Модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения

Модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к модифицированным последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим фактор коагуляции VIII (FVIII) и фактор Виллебранда (VWF), а также их комплексы и их производные, рекомбинантным экспрессионным векторам, содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот, клеткам-хозяевам, трансформированным такими рекомбинантными экспрессионными векторами, кодируемым такими последовательностями нуклеиновых кислот, рекомбинантным полипептидам и производным, которые действительно обладают биологическими активностями вместе с удлиненным полупериодом существования in vivo и/или увеличенным отношением фактической максимальной концентрации in vivo (в крови и т.п.) к ожидаемой по сравнению с немодифицированным белком дикого типа. Настоящее изобретение также относится к соответствующим последовательностям FVIII, которые дают в результате увеличенное количество продукта экспрессии. Настоящее изобретение, кроме того, относится к процессам производства таких рекомбинантных белков и их производных. Настоящее изобретение также относится к вектору переноса для применения в генной терапии людей, который включает такие модифицированные последовательности нуклеиновых кислот.

Предпосылки создания изобретения

Существуют различные нарушения свертываемости крови, вызываемые недостатками факторов свертывающей системы крови. Самыми часто встречающимися нарушениями являются гемофилии A и B, являющиеся следствием недостатков фактора свертывающей системы крови VIII и IX соответственно. Другим известным нарушением свертываемости крови является болезнь Виллебранда.

В плазме FVIII существует, главным образом, в виде нековалетного комплекса с VWF, и его коагулирующей функцией является ускорение зависимого от фактора IXa превращения фактора X в Xa. Вследствие образования комплекса из FVIII и VWF в течение длительного времени полагали, что функции FVIII и VWF представляют собой две функции одной и той же молекулы. Только в семидесятых годах стало ясно, что FVIII и VWF являются отдельными молекулами, которые образуют комплекс в физиологических условиях. Затем в восьмидесятых годах была определена константа диссоциации, составляющая приблизительно 0,2 нмоль/л (Leyte et al., Biochem J. 1989, 257: 679-683), и были изучены последовательности ДНК обеих молекул.

Классическая гемофилия или гемофилия A является наследственным нарушением свертываемости крови. Она является следствием сцепленного с X-хромосомой недостатка FVIII свертывающей системы крови и поражает почти исключительно мужчин с частотой, составляющей один-два индивидуума на 10000. Дефект X-хромосомы передается женщинами-носителями, которые сами не больны гемофилией. Клиническим проявлением гемофилии A является повышенная склонность к кровотечениям. До внедрения лечения концентратами FVIII средняя продолжительность жизни человека с тяжелой гемофилией составляла менее 20 лет. Использование концентратов FVIII из плазмы значительно улучшило ситуацию для страдающих гемофилией A пациентов, намного увеличив среднюю продолжительность жизни, дав большинству из них возможность жить более или менее нормальной жизнью. Однако существовали определенные проблемы с получаемыми из плазмы концентратами и их применением, самой серьезной из которых была передача вирусов. Пока серьезно поражали популяцию вирусы, вызывающие гепатит B, гепатит ни-A, ни-B и СПИД. С тех пор были разработаны недавно различные способы инактивации вирусов и новые в высокой степени очищенные концентраты FVIII, которые установили очень высокий стандарт безопасности также для получаемого из плазмы FVIII.

Клонирование кДНК для FVIII (Wood et al. 1984. Nature 312: 330-336; Vehar et al. 1984. Nature 312: 337-342) сделало возможной экспрессию FVIII рекомбинатно, что привело к разработке нескольких продуктов в виде рекомбинантного FVII, которые были разрешены регулирующими органами между 1992 и 2003. То обстоятельство, что центральный B-домен полипептидной цепи FVIII, находящийся между аминокислотами Arg-740 и Glu-1649, по-видимому, не является нужным для полной биологической активности, также привело к разработке FVIII с делецией В-домена.

Зрелая молекула FVIII состоит из 2332 аминокислот, которые можно сгруппировать в три гомологичных A-домена, два гомологичных C-домена и B-домен, которые располагаются в порядке A1-A2-B-A3-C1-C2. Полная аминокислотная последовательность зрелого FVIII человека представлена в SEQ ID NO: 15. Во время секреции в плазму FVIII процессируется внутриклеточно в ряд связанных ионом металла гетеродимеров, когда одноцепочечный FVIII расщепляется на границе B-A3 и в различных сайтах внутри B-домена. Этот процессинг приводит к образованию гетерогенных молекул тяжелых цепей, состоящих из A1, A2 и различных частей B-домена, которые имеют молекулярную массу, находящуюся в диапазоне от 90 кДа до 200 кДа. Тяжелые цепи связываются посредством иона металла с легкими цепями, которые состоят из A3, C1 и C2-домена (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83: 89-96). В плазме этот гетеродимерный FVIII связывается с высоким сродством с фактором Виллебранда (VWF), который защищает его от преждевременного катаболизма. Полупериод существования не активированного FVIII, связанного с VWF, составляет приблизительно 12 часов в плазме.

Фактор коагуляции FVIII активируется посредством протеолитического расщепления тромбином и FXa в положениях аминокислот Arg372 и Arg740 внутри тяжелой цепи и в Arg1689 в легкой цепи, что приводит к высвобождению фактора Виллебранда и образованию активированного гетеротримера FVIII, который будет образовывать теназный комплекс на фосфолипидных поверхностях с FIXa и FX при условии присутствия Ca²⁺. Гетеротример состоит из A1-домена, фрагмента массой 50 кДа, A2-домена, фрагмента массой 43 кДа, и легкой цепи (A3-C1-C2), фрагмента массой 73 кДа. Таким образом, активная форма FVIII (FVIIIa) состоит из A1-субъединицы, связанной через образуемую двухвалентным металлом ионную связь с расщепленной тромбином легкой цепью A3-C1-C2, и свободной A2-субъединицы, относительно слабо связанной с A1 и A3-доменом.

Во избежание чрезмерной коагуляции FVIIIa должен быть инактивирован вскоре после активации. Полагают, что инактивация FVIIIa посредством активированного белка C (APC) путем расщепления в Arg336 и Arg562 не является основной определяющей скорость стадией. Скорее ей является диссоциация нековалентно присоединенной A2-субъединицы от гетеротримера, которая, как полагают, является определяющей скорость стадией в инактивации FVIIIa после активации тромбином (Fay et al. 1991. J. Biol. Chem. 266: 8957, Fay & Smudzin 1992. J. Biol. Chem. 267: 13246-50). Она является быстрым процессом, что объясняет короткий полупериод существования FVIIIa в плазме, который составляет только 2,1 минуты (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83: 89-96).

Пациентам с тяжелой гемофилией A, подвергаемым профилактическому лечению, FVIII должен вводиться внутривенно приблизительно 3 раза в неделю из-за короткого полупериода существования FVIII в плазме, составляющего приблизительно 12-14 часов. Каждое внутривенное введение является трудоемким, сопровождающимся болью и влечет за собой риск инфицирования, особенно когда это делается в основном в домашних условиях самими пациентами или родителями детей, у которых диагностирована гемофилия A.

Поэтому было бы в высокой степени желательным создание FVIII с увеличенным полупериодом функционального существования, делающее возможным производство содержащих FVIII фармацевтических композиций, которые нужно вводить менее часто.

Было предпринято несколько попыток для продления полупериода существования не активированного FVIII или посредством уменьшения его взаимодействия с клеточными рецепторами (WO 03/093313A2, WO 02/060951A2), посредством ковалентного присоединения полимеров к FVIII (WO 94/15625, WO 97/11957 и US 4970300), посредством инкапсуляции FVIII (WO 99/55306), посредством введения новых сайтов связывания металла (WO 97/03193), посредством ковалентного присоединения A2-домена к A3-домену с помощью либо пептидной (WO 97/40145 и WO 03/087355), либо дисульфидной связи (WO 02/103024A2), или посредством ковалентного присоединения A1-домена к A2-домену (WO2006/108590).

Другой подход к увеличению полупериода функционального существования FVIII или VWF осуществляют посредством пегилирования FVIII (WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923) или посредством пегилирования VWF (WO 2006/071801), который, имея в результате пегилирования увеличенный полупериод существования, мог бы опосредованно увеличить также полупериод существования FVIII, присутствующего в плазме.

Поскольку ни один из описанных выше подходов еще не привел к разрешению лекарственного средства FVIII и поскольку введение мутаций в последовательность FVIII дикого типа или введение химических модификаций влечет за собой, по крайней мере, теоретический риск создания иммуногенных вариантов FVIII, существует сохраняющаяся потребность в разработке модифицированных молекул фактора VIII коагуляции, которые демонстрируют удлиненный полупериод существования.

Ввиду потенциального риска тромбообразования более желательным является удлинение полупериода существования не активированной формы FVIII, чем FVIIIa.

VWF, который является отсутствующим, функционально дефектным или имеется в наличии только в уменьшенном количестве при различных формах болезни Виллебранда (VWD), представляет собой мультимерный адгезивный гликопротеин, присутствующий в плазме млекопитающих, который обладает множеством физиологических функций. Во время первичного гемостаза VWF функционирует в качестве медиатора между специфическими рецепторами на поверхности тромбоцита и компонентами экстраклеточного матрикса, такими как коллаген. Кроме того, VWF служит в качестве носителя и стабилизирующего белка для прокоагулянта FVIII. VWF синтезируется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах в виде молекулы-предшественника из 2813 аминокислот. Аминокислотная последовательность и последовательность кДНК VWF дикого типа сообщается в Collins et al. 1987, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84: 4393-4397. Полипептид-предшественник, препро-VWF, состоит из сигнального пептида длиной 22 остатка, пропептида длиной 741 остаток и полипептида длиной 2050 остатков, обнаруживаемого в зрелом плазменном VWF (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). После отщепления сигнального пептида в эндоплазматическом ретикулуме между двумя мономерами VWF образуется C-концевой дисульфидный мостик. Во время дальнейшего перемещения через секреторный путь добавляются 12 N-сочленяемых и 10 O-сочленяемых углеводных боковых цепей. Важнее, что димеры VWF подвергаются мультимеризации через N-концевые дисульфидные мостики, и пропептид длиной 741 аминокислот отщепляется ферментом PACE (расщепляющим спаренные основные аминокислоты ферментом)/фурином в позднем аппарате Гольджи. Пропептид, а также высокомолекулярные мультимеры VWF (VWF-HMWM) хранятся в тельцах Вейбеля-Паллада эндотелиальных клеток или в [альфа]-гранулах тромбоцитов.

После секреции в плазму протеаза ADAMTS 13 расщепляет VWF внутри A1-домена VWF. Поэтому VWF в плазме состоит из целого ряда мультимеров, простирающегося от единичных димеров с М.м. 500 кДа до мультимеров, состоящих из вплоть до более чем 20 димеров, с молекулярной массой, превышающей 10000 кДа. При этом VWF-HMWM обладают более сильной гемостатической активностью, которую можно определить через ристоцетин-кофакторную активность (VWF:RCo). Чем больше отношение VWF:RCo/VWF антиген, тем больше относительное количество высокомолекулярных мультимеров.

Дефекты в VWF являются причиной болезни Виллебранда (VWD), которая характеризуется более или менее отчетливым фенотипом нарушения свертываемости крови. VWD типа 3 является самой тяжелой формой, при которой VWF полностью отсутствует, VWD типа 1 связан с количественной потерей VWF, и ее фенотип может быть очень слабым. VWD типа 2 связан с качественными дефектами VWF и может быть настолько же тяжелой, как и VWD типа 3. VWD типа 2 имеет множество подформ, при этом некоторые из них связаны с потерей или уменьшением высокомолекулярных мультимеров. VWD типа 2a характеризуется потерей как средних, так и больших мультимеров. VWD типа 2B характеризуется потерей мультимеров с наибольшей молекулярной массой.

VWD является самым часто встречающимся нарушением свертываемости крови у людей и может подвергаться лечению с помощью заместительной терапии с использованием концентратов, содержащих VWF плазматического или рекомбинантного происхождения. VWF можно приготовить из плазмы человека, как, например, описано в EP 05503991. В EP 0784632 описывается способ выделения рекомбинантного VWF.

В плазме FVIII связывается с высоким сродством с VWF, который защищает его от преждевременного катаболизма и поэтому играет, помимо своей роли в первичном гемостазе, основную роль в регулировании уровней FVIII в плазме и, как следствие, также является центральным фактором для контролирования вторичного гемостаза. Полупериод существования не активированного FVIII, связанного с VWF, составляет приблизительно 12-14 часов в плазме. При болезни Виллебранда типа 3, при которой VWF не присутствует или почти не присутствует, полупериод существования FVIII составляет только приблизительно 6 часов, приводя к симптомам гемофилии А от небольшой до умеренной тяжести у таких пациентов вследствие уменьшенных концентраций FVIII. Стабилизирующий эффект VWF на FVIII был также использован для способствования рекомбинантной экспрессии FVIII в клетках CHO (Kaufman et al. 1989, Mol. Cell Biol.).

До настоящего времени стандартное лечение гемофилии A и VWD включает частые внутривенные инфузии препаратов FVIII и концентратов VWF или инфузии концентратов, включающих комплекс FVIII и VWF, получаемый из плазм людей-доноров, или в случае FVIII инфузии фармацевтических препаратов на основе рекомбинантного FVIII. Хотя эти заместительные терапии являются обычно эффективными, например, для пациентов с тяжелой гемофилией A, подвергаемых профилактическому лечению, FVIII должен вводиться внутривенно приблизительно 3 раза в неделю вследствие короткого полупериода существования FVIII в плазме, составляющего приблизительно 12 часов. Уже при уровнях, превышающих 1% от активности FVIII у не больных гемофилией, например, при повышении уровней FVIII на 0,01 Е/мл, тяжелая гемофилия A превращается в гемофилию A средней тяжести. При профилактической терапии схемы дозирования разрабатывают так, чтобы минимальные уровни активности FVIII не опускались ниже уровней, составляющих 2-3% от активности FVIII у не больных гемофилией. Каждое внутривенное введение является трудоемким, сопровождающимся болью и влечет за собой риск инфицирования, особенно когда это в основном делается при лечении в домашних условиях самими пациентами или родителями детей, у которых диагностирована гемофилия A. Кроме того, частые внутривенные инъекции неизбежно приводят к образованию шрамов, мешающему дальнейшим инфузиям. Поскольку профилактическое лечению при тяжелой гемофилии начинают рано в периоде жизни, при этом возраст детей часто составляет менее 2 лет, введение FVIII трижды в неделю в вены таких маленьких пациентов является даже более трудным. В течение ограниченного периода времени имплантация инфузионной системы может быть альтернативой. Несмотря на то обстоятельство, что могут иметь место многократные инфицирования, и инфузионные системы могут вызывать неудобство во время физической нагрузки, они, тем не менее, обычно считаются предпочтительными по сравнению с внутривенными инъекциями.

Полупериод in vivo существования VWF человека в кровотоке человека составляет приблизительно от 12 до 20 часов. При профилактическом лечении VWD, например, типа 3 также могло бы быть в высокой степени желательным нахождение путей для удлинения полупериода функционального существования VWF.

Другим подходом к увеличению полупериода функционального существования VWF является пегилирование VWF (WO 2006/071801), который, имея в результате пегилирования увеличенный полупериод существования, мог бы опосредованно увеличить также полупериод существования FVIII, присутствующего в плазме.

Однако химическая конъюгация PEG или других молекул с терапевтическими белками всегда влечет за собой риск снижения специфической активности вследствие экранирования важных сайтов взаимодействия с другими белками, химическая конъюгация прибавляет дополнительную стадию при производстве таких белков, уменьшая конечные выходы продукта и делая производство более дорогостоящим. Также не известны долгосрочные эффекты на здоровье человека, поскольку известные в настоящее время пегилированные терапевтические белки не нужно вводить в течение всей жизни, как это могло бы быть случаем для VWF, вводимого для профилактики болезни Виллебранда, или для FVIII, вводимого при гемофилии A.

Поэтому могло бы быть в высокой степени желательным получение долгоживущего VWF, который не является химически модифицированным.

В известном уровне техники были описаны слияния факторов коагуляции с альбумином (WO 01/79271), альфа-фетопротеином (WO 2005/024044) и иммуноглобулином (WO 2004/101740) в качестве увеличивающих полупериод существования полипептидов. Указывалось, что они присоединены к карбоксильному концу или амино-концу или к обоим концам соответствующей терапевтической белковой составляющей, иногда связаны с помощью пептидных линкеров, предпочтительно с помощью линкеров, состоящих из глицина и серина.

Ballance и др. (WO 01/79271) описали полипептиды из множества различных терапевтических полипептидов, слитые в своих N- или C-концевых частях с сывороточным альбумином человека. Представлены длинные списки возможных партеров по слиянию без сообщения в отношении почти любого из этих белков экспериментальных данных, касающихся того, сохраняют ли соответствующие слитые с альбумином белки биологическую активность и имеют ли они улучшенные свойства. В указанном списке терапевтических полипептидов упомянуты также FVIII и VWF.

Невероятно, чтобы C-концевое слияние серьезно рассматривалось квалифицированным в данной области специалистом, поскольку C2-домен FVIII в весьма C-концевой части FVIII между аминокислотами 2303 и 2332 FVIII включает сайт связывания с мембранами тромбоцитов, который весьма важен для функционирования FVIII. Вот почему существует множество известных аминокислотных мутаций в этой области, которые вызывают гемофилию A. Поэтому вызывало удивление то, что относительно большой гетерологичный полипептид, вроде альбумина, можно слить с C-концевой частью FVIII без препятствования функционированию FVIII посредством препятствования связыванию с тромбоцитами. Кроме того, C2-домен также содержит сайт связывания с VWF. Этот сайт вместе с аминокислотной последовательностью 1649-1689 ответственен за связывание FVIII с высоким сродством с VWF. Поэтому квалифицированный в данной в области техники специалист не мог бы ожидать, что FVIII, слитый в своей C-концевой части с альбумином, будет сохранять свое связывание с VWF.

С удивлением было обнаружено, что в противоположность предсказанию Ballance и др. слияние альбумина с N-концом FVIII не секретируется в культуральную среду. Поэтому и по причинам, детализированным выше, с даже большим удивлением теперь было обнаружено, что FVIII, слитый в своей C-концевой части с альбумином, секретируется в культуральную среду и сохраняет свою биологическую функцию, в том числе связывание с мембранами активированных тромбоцитов и с VWF.

С удивлением было также обнаружено, что модифицированный FVIII настоящего изобретения демонстрирует увеличение отношения фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой на приблизительно 20% по сравнению с FVIII дикого типа.

Квалифицированный в данной области специалист также не рассматривал бы слияние альбумина человека с N- или C-концом VWF. При N-концевом слиянии альбуминовая часть отщеплялась бы во время процессирования пропептида. Или, если бы пропептид был не включен, могла бы не происходить мультимеризация. Как обсуждалось выше, C-конец VWF весьма важен для первоначальной димеризации и секреции, что продемонстрировано Schneppenheim и др. (Schneppenheim R. et al. 1996. Defective dimerization of VWF subunits due to a Cys to Arg mutation in VWD type MD. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3581-3586; Schneppenheim R. et al. 2001. Expression and characterization of VWF dimerization defects in different types of VWD. Blood 97: 2059-2066.), Baronciani et al. (Baronciani L. et al. 2000. Molecular characterization of a multiethnic group of 21 patients with VWD type 3. Thromb. Haemost 84: 536-540), Enayat et al. (Enayat MS et al. 2001. Aberrant dimerization of VWF as the result of mutations in the carboxy-terminal region: identification of 3 mutations in members of 3 different families with type 2A (phenotype MD) VWD. Blood 98: 674-680; и Tjernberg et al. 2006. Homozygous C2362F VWF induces intracellular retention of mutant VWF resulting in autosomal recessive severe VWD. Br J Haematol. 133: 409-418). Поэтому квалифицированный в данной области специалист не рассматривал бы слияние большого белка, вроде альбумина человека, с C- или N-концом VWF, так как он бы ожидал, что нормальная димеризация или мультимеризация VWF может быть нарушена. Так как мультимеры VWF с большей молекулярной массой являются самыми активными при первичном гемостазе, квалифицированный в данной области специалист искал бы другие пути для удлинения полупериода функционального существования VWF.

С удивлением теперь было обнаружено, что слияние гетерологичных полипептидов, таких как альбумин, с C-концевой частью VWF1 не только допускает экспрессию и секрецию химерных белков VWF из клеток млекопитающих, но также дает в результате модифицированные молекулы VWF, которые сохраняют значительную активность VWF и образуют высокомолекулярные мультимеры. Кроме того, такие модифицированные молекулы VWF демонстрируют удлиненный полупериод существования и/или увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой.

Краткое изложение сущности изобретения

Целью этого изобретения является обеспечение модифицированного FVIII или модифицированного VWF, а также комплексов модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплексов немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, а также комплексов модифицированного FVIII с модифицированным VWF с удлиненным полупериодом существования in vivo.

В используемом в настоящем изобретении смысле термин «модифицированный FVIII» или «модифицированный VWF» означает полипептиды FVIII или VWF, которые слиты с увеличивающими полупериод существования полипептидами, охватывающие также природные аллели, варианты, делеции и вставки FVIII или VWF.

Другой целью этого изобретения является обеспечение модифицированного FVIII или модифицированного VWF, а также комплексов модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплексов немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, а также комплексов модифицированного FVIII с модифицированным VWF с увеличенным отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой.

Другой целью настоящего изобретения является возможность экспрессии модифицированного FVIII или модифицированного VWF, а также комплексов модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплексов немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, а также комплексов модифицированного FVIII с модифицированным VWF клетками млекопитающих и сохранение у них соответствующих биологических активностей.

Итак, модифицированный FVIII или модифицированный VWF, а также комплексы модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплексы немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, а также комплексы модифицированного FVIII с модифицированным VWF настоящего изобретения имеют, как ни удивительно, сохраненную биологическую активность, увеличенный полупериод существования in vivo и увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой.

Дополнительным потенциальным преимуществом тех вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых FVIII является модифицированным и в которых A2-домен остается присоединенным к A3-домену исключительно нековалентно после активации, является то, что увеличивается только полупериод существования неактивированной формы FVIII, тогда как полупериод существования активированной формы FVIII остается по существу тем же самым, что могло бы привести к уменьшенному риску тромбообразования по сравнению с вариантами FVIII, которые вызывают стабилизацию активированной формы FVIII.

Модифицированный FVIII или модифицированный VWF, а также комплексы модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплексы немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, а также комплексы модифицированного FVIII с модифицированным VWF настоящего изобретения можно создать посредством слияния составляющей в виде увеличивающего полупериод существования белка (HLEP) с C-концевой частью FVIII или C-концевой частью VWF.

HLEP в используемом в настоящем изобретении смысле выбирают из группы, состоящей из членов семейства альбуминов, которое включает альбумин, афамин, альфа-фетопротеин и связывающийся с витамином D белок, а также частей константной области иммуноглобулина и полипептидов, способных к связыванию в физиологических условиях с членами семейства альбуминов, а также частями константной области иммуноглобулина. Наиболее предпочтительным HLEP является альбумин человека.

Следовательно, настоящее изобретение относится к модифицированному FVIII или модифицированному VWF, а также комплексам модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплексам немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, а также комплексам модифицированного FVIII с модифицированным VWF, имеющему(им) в C-концевой части модифицированного FVIII и/или VWF слияние с HLEP, характеризующемуся(имся) тем, что модифицированный FVIII или модифицированный VWF, а также комплекс модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплекс немодифицированного FVIII с модифицированным VWF или комплекс модифицированного FVIII с модифицированным VWF имеет удлиненный полупериод функционального существования по сравнению с полупериодом функционального существования FVIII дикого типа или VWF дикого типа или комплекса VWF дикого типа с FVIII дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к C-концевым слияниям с более чем одним HLEP, причем HLEP, который подвергают слиянию несколько раз, может быть одним и тем же HLEP или может быть комбинацией различных HLEP.

Настоящее изобретение также относится к модифицированному FVIII, имеющему в C-концевой части слияние с HLEP, характеризующемуся тем, что модифицированный FVIII или модифицированный VWF, или комплекс модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплекс немодифицированного FVIII с модифицированным VWF или комплекс модифицированного FVIII с модифицированным VWF имеет увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой по сравнению с отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой для FVIII дикого типа или VWF дикого типа или комплекса VWF дикого типа с FVIII дикого типа.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения являются модифицированные полипептиды FVIII, имеющим в C-концевой части слияние с HLEP, характеризующиеся тем, что модифицированный FVIII секретируется в среду для ферментации в большем количестве, чем FVIII дикого типа.

Другим аспектом настоящего изобретения являются полинуклеотиды или комбинации полинуклеотидов, кодирующие модифицированный FVIII и/или модифицированный VWF.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к плазмидам или векторам, включающим описанный здесь полинуклеотид, клеткам-хозяевам, включающим описанный здесь полинуклеотид, или плазмиду, или вектор.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ продуцирования модифицированного FVIII или модифицированного VWF, или комплекса модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, комплекса немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, или комплекса модифицированного FVIII с модифицированным VWF, включающий:

(a) культивирование клеток-хозяев настоящего изобретения в таких условиях, что экспрессируется модифицированный фактор коагуляции; и

(b) необязательно выделение модифицированного фактора коагуляции из клеток-хозяев или из культуральной среды.

Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к фармацевтическим композициям, включающим модифицированный FVIII или модифицированный VWF, или комплекс модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, или комплекс немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, или комплекс модифицированного FVIII с модифицированным VWF, полинуклеотид или плазмиду или вектор, описанные здесь.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является применение модифицированного FVIII или модифицированного VWF, или комплекса модифицированного FVIII с немодифицированным VWF, или комплекса немодифицированного FVIII с модифицированным VWF, или комплекса модифицированного FVIII с модифицированным VWF, одного или нескольких полинуклеотидов или одной или нескольких плазмид или векторов или применение клеток-хозяев в соответствии с этим изобретением для производства лекарственного средства для лечения или профилактики нарушения свертываемости крови.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение имеет отношение к комплексу, включающему FVIII и VWF, или одному из его индивидуальных полипептидных компонентов, причем по крайней мере один полипептидный компонент указанного комплекса слит в C-концевой части своего первичного продукта трансляции с N-концевой частью увеличивающего полупериод существования полипептида (HLEP).

Настоящее изобретение также имеет отношение к модифицированному FVIII или модифицированному VWF, или комплексу, включающему модифицированный FVIII и немодифицированный VWF, или комплексу, включающему немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, или комплексу, включающему модифицированный FVIII и модифицированный VWF, причем модифицированный FVIII слит в C-концевой части первичного продукта трансляции FVIII с N-концевой частью HLEP, или модифицированный VWF слит в C-концевой части первичного продукта трансляции VWF с N-концевой частью HLEP.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение имеет отношение к модифицированному FVIII или модифицированному VWF, или комплексу, включающему модифицированный FVIII и немодифицированный VWF, или комплексу, включающему немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, или комплексу, включающему модифицированный FVIII и модифицированный VWF, причем

a) модифицированный FVIII имеет удлиненный полупериод функционального существования по сравнению с полупериодом функционального существования FVIII дикого типа, или

b) модифицированный VWF имеет удлиненный полупериод функционального существования по сравнению с полупериодом функционального существования VWF дикого типа, или

c) комплекс, включающий модифицированный FVIII и немодифицированный VWF, имеет удлиненный полупериод функционального существования по сравнению с полупериодом функционального существования соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа, или

d) комплекс, включающий немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, имеет удлиненный полупериод функционального существования по сравнению с полупериодом функционального существования соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа, или

e) комплекс модифицированного FVIII с модифицированным VWF имеет удлиненный полупериод функционального существования по сравнению с полупериодом функционального существования соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа.

Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является модифицированный полипептид или комплекс, включающий указанный модифицированный полипептид, или комплекс, включающий указанные модифицированные полипептиды, описанные выше, причем модифицированный полипептид имеет полупериод функционального существования, увеличенный на по крайней мере 25% по сравнению с полупериодом функционального существования соответствующего полипептида дикого типа, или комплекс, включающий указанный модифицированный полипептид, или комплекс, включающий указанные модифицированные полипептиды, имеет полупериод функционального существования, увеличенный на по крайней мере 25% по сравнению с полупериодом функционального существования соответствующего комплекса FVIII дикого типа с VWF дикого типа.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является модифицированный FVIII или модифицированный VWF, или комплекс, включающий модифицированный FVIII и немодифицированный VWF, или комплекс, включающий немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, или комплекс, включающий модифицированный FVIII и модифицированный VWF, причем

a) модифицированный FVIII имеет удлиненный полупериод существования в качестве антигена по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена FVIII дикого типа, или

b) модифицированный VWF имеет удлиненный полупериод существования в качестве антигена по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена VWF дикого типа, или

c) комплекс, включающий модифицированный FVIII и немодифицированнный VWF, имеет удлиненный полупериод существования в качестве антигена по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа, или

d) комплекс, включающий немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, имеет удлиненный полупериод существования в качестве антигена по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена соответствующего комплекса FVIII дикого типа с VWF дикого типа, или

e) комплекс, включающий модифицированный FVIII и модифицированный VWF, имеет удлиненный полупериод существования в качестве антигена по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена соответствующего комплекса FVIII дикого типа с VWF дикого типа.

Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является модифицированный полипептид или комплекс, включающий указанный модифицированный полипептид, или комплекс, включающий указанные модифицированные полипептиды, описанные выше, причем модифицированный полипептид имеет полупериод существования в качестве антигена, увеличенный на по крайней мере 25% по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена соответствующего полипептида дикого типа, или комплекс, включающий указанный модифицированный полипептид, или комплекс, включающий указанные модифицированные полипептиды, имеет полупериод существования в качестве антигена, увеличенный на по крайней мере 25% по сравнению с полупериодом существования в качестве антигена соответствующего комплекса FVIII дикого типа с VWF дикого типа.

Еще одним вариантом осуществления настоящее изобретение является модифицированный FVIII или модифицированный VWF, или комплекс, включающий модифицированный FVIII и немодифицированный VWF, или комплекс, включающий немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, или комплекс, включающий модифицированный FVIII и модифицированный VWF, причем

a) модифицированный FVIII имеет увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой по сравнению с отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой для FVIII дикого типа, или

b) модифицированный VWF имеет увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой по сравнению с отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой для VWF дикого типа, или

c) комплекс, включающий модифицированный FVIII и немодифицированный VWF, имеет увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой по сравнению с отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой для соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа, или

d) комплекс, включающий немодифицированный FVIII и модифицированный VWF, имеет увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой по сравнению с отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой для соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа, или

e) комплекс, включающий модифицированный FVIII и модифицированный VWF, имеет увеличенное отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой по сравнению с отношением фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой для соответствующего комплекса, включающего FVIII дикого типа и VWF дикого типа.

Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является модифицированный полипептид или комплекс, включающий указанный модифицированный полипептид, или комплекс, включающий указанные модифицированные полипептиды, описанные выше, причем модифицированный полипептид имеет отношение фактической максимальной концентрации in vivo к ожидаемой, увеличенное на по крайней мере 10% по сравнению с отношением фактической м