Фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа

Фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Приоритет

Настоящая заявка утверждает преимущество предварительной заявки США № 61/089972, поданной 19 августа 2008 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно к области терапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые являются крайне эффективными в качестве противоопухолевых вакцин и лекарственных средств для лечения и предотвращения опухолей.

Предшествующий уровень техники

Было продемонстрировано, что CD8-позитивные ЦТЛ распознают эпитопные пептиды, полученные из опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) и находящиеся на молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, а затем убивают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) как первого примера ОАА, было обнаружено много других ОАА, главным образом, с помощью иммунологических подходов (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих ОАА в настоящее время проходят клинические исследования в качестве мишеней для иммунотерапии.

Выявление новых ОАА, способных индуцировать мощный и специфический противоопухолевый иммунный ответ, требует дальнейшего развития и применения в клинике стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака (NPL 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1,59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1,59(21): 5554-9; NPL 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). До настоящего времени было несколько сообщений о клинических испытаниях c применением таких пептидов, полученных из опухоль-ассоциированных антигенов. К сожалению, до сих пор в этих исследованиях противоопухолевых вакцин наблюдали только низкую частоту объективных ответов (NPL 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

Существует несколько типов HLA-A в мире. Из известных генотипов HLA - генотипы HLA-A0201, HLA-A0206, HLA-A1101, HLA-A2402, HLA-A2601, HLA-A3101 и HLA-A3303 известны, как имеющие более высокую частоту экспрессии, чем остальные типы (NPL 14: Lee K W, et al., Tissue Antigens 2005: 65: 437-447). Однако каждый генотип имеет различную аминокислотную последовательность и различное сродство к эпитопному пептиду (NPL 15: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190). Например, аминокислотный остаток альфа 1-домена генотипа HLA-A0206 отличается от такового у генотипа HLA-A0201 (т.е. тирозиновый остаток 33-ей аминокислоты SEQ ID NO:8 заменен на фенилаланин). С учетом этих различий, маловероятно, что ограниченный по HLA-A0201 эпитопный пептид будет пригоден для пациента с генотипом HLA-A0206. Таким образом, целью в данной области остается пептид, пригодный для различных типов пациентов.

С помощью анализа на микрочипах подтверждено, что HIG2 (hypoxia-inducible gene 2) и URLC10 (также именуемый LY6K; lymphocyte antigen 6 complex, locus K) активированы в некоторых опухолевых тканях, таких как рак почки и рак легких (PTL 1: WO2005/019475, PTL 2: WO2004/031413). Таким образом, HIG2 и URLC10 представляют собой интересные мишени для иммунотерапии рака, и специалисты в данной области ведут поиск эпитопных пептидов, полученных из них и индуцирующих ЦТЛ.

Список литературы

Непатентная литература

Патентная литература

[PTL 1]: WO2005/019475

[PTL 2]: WO2004/031413

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основано на открытии нового применения двух пептидов с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. В контексте настоящего изобретения мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здорового донора, стимулировали кандидатными пептидами, полученными из HIG2 или URLC10. Были созданы ЦТЛ, которые специфически распознают HLA-A0206-позитивные клетки-мишени, активированные соответствующими кандидатными пептидами, и определены эпитопные пептиды, ограниченные по HLA-A0206, которые могут индуцировать мощный и специфический иммунный ответ против HIG2 или URLC10, презентированных на поверхности клеток-мишеней.

Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, способным индуцировать ЦТЛ, а также к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:1 или 2. В дополнение к этому настоящее изобретение относится к применению модифицированных пептидов, где одна, две или более аминокислот замещены, удалены, вставлены и/или добавлены, при условии, что полученные модифицированные пептиды сохраняют способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ.

При введении пациенту, чей антиген HLA является HLA-A0206, предлагаемые пептиды презентируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток и затем индуцируют ЦТЛ, нацеленные на соответствующие пептиды. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенпрезентирующим клеткам и экзосомам, которые презентируют любой из предлагаемых пептидов с антигеном HLA-A0206, а также к способам индукции антигенпрезентирующих клеток.

Противоопухолевый иммунный ответ индуцируется введением указанных полипептидов HIG2 или URLC10 или полинуклеотида, кодирующего полипептиды, а также экзосом и антигенпрезентирующих клеток, которые презентируют полипептиды HIG2 или URLC10. Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является создание фармацевтических средств, содержащих в качестве активных ингредиентов полипептиды или полинуклеотиды, кодирующие их, а также экзосомы и антигенпрезентирующие клетки, и которые предназначены для введения пациенту, у которого HLA антиген является HLA-A0206. Фармацевтические средства по настоящему изобретению находят применение в качестве вакцин.

Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является создание способов лечения и/или профилактики (т.е. предупреждения) раков (опухолей), и/или предупреждения их послеоперационных рецидивов, а также способы индукции ЦТЛ, способы индукции иммунного противоракового (противоопухолевого) ответа и также противоопухолевого иммунитета, где пациент имеет HLA-A0206 антиген; такие способы включают этап введения пептидов с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, экзосом или антигенпрезентирующих клеток, презентирующих последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или фармацевтических средств по изобретению. В дополнение к этому ЦТЛ по настоящему изобретению также находят применение в качестве противоопухолевых вакцин. Примеры раков-мишеней включают в качестве неограничивающих примеров рак почки, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, рак желудка, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, рак поджелудочной железы и опухоль мягких тканей.

Следует понимать, что как вышеизложенная сущность изобретения, так и последующее подробное описание представляют собой примеры вариантов осуществления и не ограничиваются изобретением или другими альтернативными вариантами осуществления изобретения.

Краткое описание фигур

Различные аспекты и применение настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания настоящего изобретения и предпочтительных вариантов его осуществления, которые следуют далее:

[фиг.1] фигура 1 включает серию фотографий, показывающих результаты ELISPOT анализа на IFN-гамма на ЦТЛ, которые были индуцированы пептидом, полученным из HIG2. ЦТЛ в лунках #1, #2, #5, #7, #8, #10, #13 и #14, стимулированные HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1), демонстрируют мощную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает, что клетки-мишени были активированы соответствующим пептидом, и "-" указывает, что клетки-мишени не были активированы никакими пептидами.

[фиг.2] фигура 2 показывает серию линейных графиков с данными твердофазного иммуноферментного анализа на IFN-гамма, отображающих результаты создания линий ЦТЛ, стимулированных HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1). Они демонстрируют, что линии ЦТЛ, созданные посредством стимуляции HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1), показали мощную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает, что клетки-мишени были активированы соответствующим пептидом, и "-" указывает, что клетки-мишени не были активированы никакими пептидами.

[фиг.3] фигура 3 показывает линейный график с данными твердофазного иммуноферментного анализа на IFN-гамма, демонстрирующий результаты создания клона ЦТЛ, стимулированного HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1). Результаты показывают, что клон ЦТЛ, созданный посредством стимуляции HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1), показал мощную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает, что клетки-мишени были активированы соответствующим пептидом, и "-" указывает, что клетки-мишени не были активированы никакими пептидами.

[фиг.4] фигура 4 показывает линейный график, демонстрирующий специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, которые экспрессируют HIG2 и HLA-A*0206. В качестве контроля были приготовлены клетки COS7, трансфецированные только HLA-A*0206 и активированные несоответствующим пептидом, полученным из HIG2, или трансфецированные только HIG2. Клон ЦТЛ, созданный при помощи HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1), показал высокоспецифичную активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфецированных как HIG2, так и HLA-A0206 (черная ромбовидная метка). С другой стороны, не выявлено никакой значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих или HLA-A0206 (пустая треугольная метка) или HIG2 (пустой круг).

[фиг.5] фигура 5 включает серию фотографий, показывающих результаты ELISPOT анализа на IFN-гамма на ЦТЛ, которые были индуцированы пептидом, полученным из URLC10. ЦТЛ в лунке #7, стимулированные URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO:2), показали мощную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает, что клетки-мишени были активированы соответствующим пептидом, и "-" указывает, что клетки-мишени не были активированы никакими пептидами.

[фиг.6] фигура 6 показывает линейный график с данными твердофазного иммуноферментного анализа на IFN-гамма, демонстрирующий результаты создания линий ЦТЛ, стимулированных URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO:2). Результаты демонстрируют, что линия ЦТЛ, созданная посредством стимуляции URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2), показала мощную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает, что клетки-мишени были активированы соответствующим пептидом, и "-" указывает, что клетки-мишени не были активированы никакими пептидами.

[фиг.7] фигура 7 показывает линейный график с данными твердофазного иммуноферментного анализа на IFN-гамма, демонстрирующий результаты создания клона ЦТЛ, стимулированного URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO:2). Результаты демонстрируют, что клон ЦТЛ, созданный посредством стимуляции URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO:2), показал мощную выработку IFN-гамма по сравнению с контролем. На фигурах "+" указывает, что клетки-мишени были активированы соответствующим пептидом, и "-" указывает, что клетки-мишени не были активированы никакими пептидами.

[фиг.8] фигура 8 показывает линейный график, демонстрирующий специфическую активность ЦТЛ против клеток-мишеней, которые экспрессируют URLC10 и HLA-A*0206. В качестве контроля были приготовлены клетки COS7, трансфецированные только полноразмерным геном URLC10 или только геном HLA-A*0206. Клон ЦТЛ, созданный при помощи URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO:2), показал высокоспецифичную активность ЦТЛ против клеток COS7, трансфецированных как HIG2, так и HLA-A0206 (черная ромбовидная метка). С другой стороны, не выявлено никакой значительной специфической активности ЦТЛ против клеток-мишеней, экспрессирующих или HLA-A0206 (пустая треугольная метка), или URLC10 (пустой круг). На фигурах "R" означает Респондер и "S" означает Стимулятор.

Описание вариантов осуществления

Хотя можно использовать в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения любые способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, предпочтительные способы, приборы и материалы описаны здесь. Однако перед тем как настоящие материалы и способы будут описаны, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничено конкретными величинами, формами, размерами, материалами, методиками, протоколами и т.д., описываемыми в настоящем документе, поскольку они могут варьировать в соответствии с рутинными экспериментами и оптимизацией. Следует также понимать, что терминология, которая использована при описании, применяется только с целью описания конкретных версий или вариантов осуществления и не имеет целью ограничить объем настоящего изобретения, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Раскрытие каждой публикации, патента или патентной заявки, упомянутой в данном описании конкретным образом, в полном объеме включено в настоящий документ в качестве ссылки. Однако ничто в настоящем документе не должно истолковываться как признание того, что изобретение не имеет права датировать более ранним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.

В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущество. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстрирующими и неограничивающими.

I.Определения

Слова "a", "an", и "the", как применяют в настоящем документе, означают "по меньшей мере, один", если не указано иное.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют в данном документе взаимозаменяемо по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Термины употребляют по отношению к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой модифицированный остаток или неприродный остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также по отношению к природным аминокислотным полимерам.

Как применяют в настоящем документе, термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и миметикам аминокислот, которые функционируют сходно с природными аминокислотами. Природными аминокислотами являются те, которые кодированы генетическим кодом, а также те, которые модифицированы в клетках после трансляции (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Фраза "аминокислотный аналог" относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппу, аминогруппу и R-группу), что и природная аминокислота, но с модифицированной R-группой или модифицированным остовом (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионин метилсульфония). Фраза "аминокислотный миметик" относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но сходные функции с основными аминокислотами.

Аминокислоты могут быть обозначены в данном документе общеизвестными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по Химической Номенклатуре IUPAC-IUB.

Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются в данном документе взаимозаменяемо, если конкретно не указано иное, и подобно аминокислотам обозначенаются своими общепринятыми однобуквенными кодами.

Если не определено иное, термин "рак" относится к ракам со сверхэкспрессией гена HIG2 или URLC10. Примеры раков со сверхэкспрессией гена HIG2 включают в качестве неограничивающих примеров рак почки и карциному мягких тканей; примеры раков со сверхэкспрессией гена URLC10 включают в качестве неограничивающих примеров рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак пищевода, рак желудка, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), остеосаркому, рак поджелудочной железы и опухоль мягких тканей.

Если не определено иное, термины "цитотоксический T-лимфоцит", "цитотоксическая T-клетка" и "ЦТЛ" используют в данном документе взаимозаменяемо и, если конкретно не указано иное, по отношению к подгруппе T-лимфоцитов, которые способны распознавать чужеродные клетки (например, опухолевые клетки, вирус-инфицированные клетки) и индуцировать гибель этих клеток.

Если не определено иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же самое значение, в котором их обычно понимает специалист в области, к которой относится изобретение.

II.Пептиды

Чтобы продемонстрировать, что пептиды HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO:1) и URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO:2) функционируют как антигены, распознающиеся цитотоксическими T-лимфоцитами (ЦТЛ), данные пептиды исследовали, для того чтобы установить, являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными по HLA-A0206. После стимуляции Т-клеток in vitro дендритными клетками (DC), нагруженными данными пептидами, были успешно созданы ЦТЛ с использованием каждого из пептидов HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1) и URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2).

Эти полученные ЦТЛ показывают мощную специфическую цитотоксическую активность против клеток-мишеней, экспрессирующих антиген HLA-A0206, при обработке соответствующими пептидами. Результаты в настоящем документе демонстрируют, что эти пептиды могут быть эпитопными пептидами HIG2 и URLC10, ограниченными по HLA-A0206. Поскольку эти пептиды могут также быть эпитопными пептидами HIG2 или URLC10, ограниченными по HLA-A0201 (WO2008/102557, PCT/JP2008/000290, включенные в качестве ссылки в настоящий документ), фармацевтическое средство или композиция, которая содержит эти пептиды, могут быть применимы как для HLA-A0201-позитивных пациентов, так и для HLA-A0206-позитивных пациентов.

Поскольку гены HIG2 или URLC10 сверхэкспрессируются в большинстве опухолевых тканей, таких как рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, рак пищевода, рак желудка, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркома, рак поджелудочной железы и опухоль мягких тканей, они являются хорошей мишенью для иммунотерапии. В частности, примеры раков со сверхэкспрессией HIG2 включают рак почки и опухоль мягких тканей. Также, примеры раков со сверхэкспрессией URLC10 включают рак мочевого пузыря, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, рак пищевода, рак желудка, немелкоклеточный рак легкого, остеосаркому, рак поджелудочной железы и опухоль мягких тканей. Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептидам, состоящим из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептидам, состоящим из десяти аминокислотных остатков), которые соответствуют эпитопным пептидам HIG2 или URLC10, ограниченным по HLA-A0206. Конкретно, предпочтительные примеры нонапептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают пептиды с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1 и 2. Более конкретно, примеры эпитопных пептидов HIG2, ограниченных по HLA-A0206, включают пептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и примеры эпитопных пептидов URLC10, ограниченных по HLA-A0206, включают пептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

В основном, модификация одной, двух или более аминокислот в белке не будет влиять на функцию белка или в некоторых случаях даже усилит желаемую функцию исходного белка. Действительно, известны модифицированные пептиды (т.е. пептиды, включающие аминокислотную последовательность, в которой один, два или несколько аминокислотных остатков модифицированы (т.е. замещены, удалены, добавлены и/или вставлены) по сравнению с исходной референсной последовательностью), которые сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller и Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном из вариантов осуществления пептиды по настоящему изобретению способны индуцировать ЦТЛ и имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или 2, где одна, две или даже более аминокислот добавлены, вставлены, удалены и/или замещены.

Специалисты в данной области признают, что единичные добавления или замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот, как правило, приводят к сохранению свойств исходной аминокислотной боковой цепи. В связи с этим они обычно обозначаются как "консервативные замены" или "консервативные модификации", при которых результатом изменения белка является модифицированный белок со свойствами и функциями, аналогичными исходному белку. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих получение функционально сходных аминокислот, хорошо известны в данной области. Примеры характеристик аминокислотных боковых цепей, которые желательно сохранить, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или характеристики, в общем: алифатическая боковая цепь (G, A, V, L, I, P); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу (S, T, Y); боковая цепь, содержащая атом серы (C, M); боковая цепь, содержащая карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковая цепь, содержащая основание (R, K, H) и ароматическая боковая цепь (H, F, Y, W). Кроме того, следующие восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, приемлемые в данной области в качестве консервативных замен друг для друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (M) (смотри, например, Creighton, Proteins 1984).

Такие консервативно модифицированные пептиды также рассматриваются в качестве пептидов по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению этим не ограничиваются и могут включать неконсервативные модификации при условии, что пептид сохраняет способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать ЦТЛ-индуцирующих пептидов полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей HIG2 или URLC10.

При использовании в контексте иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению должны быть презентированы на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в виде комплекса с антигеном HLA-A0206. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют ЦТЛ, но также обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA-A0206. С этой целью пептиды могут быть модифицированы посредством замены, вставки, делеции и/или добавления аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида с улучшенной аффинностью связывания. Поскольку закономерность последовательностей пептидов, которые отображаются посредством связывания с антигенами HLA, уже известна (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), то в дополнение к пептидам, которые отображаются естественным образом, в иммуногенные пептиды по изобретению можно вводить модификации на основании такой закономерности. Замены можно вводить не только в терминальные аминокислоты, но также по позициям потенциального TCR-распознавания пептидов. Несколько исследований продемонстрировали, что замены аминокислот в пептиде могут быть эквивалентны исходным или лучше, например CAP1, p53 _(264-272), Her-2/neu _(369-377) или gp100 _(209-217) (Zaremba et al., Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffmann et.al., J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3): 1338-47., S.O. Dionne et.al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S.O. Dionne et al. Cancer Immunology Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

Настоящее изобретение также предусматривает добавление одной или двух аминокислот, которые можно добавлять к N- и/или C-концу пептидов по изобретению. Такие модифицированные пептиды с высокой аффинностью связывания антигена HLA и сохраненной способностью индуцировать ЦТЛ также включены в настоящее изобретение.

Однако, когда последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка с другой функцией, можно индуцировать побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы по отношению к специфическим веществам. Таким образом, предпочтительно сначала провести поиски гомологии с использованием доступных баз данных, для того чтобы избежать ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда из поиска гомологии станет ясно, что не существует пептида с различием даже по одной или двум аминокислотам по сравнению с пептидом по изобретению, пептид по изобретению может быть модифицирован для повышения аффинности связывания с антигенами HLA и/или для усиления его способности индуцировать ЦТЛ без какой-либо опасности таких побочных эффектов.

Хотя ожидается, что пептиды, модифицированные, как описано выше, будут высокоэффективными, кандидатные пептиды проверяют на наличие способности индуцировать ЦТЛ для выбора более высокоэффективных пептидов. В настоящем документе фраза "способность индуцировать ЦТЛ" указывает на способность пептида индуцировать цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), когда он презентирован на антигенпрезентирующих клетках. Далее, "способность индуцировать ЦТЛ" включает в себя способность пептида индуцировать активацию ЦТЛ, пролиферацию ЦТЛ, способствовать ЦТЛ-опосредованному лизису клеток-мишеней и повышать выработку IFN-гамма цитотоксическими лимфоцитами.

Подтверждение способности индуцировать ЦТЛ осуществляют путем индукции антигенпрезентирующих клеток, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или, более конкретно, DC, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; после стимуляции пептидами их смешивают с CD8-позитивными клетками и затем измеряют IFN-гамма, который произведен и высвобожден цитотоксическими лимфоцитами против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, которые созданы для экспрессии антигена человека HLA-A0206 (BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79). Например, клетки-мишени можно пометить радиоактивной меткой ⁵¹Cr и т.п., и цитотоксическую активность можно рассчитать по радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней, у которых антиген HLA является HLA-A0206. Альтернативно, способность индуцировать ЦТЛ можно оценить путем измерения IFN-гамма, который произведен и высвобожден цитотоксическими лимфоцитами в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), несущих иммобилизованные пептиды, и путем визуализации зоны ингибирования в среде для клеток с использованием моноклональных антител к IFN-гамма.

В дополнение к вышеописанным модификациям пептиды по настоящему изобретению могут также быть связаны с другими веществами, при условии, что полученный связанный пептид сохраняет необходимую способность исходного пептида индуцировать ЦТЛ. Примеры подходящих веществ включают в качестве неограничивающих примеров: пептиды, липиды, сахар и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологическую активность исходного пептида. Такие типы модификаций можно осуществлять для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации полипептида.

Например, для увеличения стабильности полипептида in vivo, существует известное в данной области введение D-аминокислот, миметиков аминокислот неприродных аминокислот; этот подход можно также применять по отношению к полипептидам по изобретению. Стабильность полипептида можно анализировать различными способами. Например, для проверки стабильности можно использовать пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека (смотри, например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Далее, пептиды по настоящему изобретению можно присоединять к другим пептидам посредством спейсеров или линкеров. Примеры других пептидов включают в качестве неограничивающих примеров пептиды, полученные из других ОАА и способные индуцировать ЦТЛ. Альтернативно, два или более пептида по настоящему изобретению могут быть связаны посредством спейсеров или линкеров. Пептиды, связанные посредством спейсеров или линкеров, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Спейсеры или линкеры конкретно не ограничены, но предпочтительно являются пептидами, более предпочтительно пептидами с одним или несколькими сайтами расщепления, которые можно расщепить ферментами, такими как пептидазы, протеазы и протеасомы. Примеры линкеров или спейсеров включают в качестве неограничивающих примеров: AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) или от одного до нескольких остатков лизина (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Пептиды по настоящему изобретению охватывают такие пептиды, связанные с другими пептидами посредством спейсеров или линкеров.

Пептиды по настоящему изобретению могут существовать на поверхности клетки, несущей антигены MHC человека (например, антигенпрезентирующая клетка), или экзосомы в виде комплексов в сочетании с молекулами MHC и таким образом индуцировать ЦТЛ. Клетки и экзосомы можно получать способами, широко известными в данной области, например клетки можно получать посредством контакта с пептидами по настоящему изобретению и экзосомы можно получать посредством сбора фракции, содержащей экзосомы, из клеток, контактировавших с пептидами по настоящему изобретению (смотри, например, Japanese Patent Application Kohyo Publications No. Hei 11-510507 и WO99/03499). Пептиды по настоящему изобретению охватывают пептиды, существующие на поверхности клетки или экзосомы в виде комплексов в сочетании с молекулами MHC.

В настоящем документе пептиды по настоящему изобретению могут быть также описаны как "пептид(ы) HIG2 или URLC10" или "полипептид(ы) HIG2 или URLC10".

III. Препараты пептидов

Пептиды по настоящему изобретению можно приготовить с использованием хорошо известных техник. Например, пептиды можно приготовить синтетически с использованием технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза. Пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы по отдельности или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Пептиды затем можно изолировать, т.е. очищать или выделять таким образом, чтобы они стали по существу свободными от других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов или любых других химических веществ.

Пептид по настоящему изобретению можно получать посредством химического синтеза, основываясь на выбранной аминокислотной последовательности. Примеры подходящих способов пептидного синтеза, которые можно применять для синтеза, включают в качестве неограничивающих примеров:

Альтернативно, пептиды по изобретению можно получать, применяя любые известные способы генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала готовят подходящий вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению в экспрессирующейся форме (например, после регуляторной последовательности, которая соответствует промоторной последовательности), и трансформируют подходящую клетку-хозяина. Клетку-хозяина затем культивируют для получения интересующего пептида. Пептид также можно получать in vitro, применяя систему трансляции in vitro.

IV. Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который кодирует указанные выше пептиды по настоящему изобретению. Таковые включают в себя полинуклеотиды, полученные из природных генов HIG2 или URLC10 (SEQ ID NO:3 или 5, GenBank Accession NO NM_013332 или NM_017527), а также те, которые содержат их консервативно модифицированную нуклеотидную последовательность. В настоящем документе фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" относится к последовательности, которая кодирует идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. В связи с вырожденностью генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой заданный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU - все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждой позиции, где кодоном предусмотрен аланин, кодон можно изменить на любой соответствующий описанный кодон без изменения закодированного полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются "молчащими мутациями", которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем документе, которая кодирует пептид, описывает также каждую возможную молчащую мутацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который является, как правило, единственным кодоном для метионина, и TGG, который является, как правило, единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая мутация нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, косвенно описана в каждой раскрытой последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть составлен из ДНК, РНК и их производных. ДНК обычно состоит из оснований, таких как A, T, C, и G; в РНК T заменена на U.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать множество пептидов по настоящему изобретению, со вставками или без вставок аминокислотных последовательностей между ними. Например, вставленная аминокислотная последовательность может содержать сайт щепления (например, сайт распознавания фермента) полинуклеотида или транслируемых пептидов. Кроме того, полинуклеотид может включать в себя любые последовательности дополнительно к кодирующей последовательности, которая кодирует пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть рекомбинантным полинуклеотидом, который включает в себя регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии пептида, или может быть экспрессирующим вектором (плазмидой) с маркерными генами и т.п. В основном, такие рекомбинантные полинуклеотиды могут быть приготовлены путем воздействия на полинуклеотиды подходящими рекомбинантными способами, например с использованием полимераз и эндонуклеаз.

Для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать технологии как рекомбинантного, так и химического синтеза. Например, полинуклеотид может быть получен посредством вставки в подходящий вектор, который экспрессируется в компетентных клетках после трансфекции. Альтернативно, полинуклеотид можно амплифицировать с использованием методов ПЦР или экспрессии в подходящих носителях (смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид может быть синтезирован с использованием методов твердой фазы, как описано в Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

Векторы, содержащие полинуклеотид по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, которые содержат такие векторы, также включены в настоящее изобретение.

V. Экзосомы

Настоящее изобретение дополнительно относится к внутриклеточным пузырькам, которые называются экзосомами и презентируют на своей поверхности комплексы, образованные пептидами и антигенами HLA. Экзосомы могут быть получены, например, с использованием способов, подробно описанных в Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos. Hei 11-510507 и WO99/03499, и могут быть приготовлены с использованием APC, полученных от пациентов, которых лечат и/или которым проводят профилактику. Экзосомы по данному изобретению можно прививать как вакцины, некоторым образом сходно с пептидами по данному изобретению.

В контексте настоящего изобретения тип антигенов HLA, включенных в комплексы, должен быть HLA-A0206, и пациент, которому прививают экзосомы, должен иметь антиген HLA-A0206. Обычно, в клинике, тип антигена HLA у пациента, которому необходимо лечение, определяют заранее, что делает возможным соответствующий отбор пациентов, у которых ожидается благоприятный эффект от лечения экзосомами по настоящему изобретению.

VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Настоящее изобретение также относится к изолированным APC, которые презентиру