий, например, последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:703-1395. В конкретном аспекте полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO:703-710. В другом аспекте полинуклеотид представляет собой фрагмент или олигонуклеотид, включающий, например, последовательность нуклеиновой кислоты, включающую внеклеточный домен, кодируемый любой из SEQ ID NO:703-710, 737-931 и 1003-1395. Кроме того, изобретение включает выделенный полинуклеотид или его фрагмент, гибридизуемый с любой из этих последовательностей нуклеиновых кислот с SEQ ID NO:703-1395. Изобретение дополнительно включает выделенный полинуклеотид, включающий комплемент, обратный комплемент, обратную последовательность или их фрагменты любой из этих последовательностей нуклеиновых кислот.

Согласно изобретению описан вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по изобретению. В одном аспекте вектор экспрессии содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702. В конкретном аспекте вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере фрагмента по меньшей мере одной из SEQ ID NO:45-260 и 332-702. В еще одном аспекте вектор экспрессии содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность по меньшей мере одной из SEQ ID NO:10-17. В другом аспекте вектор экспрессии содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, включающую внеклеточный домен любой из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702.

Согласно изобретению также описана клетка-хозяин, например микробная клетка-хозяин, включающая по меньшей мере один вектор экспрессии.

Согласно изобретению конкретно описано антитело, направленное к пептиду, полипептиду или полинуклеотиду, как указано в настоящем описании. В некоторых аспектах антитело направлено к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702. В альтернативных аспектах антитело направлено к по меньшей мере фрагменту полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702. В конкретном аспекте антитело связывается по меньшей мере с фрагментом пептидной последовательности любой из SEQ ID NO:10-17. В еще одном аспекте антитело связывается по меньшей мере с фрагментом полипептидной последовательности любой из SEQ ID NO:45-260 и 332-702. В альтернативном аспекте антитело связывается по меньшей мере с фрагментом пептида или полипептида, включающего внеклеточный домен любой из SEQ ID NO:10-17, 45-260 и 332-702. В другом аспекте антитело включает одну или несколько химер или конъюгатов по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например с соединениями, препятствующими метаногенезу (например, с бромэтансульфокислотой), с антителами и с фрагментами антител, с лизирующими ферментами, с пептид-нуклеиновыми кислотами, с антимикробными пептидами и с другими антибиотиками, как описано подробно в настоящем описании.

Согласно изобретению дополнительно описаны модифицированные пептиды или полипептиды, например по меньшей мере один из SEQ ID NO:1-702, в том числе биологически активные модификации, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящем описании. Также описаны полинуклеотиды, кодирующие эти модифицированные пептиды или полипептиды, а также модификации, фрагменты, варианты и производные раскрытых полинуклеотидов; антитела, полученные с помощью этих модифицированных пептидов, полипептидов или полинуклеотидов; векторы экспрессии, включающие эти полинуклеотиды, и клетки-хозяева, включающие эти векторы. Далее описаны модифицированные антитела, в том числе биологически активные модификации, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящем описании. В отдельных аспектах в композициях и способах по изобретению используют эти модифицированные пептиды, полипептиды, полинуклеотиды, антитела либо соответствующие векторы экспрессии или клетки-хозяева.

Согласно изобретению описана композиция, включающая выделенный пептид или полипептид, например по меньшей мере один из SEQ ID NO:1-702. Также описана композиция, включающая выделенный полинуклеотид, например по меньшей мере один из SEQ ID NO:703-1395. Согласно изобретению дополнительно описана композиция, включающая антитело, например, направленное к последовательности пептидов, полипептидов или полинуклеотидов, раскрытых в настоящем описании. Далее описана композиция, которая включает вектор экспрессии или клетку-хозяина, включающую вектор экспрессии, в соответствии с изобретением. Эта композиция может включать любые из биологически активных модификаций, фрагментов, вариантов и производных, описанных в настоящем описании. Композиции могут включать по меньшей мере один клеточный ингибитор (например, в виде химеры или конъюгата) и могут быть составлены, например, в виде фармацевтических композиций, в частности в виде композиций вакцин.

Согласно изобретению также описана композиция по изобретению как составляющая набора для таргетирования и/или подавления микробных клеток, особенно клеток-метанопродуцентов, в соответствии с раскрытыми способами. Наборы содержат: a) по меньшей мере одну композицию, как описано выше; и b) факультативно, инструкцию по использованию, например по таргетированию клеток или по подавлению клеточного роста или репликации у метанопродуцентов или других микробов.

Согласно изобретению также описан способ получения пептида или полипептида, например по меньшей мере фрагмента любой из SEQ ID NO:1-702, включающий: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, включающей вектор экспрессии, который содержит по меньшей мере часть последовательности, кодирующей по меньшей мере один пептид или полипептид, в условиях, пригодных для экспрессии данного пептида или полипептида; и b) извлечение пептида или полипептида из культуры. В конкретных аспектах пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702 или их модифицированных последовательностей.

Согласно изобретению также описан способ получения антитела, например, направленного по меньшей мере к фрагменту любой из SEQ ID NO:1-702, включающий: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, включающей вектор экспрессии, который содержит по меньшей мере часть последовательности, кодирующей по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, в условиях, пригодных для экспрессии этого антитела или фрагмента антитела; и b) извлечение этой аминокислотной последовательности из культуры. В конкретных аспектах антитело или фрагмент антитела направлен по меньшей мере к одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702 или их модифицированных последовательностей. В альтернативном аспекте антитело получают иммунизацией животного-хозяина, как об этом подробно описано в настоящем описании.

Согласно изобретению дополнительно описан способ получения антитела, например, направленного по меньшей мере к фрагменту любой из SEQ ID NO:1-702, которое включает химеру или конъюгат по меньшей мере с одним клеточным ингибитором. Такой способ включает: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, включающей вектор экспрессии, который содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, в условиях, пригодных для экспрессии этого антитела или фрагмента антитела; b) получение химеры или конъюгата с данным антителом или фрагментом антитела (например, путем экспрессии фьюжн-последовательности или химической конъюгации с данным клеточным ингибитором); и c) извлечение химеры или конъюгата.

В конкретных аспектах антитело направлено по меньшей мере к одному фрагменту любой из SEQ ID NO:1-702 или их модифицированных последовательностей. В дальнейших аспектах ингибитор выбирают из соединений, препятствующих метаногенезу (например, бромэтансульфокислота), из антител и из фрагментов антител, из лизирующих ферментов, из пептид-нуклеиновых кислот, из антимикробных пептидов и из других антибиотиков, как описано подробно в настоящем описании. В альтернативном аспекте антитело получают иммунизацией животного-хозяина, а затем конъюгацией, как это подробно описано в настоящем описании.

Кроме того, согласно изобретению описан способ подавления (например, ингибирования роста или репликации) микробной клетки, в частности клетки-метанопродуцента, включающий: введение клетки в контакт с антителом или фрагментом антитела, например, направленного по меньшей мере к фрагменту любой из SEQ ID NO:1-702, либо с химерой или конъюгатом антитела либо с любым модифицированным антителом.

В качестве еще одного способа клетку подавляли введением композиции вакцины, как подробно описано в настоящем описании.

Согласно изобретению далее описан способ подавления (например, ингибирования роста или репликации) микробной клетки, в частности клетки-метанопродуцента, включающий: a) факультативно, получение или выделение по меньшей мере одного антитела, как указано в настоящем описании; и b) введение клетки в контакт с антителом. В конкретном аспекте антитело направлено по меньшей мере к фрагменту любой из SEQ ID NO:1-702 либо их модифицированным последовательностям. В некоторых аспектах антитело дополнительно включает по меньшей мере один клеточный ингибитор, присоединенный, например, в виде химеры или конъюгата. В других аспектах антитело вводят пациенту в виде композиции, например в виде композиции вакцины.

Кроме того, согласно изобретению описан способ подавления (например, ингибирования роста или репликации) микробной клетки, в частности клетки-метанопродуцента, включающий: a) факультативно, получение или выделение по меньшей мере одного пептида или полипептида, как указано в настоящем описании; и b) введение пептида или полипептида пациенту для индукции на них иммунного ответа. В конкретном аспекте пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-702 или их модифицированных последовательностей. В других аспектах пептид или полипептид вводят пациенту в виде композиции, например в виде композиции вакцины.

Согласно изобретению, кроме того, описан способ детекции и/или измерения концентраций полипептидов, в частности полипептида на поверхности клетки, либо соответствующих пептидов или полинуклеотидов, включающий: 1) введение образца от пациента в контакт с антителом, направленным к этому полипептиду (например, по меньшей мере к фрагменту любой из SEQ ID NO:1-702 или их модифицированных последовательностей), или с соответствующим пептидом или полинуклеотидом (например, по меньшей мере с одним фрагментом из SEQ ID NO:703-1395 или с их модифицированными последовательностями); и 2) определение наличия или концентрации образовавшегося комплекса антител с соответствующим полипептидом, пептидом или полинуклеотидом в образце. Такие способы также могут быть использованы для детекции и/или измерения титров микробных клеток, в частности клеток-метанопродуцентов.

Согласно изобретению также описан способ детекции и/или измерения концентраций полинуклеотидов, в частности полинуклеотида, кодирующего компонент клеточной поверхности, включающий: 1) введение образца от пациента в контакт с комплементарным полинуклеотидом (например, с последовательностью, комплементарной по меньшей мере фрагменту любой из SEQ ID NO:703-1395 или их модифицированных последовательностей); и 2) определение наличия или концентрации гибридизационного комплекса, образовавшегося с полинуклеотидом в образце. Такие способы также могут быть использованы для детекции и/или измерения титров микробных клеток, в частности клеток-метанопродуцентов.

В конкретных аспектах в способах по изобретению используют компоненты in vivo или in vitro экспрессии. В других аспектах в этих способах используют пептиды, полипептиды, полинуклеотиды или антитела, вырабатываемые рекомбинантными, синтетическими или полусинтетическими средствами либо эндогенными средствами.

Иные аспекты и варианты осуществления по изобретению описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Это изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления такового и со ссылкой на фигуры.

ФИГУРЫ 1A-1C. Сравнение геномов Methanobacteriales (фиг. 1A); статистика генома M. ruminantium (фиг. 1B); гены, предположительно участвующие в метаногенезе видов Methanobacteriales (фиг. 1C).

ФИГУРА 2. Схема вакцинации.

ФИГУРА 3. Гуморальные иммунные ответы овец на вакцинацию препаратами клеточной стенки M. ruminantium и пептидами, разработанными против M. ruminantium mtr, а также белками клеточной поверхности.

ФИГУРА 4. Последовательности пептидов, использованные для производства антител.

ФИГУРЫ 5A-5B. Открытые рамки считывания, отобранные для производства антител: нуклеотидные последовательности (фиг. 5A); аминокислотные последовательности (фиг. 5B).

ФИГУРЫ 6A-6C. Открытые рамки считывания, кодирующие ферменты метаболического пути метаногенеза, идентифицированные у M. ruminantium: аннотирование (фиг. 6A); нуклеотидные последовательности (фиг. 6B); аминокислотные последовательности (фиг. 6C).

ФИГУРЫ 7A-7C. Открытые рамки считывания для белков клеточной поверхности, идентифицированные у M. ruminantium: аннотирование (фиг. 7A); нуклеотидные последовательности (фиг. 7B); аминокислотные последовательности (фиг. 7C).

ФИГУРЫ 8A-8C. Открытые рамки считывания, кодирующие биосинтез экзополисахаридов, идентифицированные у M. ruminantium: аннотирование (фиг. 8A); нуклеотидные последовательности (фиг. 8B); аминокислотные последовательности (фиг. 8C).

ФИГУРЫ 9A-9C. Открытые рамки считывания, включающие трансмембранные домены, идентифицированные у M. ruminantium: аннотирование (фиг. 9A); нуклеотидные последовательности (фиг. 9B); аминокислотные последовательности (фиг. 9C).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термин «антитела» следует понимать в самом широком смысле, и он предположительно включает интактные моноклональные антитела и поликлональные антитела. Он также предположительно охватывает фрагменты и производные антител до той длины, пока они еще проявляют желательную биологическую активность. Антитела включают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов (Ig), то есть молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (иммунохимически реагирует) с антигеном. Они включают, не исчерпываясь перечисленными, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, Fc, Fab, Fab' и Fab₂ фрагменты, а также библиотеку экспрессируемых Fab.

Молекулы антител относятся к какому-либо из классов: IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, которые отличаются друг от друга по природе тяжелой цепи, присутствующей в молекуле. Они включают подклассы, например, такие как IgG1, IgG2 и другие. Легкой цепью могут быть каппа-цепь или лямбда-цепь. Ссылка в настоящем описании на антитела включает ссылку на все классы, подклассы и типы. Также включены химерные антитела, например моноклональные антитела или их фрагменты, которые специфичны для более чем одного источника, например для одной или более последовательностей мыши, человека или жвачных животных. Дополнительно включены «верблюжьи» антитела (одноцепочечные миниантитела семейства верблюдовых) или нанотела. Понятно, что каждая ссылка на «антитела» или любой похожий термин в настоящем описании включает интактные антитела, а также любые фрагменты, модификации, производные или их варианты.

«Видоизмененные» последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие пептиды, полипептиды или антитела, используемые в настоящем описании, включают указанные последовательности с делециями, вставками или заменами различных нуклеотидов, что дает в результате полинуклеотид, который кодирует те же или функционально эквивалентные последовательности. Кодируемый пептид, полипептид или антитело может также быть «видоизменен» и содержать такие делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые вызывают «молчащие» изменения и в результате дают функционально эквивалентные последовательности. Умышленные аминокислотные замены могут быть проделаны на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков до тех пор, пока сохраняется биологическая активность (например, ассоциация клеток, ассоциация мембран) или иммуногенная/иммунологическая активность. Например, отрицательно заряженные аминокислоты могут включать аспарагиновую и глутаминовую кислоты, положительно заряженные аминокислоты могут включать лизин и аргинин, а аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, имеющие сходные значения гидрофильности, могут включать лейцин, изолейцин и валин, глицин и аланин, аспарагин и глутамин, серин и треонин, также фенилаланин и тирозин.

«Аминокислотной последовательностью», используемой в настоящем описании, называется последовательность олигопептида, пептида, полипептида, белка или антитела, и любого его фрагмента, и любых молекул, имеющих природное, рекомбинантное, синтетическое или полусинтетическое происхождение. Последовательности по изобретению содержат по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере от 5 до 10, от 10 до 20, от 20 до 30, от 30 до 40, от 40 до 50, от 50 до 100, от 100 до 150, от 150 до 200 или от 200 до 250 аминокислот. Последовательности сохраняют биологическую активность (например, влияние на рост клеток и/или пролиферацию) или иммуногенную/иммунологическую активность аминокислотной последовательности. «Аминокислотная последовательность» и любые похожие термины не исчерпываются только полной, нативной аминокислотной последовательностью, связанной с полноразмерной молекулой, но также включают и любые их фрагменты, модификации, производные и варианты.

«Амплификацией», используемой в настоящем описании, называется производство дополнительных копий последовательности нуклеиновой кислоты, и ее, как правило, проводят с помощью технических средств полимеразной цепной реакции (ПЦР), хорошо известных в данной области (Dieffenbach, C.W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).

Терминами «биологически активный» или «функциональный», используемыми в настоящем описании, называется пептид или полипептид, сохраняющий одну или несколько структурных, иммуногенных или биохимических функций (например, ассоциация клеток, ассоциация мембран) последовательности природного происхождения.

Терминами «клеточный ингибитор» или «ингибитор», используемыми в настоящем описании, называются средства, которые уменьшают или блокируют рост или репликацию микробных клеток, особенно клеток-метанопродуцентов. Клеточный ингибитор может действовать так, чтобы уменьшить или блокировать, например, клеточное деление. Ингибитор может уменьшить или блокировать, например, синтез ДНК, синтез РНК, синтез белка или посттрансляционные модификации. Ингибитор может также уменьшить или блокировать активность ферментов, участвующих в метаболическом пути метаногенеза. Ингибитор может также таргетировать клетку для распознавания компонентами иммунной системы. Подавление клетки также включает убийство клеток и клеточную смерть, например, в результате лизиса, апоптоза, некроза и т.д. Полезные ингибиторы включают, не исчерпываясь перечисленными, соединения, препятствующие метаногенезу (например, бромэтансульфокислота), антитела и фрагменты антител, лизирующие ферменты, пептид-нуклеиновые кислоты, антимикробные пептиды и другие антибиотики, как подробно описано в настоящем описании.

Терминами «комплементарный» или «комплементарность», используемыми в настоящем описании, называется нормальное связывание полинуклеотидов в щадящих солевых и температурных условиях путем спаривания оснований. Для последовательности A-G-T комплементарной последовательностью является T-C-A, обратный комплемент представляет собой A-C-T, и обратной последовательностью является T-G-A. Комплементарность между двумя одноцепочечными молекулами может быть частичной, при которой связываются лишь некоторые из нуклеиновых кислот, или она может быть полной, когда существует полная комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновых кислот оказывает существенное влияние на эффективность и прочность гибридизации между цепями нуклеиновых кислот. Это имеет особое значение для реакций амплификации, которые зависят от связывания между цепями нуклеиновых кислот, а также для разработки и применения молекул пептид-нуклеиновых кислот (PNA).

Термином «производное», используемым в настоящем описании, называется химическая модификация нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, полипептид или антитело, либо нуклеиновой кислоты, комплементарной ей. Такие модификации включают, например, замещение водорода на алкил, ацил или аминогруппу. В предпочтительных аспектах производные нуклеиновых кислот кодируют пептид, полипептид или антитело, которые сохраняют биологическую или иммуногенную/иммунологическую активность природной молекулы. Производные пептида, полипептида или антитела представляют собой то, что модифицировано путем гликозилирования, пэгилирования или любого аналогичного процесса, который сохраняет одну или несколько биологических функций (например, ассоциация клеток, ассоциация мембран) или иммуногенную/иммунологическую активность последовательности, из которой они получены.

Термином «гомология», используемым в настоящем описании, называется степень комплементарности. Существует частичная гомология (то есть менее 100% идентичности) или полная гомология (то есть 100% идентичности). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично удерживает идентичную последовательность от гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой, называется функциональным термином «практически гомологичный». Подавление гибридизации полностью комплементарной последовательности с целевой последовательностью может быть изучено с помощью гибридизационного анализа (например, саузерн-блоттинга или нозерн-блоттинга, гибридизации в растворе и т.п.) в условиях низкой строгости. Практически гомологичная последовательность или гибридизационный зонд будет конкурировать и подавлять связывание полностью гомологичной последовательности с целевой последовательностью в условиях низкой строгости. Это не означает, что условия низкой строгости таковы, что допускается неспецифическое связывание; условия низкой строгости требуют, чтобы связывание двух последовательностей друг с другом было специфическим (т.е. избирательным) взаимодействием.

Термином «гибридизация», используемым в настоящем описании, называется любой процесс, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью посредством спаривания оснований.

«Вставкой» или «добавлением», используемым в настоящем описании, называется изменение аминокислотной или нуклеотидной последовательности в результате добавления одного или нескольких аминокислотных остатков или нуклеотидов соответственно по сравнению с молекулой природного происхождения.

«Метанопродуцентами», используемыми в настоящем описании, называются микробы, которые производят газообразный метан, включающие Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium и Methanosarcina. Конкретные метанопродуценты включают, не исчерпываясь перечисленными, Methanobrevibacter ruminantium (то есть штамм M1 или штамм DSM1093), Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicicum, Methanothermobacter marburgensis, Methanothermvobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicrobium mobile, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanococcoides burtonii и Methanolobus taylorii. Все роды и виды метанопродуцентов охватываются этим термином.

«Микробными» клетками, используемыми в настоящем описании, называются клетки микроорганизмов природного происхождения или генетически измененные, включая архебактерии, такие как метанопродуценты, галофилы и термоацидофилы, и эубактерии, такие как цианобактерии, спирохеты, протеобактерии, а также грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Термином «модифицированный» называются видоизмененные последовательности и фрагменты последовательностей, варианты и производные, как описано в настоящем описании.

«Последовательностью нуклеиновых кислот» или «нуклеотидной последовательностью», используемыми в настоящем описании, называется последовательность полинуклеотида, олигонуклеотида или их фрагментов, а также ДНК или РНК природного, рекомбинантного, синтетического или полусинтетического происхождения, которые могут быть одно- или двухцепочечными и могут представлять смысловые или антисмысловые цепи, кодирующие и некодирующие области. Последовательности по изобретению предпочтительно включают по меньшей мере 12, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 300, 450, 600, 750 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере от 15 до 30, от 30 до 60, от 60 до 90, от 90 до 120, от 120 до 150, от 150 до 300, от 300 до 450, от 450 до 600, или от 600 до 750 нуклеотидов, или по меньшей мере 1000 нуклеотидов, или по меньшей мере 1500 нуклеотидов. Понятно, что каждая ссылка на «последовательность нуклеиновых кислот» или «нуклеотидную последовательность» в настоящем описании будет включать нативную, полноразмерную последовательность, а также любые комплементы, фрагменты, модификации, производные или их варианты.

Термином «олигонуклеотид» называется последовательность нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 25, 27, 30, или 36 нуклеотидов, или по меньшей мере от 12 до 36 нуклеотидов, или по меньшей мере от 15 до 30 нуклеотидов, которая может быть использована при ПЦР амплификации, секвенировании или гибридизационных анализах. Используемый в настоящем описании термин «олигонуклеотид» практически эквивалентен терминам «амплимеры», «праймеры», «олигомеры» и «зонды», как обычно формулируется в данной области.

Термином «полинуклеотид», использован ли он в единственном или множественном числе, как правило, называется какая-либо последовательность нуклеиновых кислот, например какой-либо полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, которая может являться немодифицированной РНК или ДНК либо модифицированной РНК или ДНК. Эта последовательность включает, помимо прочего, одно- и двухцепочечные ДНК, ДНК, включающую одно- и двухцепочечные области, одно- и двухцепочечные РНК и РНК, включающую одно- и двухцепочечные области, гибридные молекулы ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что более типично, двухцепочечными или включать одно- и двухцепочечные области. Также сюда включаются трехцепочечные области, включающие РНК или ДНК или как ДНК, так и РНК. Специально включенными являются мРНК, кДНК и геномные ДНК, а также любые их фрагменты. Этот термин включает ДНК и РНК, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований, таких как меченные тритием основания или минорные основания, такие как инозин. Данные полинуклеотиды по изобретению могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, либо смысловые или антисмысловые последовательности, либо интерферирующие РНК, например малые интерферирующие РНК. Понятно, что каждая ссылка на «полинуклеотид» или аналогичный термин в настоящем описании будет включать полноразмерные последовательности, так же как и любые комплементы, фрагменты, модификации, производные или их варианты.

«Пептидом» и «полипептидом», используемыми в настоящем описании, называются выделенные пептиды или полипептиды по изобретению, полученные из любого вида, желательно микроорганизмов, из любого источника, будь то природного, синтетического, полусинтетического или рекомбинантного происхождения. В частности, пептид или полипептид по изобретению может быть получен из клеток метанопродуцентов, таких как клетки Methanobrevibacter, в частности M. ruminantium, или клетки M. smithii. Для рекомбинантного производства пептид или полипептид по изобретению может быть получен из микробных или эукариотических клеток, например, таких как Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Salmonella, дрожжи, клеток насекомых, таких как дрозофилы, клеток животных, таких как клетки COS и СНО, или клеток растений. Понятно, что каждая ссылка на «пептид» или «полипептид» в настоящем описании будет включать полноразмерную последовательность, так же как и любые фрагменты, модификации, производные или их варианты.

«Пептид-нуклеиновой кислотой» или «PNA», используемой в настоящем описании, называется антисмысловая молекула или антигенное средство, которые включают основания, связанные через пептидный остов.

Термином «жвачные», используемым в настоящем описании, называются животные, у которых есть рубец в качестве особого рода пищеварительного органа. Жвачные в