Нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты

Нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому гену фосфатазы фосфатидной кислоты и его применению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенные связи, в совокупности обозначают как полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), которые, как известно, включают арахидоновую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту и т.д. Некоторые из данных полиненасыщенных жирных кислот не синтезируются в организме животного, и такие полиненасыщенные жирные кислоты необходимо принимать с пищей в качестве незаменимых жирных кислот. Полиненасыщенные жирные кислоты широко распространены. Например, арахидоновую кислоту выделяют из липидов, выделенных из надпочечников и печени животного. Однако количество данных полиненасыщенных жирных кислот, содержащееся в органах животного, мало, и количество полиненасыщенных жирных кислот, полученных и выделенных в чистом виде только из органов животных, является недостаточным для их обеспечения в большом объеме. Таким образом, с помощью культивирования различных микроорганизмов были разработаны бактериальные методы для получения полиненасыщенных жирных кислот. В частности, известно, что микроорганизмы рода Mortierella продуцируют липиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота.

Другие попытки получения полиненасыщенных жирных кислот были предприняты в отношении растений. Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты формируют липиды для запасания, такие как триацилглицерины (также обозначаемые как триглицериды, или TG), накапливающиеся внутри клетки микроорганизма или зернах растений.

Триацилглицерин в качестве липида для запасания образуется в организме следующим образом: ацильная группа вводится в глицерин-3-фосфат с помощью глицерин-3-фосфат ацилтрансферазы для получения лизофосфатидиловой кислоты. Ацильная группа вводится в лизофосфатидиловую кислоту с помощью лизофосфат ацилтрансферазы для получения фосфатидной кислоты. Фосфатидную кислоту подвергают дефосфорилированию с помощью фосфатазы фосфатидной кислоты для получения диацилглицерина. Ацильную группу вводят в диацилглицерин с помощью диацилглицерин ацилтрансферазы для получения триацилглицерина.

В данном метаболическом пути фосфатидная кислота (далее в настоящем документе также обозначаемая как «PA» или 1,2-диацил-sn-глицерин-3-фосфат) является предшественником триацилглицерина и также является биосинтетическим предшественником диацил глицерофосфолипида. В клетках дрожжей CDP диацилглицерин (CDP-DG) синтезируется из PA и цитидин 5'-трифосфата (CTP) с помощью фосфатидат цитидилтрансферазы и синтезируется в различные фосфолипиды.

Как описано выше, известно, что реакция биосинтеза диацилглицерина (далее в настоящем документе, также обозначаемого как «DG») катализируется фосфатазой фосфатидной кислоты (E.C. 3.1.3.4, далее в настоящем документе, также обозначаемая как «PAP») через дефосфорилирование PA. Известно, что PAP присутствует во всех организмах от бактерий до позвоночных.

Дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), которые представляют собой грибы, обладают двумя типами PAP (непатентная литература 1, 2 и 7). Один из них представляет собой Mg²⁺-зависимую PAP (PAP1), а другой - представляет собой Mg²⁺-независимую PAP (PAP2). Известно, что ген PAH1 кодирует PAP1 (непатентная литература 3-5). Вариант pah1Δ также свидетельствует об активности PAP1, что позволяет предположить существование других генов, свидетельствующих об активности PAP1. При наличии варианта pah1Δ, ядерная мембрана и мембрана ER аномально расширены, а экспрессия важных генов для биосинтеза фосфолипидов аномально усилена (непатентная литература 6).

Известно, что гены, кодирующие PAP2, ген DPP1 и ген LPP1 наиболее всего характеризуют виды активности PAP2 у дрожжей. Ферменты, кодируемые этими генами, обладают широкой субстратной специфичностью и также влияют, например, на дефосфорилирование диацилглицерин пирофосфата (DGPP), лизофосфатидной кислоты, фосфатов сфингооснований и изопреноид фосфата.

Известно, что в продуцирующих липиды грибах, Mortierella alpina, содержится ген MaPAP1, являющийся Mg²⁺-независимым гомологом PAP2 (патентная литература 1).

В данной области известно о существовании гомологов генов, которые, вероятно, кодируют семейство ферментов PAP1 или семейство ферментов PAP2 в других бактериях, но их функции еще не изучены.

Список цитируемых документов

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Патентная литература 1: Международная публикация № WO2009/008466

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Непатентная литература 1: Biochem. Biophys. Acta, 1348, 45-55, 1997

Непатентная литература 2: Trends Biochem. Sci., 31(12), 694-699, 2006

Непатентная литература 3: EMBO J., 24, 1931-1941, 2005

Непатентная литература 4: J. Biol. Chem., 281(14), 9210-9218, 2006

Непатентная литература 5: J. Biol. Chem., 281(45), 34537-34548, 2006

Непатентная литература 6: J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, 2007

Непатентная литература 7: J. Biol. Chem., 284(5), 2593-2597, 2009

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

В отношении большинства генов PAP, о которых сообщали ранее, однако, не проводили исследований в отношении изменения соотношения жирных кислот в составе композиции с жирными кислотами, продуцируемой клетками-хозяевами, при введении этих генов в клетки-хозяева и экспрессии в них. Существует потребность в выявлении нового гена с помощью введения гена в клетку-хозяина или экспрессирования гена, продуктом которого будет являться жир с заданной композицией жирных кислот или увеличенным содержанием заданных жирных кислот.

Объектом по настоящему изобретению является обеспечение белка или нуклеиновой кислоты, позволяющей клеткам-хозяевам продуцировать жир с заданной композицией жирных кислот или с повышенным содержанием заданных жирных кислот, с помощью экспрессии белка в клетках-хозяевах или введения нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

Авторы настоящего изобретения активно искали решение указанных выше проблем. То есть авторы изобретения проанализировали геном продуцирующих липиды грибов Mortierella alpina и выделили из генома последовательности, гомологичные известным генам Mg²⁺-зависимой фосфатазы фосфатидной кислоты (PAP1). Кроме того, для получения непрерывной открытой рамки считывания (ORF) в гене, кодирующем PAP, осуществляли клонирование полноразмерной кДНК с помощью скрининга библиотеки кДНК или ПЦР ген вводили в клетки-хозяева с высокой пролиферативной активностью, такие как дрожжи. В результате, авторы изобретения обнаружили, что белок, кодируемый клонированной кДНК, обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты, а введение кДНК в дрожжи увеличивает запасы резервных липидов, триацилглицерина в дрожжах. Таким образом, было успешно достигнуто клонирование гена, относящегося к новой фосфатазе фосфатидной кислоты (PAP), а настоящее изобретение завершено. Таким образом, настоящее изобретение представляет собой как указано ниже.

(1) Нуклеиновая кислота по любому из пунктов от (a) до (g), представленных ниже:

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая при строгих условиях может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, и кодирует белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 70% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, и кодирующую белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, на 70% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(e) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая при строгих условиях может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и кодирует белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(f) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая при строгих условиях может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, и включает экзон, кодирующий белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(g) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 70% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, и включающая экзон, кодирующий белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(2) Нуклеиновая кислота по п.(1), где нуклеиновая кислота представляет собой одну из любых от (a) до (g), представленных ниже:

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением от 1 до 130 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, в условиях 2×SSC при 50°C, и кодирует белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 90% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, и кодирующую белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, на 90% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(e) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, в условиях 2×SSC при 50°C, и кодирует белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты;

(f) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, в условиях 2×SSC при 50°C, и включающей экзон, кодирующий белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(g) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 90% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, и включающую экзон, кодирующий белок с активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(3) Нуклеиновая кислота по любому из пунктов от (a) до (d), представленных ниже:

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, или ее фрагмент;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, или ее фрагмент;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 9, или ее фрагмент; и

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, или ее фрагмент.

(4) Нуклеиновая кислота по любому из пунктов от (a) до (g), представленных ниже:

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку диацилглицерина (DG) и/или триглицерида (TG) из фосфатидной кислоты (PA) в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая при строгих условиях может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, и кодирует белок, обладающий активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 70% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, и кодирующей белок, обладающий активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, на 70% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(e) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая при строгих условиях может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и кодирует белок с активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(f) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая при строгих условиях может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, и включает экзон, кодирующий белок с активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1; и

(g) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 70% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, и включающей экзон, кодирующий белок с активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1.

(5) Нуклеиновая кислота по пункту (4), где нуклеиновая кислота представляет собой любую от (a) до (g), представленных ниже:

(a) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением от 1 до 130 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку диацилглицерина (DG) и/или триглицерида (TG) из фосфатидной кислоты (PA) в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(b) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, в условиях 2×SSC при 50°C, и кодирует белок с активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(c) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 90% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, и кодирующая белок, обладающий активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(d) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 90% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(e) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, в условиях 2×SSC при 50°C, и кодирует белок, обладающий активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1;

(f) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая может быть гибридизована с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, в условиях 2×SSC при 50°C, и включает экзон, кодирующий белок, который обладает активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1; и

(g) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, на 90% или более идентичной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10, и включает экзон, кодирующий белок, который обладает активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1.

(6) Белок по пункту (a) или (b), представленный ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 70% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(7) Белок по пункту (a) или (b), представленный ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением от 1 до 130 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты; и

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 90% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью фосфатазы фосфатидной кислоты.

(8) Белок по пункту (a) или (b), представленный ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку диацилглицерина (DG) и/или триглицерида (TG) из фосфатидной кислоты (PA) в штамме дрожжей с дефицитом PAH1; и

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 70% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1.

(9) Белок по пункту (a) или (b), представленный ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением от 1 до 130 аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку диацилглицерина (DG) и/или триглицерида (TG) из фосфатидной кислоты (PA) в штамме дрожжей с дефицитом PAH1; и

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 90% или более идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, усиливающей выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1.

(10) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7.

(11) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пунктов от (1) до (5).

(12) Трансформант, трансформированный с помощью рекомбинантного вектора по пункту (11).

(13) Композиция жирной кислоты, содержащая жирную кислоту или липид, полученная с помощью культивирования трансформанта по пункту (12).

(14) Способ получения композиции жирной кислоты, характеризующийся получением жирной кислоты или липида из культуры, полученной с помощью культивирования трансформанта по пункту (12).

(15) Пищевой продукт, содержащий композицию жирной кислоты по пункту (13).

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

PAP по настоящему изобретению может усиливать способность продукции жирных кислот и резервных липидов в клетках, в которые вводят PAP, и предпочтительно может усиливать выработку полиненасыщенных жирных кислот в микроорганизмах или растениях.

Предполагают, что PAP по настоящему изобретению способствует продукции жирных кислот в клетке-хозяине, композиции жирных кислот, отличной от композиции жирных кислот, продуцируемой в клетке-хозяине, куда не вводят PAP. Это может обеспечивать липиды с заданными свойствами и эффектами и, таким образом, является полезным для применения при производстве, например, пищевых продуктов, косметики, фармацевтических продуктов и мыла.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1-1 представлено сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO: 5) и ORF (SEQ ID NO: 1) MaPAH1.1, полученных из штамма M. alpina 1S-4.

Фигура 1-2 является продолжением фигуры 1-1.

Фигура 1-3 является продолжением фигуры 1-2.

Фигура 1-4 является продолжением фигуры 1-3.

На фигуре 2-1 представлено сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO: 10) и ORF (SEQ ID NO: 6) MaPAH1.2, полученных из штамма M. alpina 1S-4.

Фигура 2-2 является продолжением фигуры 2-1.

Фигура 2-3 является продолжением фигуры 2-2.

Фигура 2-4 является продолжением фигуры 2-3.

На фигуре 3-1 представлена кДНК (SEQ ID NO: 4) MaPAH1.1, полученная из штамма M. alpina 1S-4 и полученная на основании этого аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2).

Фигура 3-2 является продолжением фигуры 3-1.

Фигура 3-3 является продолжением фигуры 3-2.

На фигуре 4-1 представлена кДНК (SEQ ID NO: 9) MaPAH1.2, полученная из штамма M. alpina 1S-4 и полученная на основании этого аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7).

Фигура 4-2 является продолжением фигуры 4-1.

На фигуре 5-1 представлено сравнение полученной аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2) MaPAH1.1 и полученной аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 7) MaPAH1.2, полученных из штамма M. alpina 1S-4, с фосфатазами фосфатидной кислоты семейства PAP1, белка ScPAH1 (SEQ ID NO: 19), полученного из дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, и аминокислотной последовательности липина (SEQ ID NO: 20), полученной из мыши. В фосфатазах фосфатидной кислоты семейства PAP1 N-концевая область является достаточно консервативной и обозначена как липин, консервативная N-концевая область (pfam04571). В MaPAH1.1 и MaPAH1.2 N-концевая область также является достаточно консервативной. В этой последовательности присутствие остатка глицина, отмеченного с помощью ∗ (соответствующий 80-й аминокислоте из SEQ ID NO: 2 и 80-й аминокислоте из SEQ ID NO: 7), является необходимым для активности PAP. Последовательность, отмеченная двойным подчеркиванием (соответствующая от 819-й до 823-й аминокислотам из SEQ ID NO: 2 и от 737-й до 741-й аминокислоте из SEQ ID NO: 7), представляет собой мотив DXDX(T/V), присутствующий в дегалогеназе галогенокислоты (HAD)-подобном домене. Данный мотив также является консервативным в MaPAH1.1 и MaPAH1.2. Последовательности, находящиеся выше и ниже относительно мотива, также являются консервативными.

Фигура 5-2 является продолжением фигуры 5-1.

На фигуре 6-1 представлено сравнение последовательности CDS (SEQ ID NO: 3) MaPAH1.1 и последовательности CDS (SEQ ID NO: 8) MaPAH1.2, полученных из штамма M. alpina 1S-4.

Фигура 6-2 является продолжением фигуры 6-1.

Фигура 6-3 является продолжением фигуры 6-2.

На фигуре 7 представлено сравнение полученной аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2) MaPAH1.1 с полученной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 7) MaPAH1.2, полученных из штамма M. alpina 1S-4.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому гену фосфатазы фосфатидной кислоты, полученному из рода Mortierella, где фосфатазы фосфатидной кислоты дефосфорилирует фосфатидную кислоту с образованием диацилглицерина.

По настоящему изобретению фосфатаза фосфатидной кислоты представляет собой фермент, катализирующий реакцию образования диацилглицерина при дефосфорилировании фосфатидной кислоты. Субстратом PAP по настоящему изобретению, как правило, является фосфатидная кислота, но ею не ограничены.

Нуклеиновая кислота, кодирующая фосфатазу фосфатидной кислоты по настоящему изобретению

Фосфатаза фосфатидной кислоты (PAP) по настоящему изобретению включает MaPAH1.1 и MaPAH1.2. Соответствия между кДНК, CDS и ORF, кодирующих MaPAH1.1 и MaPAH1.2, а также между полученными аминокислотными последовательностями, сведены в таблице 1.

Таблица 1
	MaPAH1.1	MaPAH1.2
	SEQ ID NO	Соответствующая область в SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO	Соответствующая область в SEQ ID NO: 9
кДНК	SEQ ID NO: 4	∗∗∗∗∗	SEQ ID NO: 9	∗∗∗∗∗
CDS	SEQ ID NO: 3	Положения от 1 до 3985	SEQ ID NO: 8	Положения от 72 до 3791
ORF	SEQ ID NO: 1	Положения от 1 до 3982	SEQ ID NO: 6	Положения от 72 до 3788
Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO: 2	∗∗∗∗∗	SEQ ID NO: 7	∗∗∗∗∗

Последовательности, относящиеся к MaPAH1.1 по настоящему изобретению, включают SEQ ID NO: 2, которая представляет собой аминокислотную последовательность MaPAH1.1; SEQ ID NO: 1, которая относится к последовательности области ORF MaPAH1.1; SEQ ID NO: 3, которая относится к последовательности области CDS MaPAH1.1; и SEQ ID NO: 4, которая представляет собой нуклеотидную последовательность кДНК для MaPAH1.1. Среди них SEQ ID NO: 3 соответствует нуклеотидам от 1 до 3985 из SEQ ID NO: 4, тогда как SEQ ID NO: 1 соответствует нуклеотидам от 1 до 3982 из SEQ ID NO: 4 и нуклеотидам от 1 до 3982 из SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 5 представляет собой геномную нуклеотидную последовательность, кодирующую MaPAH1.1 по настоящему изобретению. Геномная последовательность из SEQ ID NO: 5 состоит из одиннадцати экзонов и десяти интронов. В SEQ ID NO: 5 области экзонов соответствуют нуклеотидам от 1 до 182, от 370 до 584, от 690 до 1435, от 1536 до 1856, от 1946 до 2192, от 2292 до 2403, от 2490 до 2763, от 2847 до 3077, от 3166 до 3555, от 3648 до 3862 и от 3981 до 5034.

Последовательности, относящиеся к MaPAH1.2 по настоящему изобретению, включают SEQ ID NO: 7, которая представляет собой аминокислотную последовательность MaPAH1.2; SEQ ID NO: 6, которая представляет собой последовательность области ORF MaPAH1.2; SEQ ID NO: 8, которая представляет собой последовательность области CDS MaPAH1.2, и SEQ ID NO: 9, которая представляет собой нуклеотидную последовательность кДНК MaPAH1.2. Среди них SEQ ID NO: 8 соответствует нуклеотидам 72-3791 SEQ ID NO: 9, тогда как SEQ ID NO: 6 соответствует нуклеотидам от 72 до 3788 SEQ ID NO: 9 и нуклеотидам от 1 до 3717 из SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 10 представляет собой геномную нуклеотидную последовательность, кодирующую MaPAH1.2 по настоящему изобретению. Геномная последовательность из SEQ ID NO: 10 состоит из восьми экзонов и семи интронов. В SEQ ID NO: 10 область с экзонами соответствует нуклеотидам от 1 до 454, от 674 до 1006, от 1145 до 1390, от 1479 до 1583, от 1662 до 1804, от 1905 до 2143, от 2243 до 3409 и от 3520 до 4552.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению включают одноцепочечные и двухцепочечные ДНК, а также комплементарную им РНК, которая может быть либо природной, либо искусственно полученной. Примеры ДНК включают, но не ограничивают, геномные ДНК, кДНК, соответствующие геномным ДНК, химически синтезированные ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР ДНК, их сочетания и гибриды ДНК/РНК.

Предпочтительные варианты осуществления для нуклеиновых кислот по настоящему изобретению включают (a) нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, (b) нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, (c) нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 9, и (d) нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 10.

Для получения данных нуклеотидных последовательностей можно использовать данные о нуклеотидной последовательности для EST или геномных ДНК из организмов с активностью PAP для поиска нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, очень сходный с известными белками, обладающими активностью PAP. Предпочтительные организмы, обладающие активностью PAP, представляют собой продуцирующие липиды грибы, включая, в качестве неограничивающих примеров, M. alpina.

Для анализа EST сначала получали библиотеку кДНК. Библиотеку кДНК можно получать, руководствуясь «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)). Альтернативно, для получения библиотеки кДНК можно использовать коммерчески доступный набор. Примеры способа получения библиотеки кДНК, подходящей для настоящего изобретения, приведены ниже. То есть, подходящий штамм M. alpina, грибов, продуцирующих липиды, высевают на подходящую среду и предварительно культивируют в течение подходящего периода времени. Условиями культивирования, подходящими для указанного предварительного культивирования, являются, например, композиция среды из 1,8% глюкозы, 1% экстракта дрожжей и pH 6.0, время культивирования составляет от 3 до 4 суток, и температура культивирования 28°C. Продукты предварительного культивирования затем подвергают основному культивированию при подходящих условиях. Композиция среды, подходящей для основного культивирования, включает, например, 1,8% глюкозу, 1% соевый порошок, 0,1% оливковое масло, 0,01% Adekanol, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% Na₂SO₄, 0,05% CaCl₂·2H₂O и 0,05% MgCl₂·6H₂O и pH 6,0. Условиями культивирования, подходящими для основного культивирования, являются, например, аэрация и встряхивание культуры при 300 об/мин, 1 vvm и 26°C в течение 8 суток. В течение культивирования можно добавлять подходящее количество глюкозы. После культивирования продукт отбирают в подходящие моменты времени в течение основного культивирования, откуда собирают клетки для получения тотальной РНК. Тотальную РНК можно получать любым известным способом, таким как способ с помощью гуанидин гидрохлорида/CsCl. Из полученной в результате тотальной РНК, поли(A)⁺ РНК можно выделять с помощью коммерчески доступного набора, и библиотеку кДНК можно получать, используя коммерчески доступный набор. Нуклеотидную последовательность любого клона из полученной библиотеки кДНК определяют с помощью праймеров, сконструированных на основании вектора для определения нуклеотидной последовательности вставки. В результате можно получать EST. Например, при применении набора ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (Stratagene Inc.) для получения библиотеки кДНК возможно прямое клонирование.

При анализе геномной ДНК культивируют клетки организма, обладающие активностью PAP, а геномную ДНК получают из клеток. Определяют нуклеотидную последовательность полученной геномной ДНК, и подвергают сборке определяемую нуклеотидную последовательность. В полученной в итоге последовательности суперконтига осуществляют поиск последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, обладающую высокой гомологией с аминокислотной последовательностью известного белка с активностью PAP. Из последовательности суперконтига, находимой в поиске как последовательность, кодирующая такую аминокислотную последовательность, получают праймеры. Проводили ПЦР, используя библиотеку кДНК в качестве матрицы, и полученный фрагмент ДНК вводили в плазмиду для клонирования. Для получения образца проводили ПЦР с использованием клонированной плазмиды в качестве матрицы и указанных выше праймеров. Используя полученные образцы, проводили скрининг библиотеки кДНК.

Поиск гомологии между полученными аминокислотными последовательностями из MaPAH1.1 и MaPAH1.2 по настоящему изобретению осуществляли с помощью программы BLASTp относительно аминокислотных последовательностей, зарегистрированных в GenBank. Данные полученные аминокислотные последовательности из MaPAH1.1 и MaPAH1.2 обладают преимуществом в отношении предполагаемого белка ядерной элонгации и деформации (AAW42851), полученного из Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21, с наивысшими показателями, и идентичность составила 25,9% и 26,6% соответственно. Полученные аминокислотные последовательности MaPAH1.1 и MaPAH1.2 по настоящему изобретению идентичны на 22,7% и 22,5% соответственно с аминокислотной последовательностью белка PAH1, полученного из S. cerevisiae (на всем протяжении описания, также обозначаемого как PAH1 дрожжей, или ScPAH1), который был функционально проанализирован среди гомологов PAP1 грибов.

Настоящее изобретение также включает нуклеиновые кислоты, которые функционально эквивалентны нуклеиновой кислоте, включая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6 (далее в настоящем документе также обозначаемую как «нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению»), или нуклеотидные последовательности, кодирующие белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 (далее в настоящем документе также обозначаемой как «аминокислотная последовательность по настоящему изобретению»). Термин «функционально эквивалентный» означает, что белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, и белок, состоящий из аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, обладают активностью фосфатазы фосфатидной кислоты (PAP). Кроме того, термин «функционально эквивалентный» подразумевает активность, которая способствует усилению выработки диацилглицерина (DG) и/или триглицерида (TG) из фосфатидной кислоты (PA) в штамме дрожжей с дефицитом PAH1 при экспрессии белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, или белка, состоящего из аминокислотной последовательности по настоящему изобретению. Активность белка по настоящему изобретению в отношении PAP и активность, способствующая усилению выработки DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1, может быть Mg²⁺-зависимой или Mg²⁺-независимой. Активность белка по настоящему изобретению предпочтительно является Mg²⁺-зависимой.

Определенные нуклеиновые кислоты, являющиеся функционально эквивалентными в отношении нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включают нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, представленные ниже в любом из от (a) до (g). Следует отметить, что в описаниях нуклеотидных последовательностей, перечисленных ниже, термин «активность по настоящему изобретению» относится к «активности PAP и/или активности, которая усиливает выработку DG и/или TG из PA в штамме дрожжей с дефицитом PAH1».

(a) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностью по настоящему изобретению.

Нуклеотидная последовательность, содержащаяся в составе нук