Способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами

Способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологическим способам очистки окружающей среды, и может применяться для почвообразования и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известны разнообразные биопрепараты на основе микроорганизмов и их ассоциаций, используемых для снижения нефти и нефтепродуктов в почвогрунтах. Например, известен консорциум штаммов микроорганизмов - деструкторов, состоящий из 4 штаммов рода Alcaligenes и 1 штамма рода Pseudomonas (патент РФ № 2160719, МПК C02F 3/34).

Указанные консорциумы-деструкторы углеводородов составлены из микроорганизмов-прокариотов, что ограничивает возможность их применения. Так как указанные микроорганизмы характеризуются отсутствием в клетках настоящего ядра с оболочкой, отделяющей его от протоплазмы, что позволяет данные микроорганизмы относить к примитивной группе, т.е. отсутствием возможности передавать последующим поколениям приобретенные признаки, в данном случае разлагать нефть. (Н.Ф.Реймерс, А.В.Яблоков «Словарь терминов и понятий, связанных с охраной живой природы», изд. «Наука», М., 1982 г. с.98, 42).

Известен способ получения биопрепарата «Биава» для рекультивации почв (патент РФ № 2248255, МПК В09С 1/10), который содержит в своем составе пористый носитель, содержащий стеклообразные силикофосфаты переменного состава и неоднородного строения, обеспечивающие оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности клеток микроорганизмов на пористой структуре, в которой содержатся одновалентные и 2 - валентные щелочноземельные катионы, легирующие микроэлементы, добавки - оксиды металлов, влияющие на кинетику. В качестве активных микроорганизмов вносятся протеолитические и амилолитические микроорганизмы, или актиномицеты, или азотофиксирующие бактерии, или целлюлозоразлагающие и гумусоразлагающие микроорганизмы, или денитрофикаторы.

Известный биопрепарат имеет сложную технологию получения в связи с тем, что включает глубинное культивирование микроорганизмов на жидкой питательной среде, подготовку стерильного носителя - стеклообразных силикофосфатов со сквозными порами для иммобилизации и жизнедеятельности клеток активных микроорганизмов на пористой структуре. Это удорожает процесс его получения и использования, что ограничивает его использование на больших площадях.

Известен способ получения препарата гуминовых кислот для почвообразования. (а.с. РФ № 1213760 МПК C12N 1/00). Препарат готовится из отходов угольной промышленности, инокулированных микроорганизмами с последующим культивированием водной суспензии в течение 10-15 суток до лизиса бактериальных культур. В течение приготовления препарата в водную суспензию вводят два раза фенол, который является источником органического углерода для жизнедеятельности микроорганизмов.

Однако фенол одновременно является бактерицидным веществом, приводящий к лизису микроорганизмов, т.е. препарат, не содержащий активной микрофлоры, становится менее активным.

В указанном известном решении длительное приготовление препарата (10-15 суток), а также ограниченное содержание в препарате живых бактериальных клеток в виду их лизиса и добавления фенола в препарат в качестве источника углерода указывают на недостатки данного препарата.

Кроме того, получение жидкого препарата требует быстрого его использования ввиду того, что жидкие препараты быстро портятся и теряют свою активность. В этой связи такие препараты используют в той же местности, где они получены, т.к. их нельзя перевозить на большие расстояния.

Известен способ получения препарата, заключающийся в обработке отходов угольной промышленности путем добавления к ним воды и инокулирования полученного раствора культурами Pseudomonas aeruginosa и Bacillus megaterium с последующей экспозицией смеси при t 28-30°C в течение 10-12 суток (а.с. РФ № 1077277 МПК C12N 1/00), принятый нами за прототип. Препарат, полученный данным способом, содержит незначительное содержание гуминовых кислот (57%) и карбоновых кислот (11%), а аминокислоты и полисахариды отсутствуют.

Данный способ имеет те же недостатки, как и вышеуказанные, в силу того, что относится к получению жидкого препарата. Кроме того, при перевозках на большие расстояния он теряет активность, которая и так не очень высокая, также уменьшается активность в его составе аминокислот - дополнительный источник питания для аборигенной микрофлоры и не содержит полисахариды, участвующие в процессе структурирования рекультивируемых почвогрунтов. Отходы угольной промышленности в своем составе имеют оксиды токсичных металлов: меди, хрома, цинка, бария, которые отрицательно действуют на почвенную микрофлору и выращиваемые растения.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение в биопрепарате содержания гуминовых, карбоновых, аминокислот и полисахаридов при минимальных затратах и сроков его изготовления.

Для достижения указанного технического результата в способе получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами, на основе наполнителя и бактериальных культур, согласно изобретению, готовят смесь из жидких бактериальных культур, в качестве которых берут штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12, в соотношении соответственно 3:1,5:0,5- 3:2:1, и осуществляют обработку отходов обогащения бурого угля путем добавления к ним полученной жидкой смеси штаммов с последующим перемешиванием и высушиванием приготовленной смеси в течение не менее 2,5 суток при комнатной температуре, при этом отходы обогащения бурого угля и предварительно подготовленную смесь штаммов берут в соответственно соотношении, масс.%: 40-50:50-60.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКГ депонирован в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) 05 июля 2011 под регистрационным номером RCAM00538,

Штамм КОА-4 Pseudomonas fluorescens депонирован в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) 2 августа 2002 г. под регистрационным номером "ND-610 ВНИИСХМ".

Штамм Azotobacter chroococcum АИН депонирован в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) 05 июля 2011 г. под регистрационным номером RCAM00539.

Заявленная совокупность существенных признаков позволяет обеспечить повышение в биопрепарате содержание гуминовых, карбоновых, аминокислот и полисахаридов при минимальных затратах и сроков его изготовления. Использование отходов обогащения бурого угля позволяет исключить влияние вредных микроэлементов на процесс очистки и восстановления плодородия почвогрунтов.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Для получения биопрепарата брали отходы обогащения бурого угля, содержащие оксиды следующего состава, (%): марганца (IV) - 0,01; железа (III) - 0,82; кремния (IV) - 13,8; алюминия - 4,01; кальция - 0,19; магния - 0,10; фосфора (V) - 0,03; калия - 0,06; натрия - 0,02; серы - 0,36. Массовая доля влаги в отходах и потери массы при прокаливании составили соответственно, (%): 73,17 и 5,93.

Отходы обогащения бурого угля данного состава используется без дробления, т.к. имеет фракционный состав следующего содержания, что значительно удешевляет технологию приготовления биопрепарата.

2,5-3,0 мм	1,5-2,0 мм	0,5-1,0 мм	0,2-0,3 мм
0,5%	3,0%	87,0%	9,5%

Для получения биопрепарата брали штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539.

Штаммы микроорганизмов предварительно выделяли из нефтезагрязненных земель Пермского края. Микроорганизмы адаптированы к химическому составу нефтегрунтов в природных условиях.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 выращивали на питательной среде следующего состава (г/л):

NH4Cl	KH2PO4	MgSO4·7H2O	NaCl	FeSO4·7H2O	CaCO3	Глюкоза	Тимоловый синий	H2O дистил.	pH среды
1,0	2,0	0,5	2,0	следы	0,5	10	0,05	Остальное	7,2

В приготовленную и простерилизованную в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут питательную среду добавляли 1 мл стерильной смеси микроэлементов. Смесь микроэлементов содержит в 1 л воды, (г): H₃BO₃ - 5; (NH₄)₂MoO₄ - 5; KJ - 0,5; NaBr - 0,5; ZnSO₄·7H₂O - 0,2; Al₂(SO₄)₃ - 0,3. Указанную смесь микроэлементов предварительно стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атмосфер в течение 15 минут. В стерильную питательную среду вышеуказанного состава инокулировали бактериальный штамм Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 в количестве 1 мл с титром 10^-13 и ставили в термостат при температуре 28°C. Штамм в термостате подвергали аэрированию с помощью аэратора FAT-mini в течение 2-х суток. Через 2 суток бактериальная культура штамма Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10 готова для использования. Аналогично выращивали штамм с титром 10^-12, 10^-10.

Штамм КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ выращивали на питательной среде следующего состава, (г/л):

NH4Cl	KH2PO4	MgSO4·7H2O	NaCl	FeSO4·7H2O	CaCO3	Глюкоза	Тимоловый синий	H2O дистилированная	pH среды
1,0	0,5	0,5	1,5	0,05	1,0	10	0,005	остальное	7,0

В приготовленную и простерилизованную в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут питательную среду добавляют 1 мл стерильной смеси микроэлементов. Смесь микроэлементов содержит в 1 л воды, (г): H₃BO₃ - 5; (NH₄)₂MoO₄ - 5; KJ - 0,5; NaBr - 0,5; ZnSO4 - 0,2; Al₂(SO₄)₃ - 0,3. Указанную смесь микроэлементов предварительно стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атмосфер в течение 15 минут. В стерильную питательную среду вышеуказанного состава инокулировали штамм КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ в количестве 1 мл с титром 10^-10 и ставили в термостат при температуре 28°C. Штамм в термостате подвергали аэрированию с помощью аэратора FAT-mini в течение 2 суток. Через 2 суток бактериальная культура штамма КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10 готова для использования. Аналогично выращивали штамм с титром 10^-11, 10^-12.

Штамм Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 выращивали на питательной среде следующего состава, (г/л):

CaHPO4	KH2PO4	MgSO4·7H2O	NaCl	FeCl3	CaCO3	K2SO4	Глюкоза	H2O дистилированная	pH среды
0,2	0,3	о,з	0,5	0,01	5,0	0,2	20,0	осталь ное	7,0

В приготовленную и простерилизованную в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут питательную среду добавляют 1 мл стерильной смеси микроэлементов. Смесь микроэлементов содержит в 1 л воды, (г): H₃BO₃ - 5; (NH₄)₂MoO₄ - 5; KJ - 0,5; NaBr - 0,5; ZnSO₄ - 0,2; Al₂(SO₄)₃ - 0,3. Указанную смесь микроэлементов предварительно стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атмосфер в течение 15 минут. В стерильную питательную среду вышеуказанного состава инокулировали штамм Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 в количестве 1 мл с титром 10^-12 и ставили в термостат при температуре 28°C. Культуру штамма в термостате подвергали аэрированию с помощью аэратора FAT-mini в течение 2 суток. Через 2 суток бактериальная культура штамма Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 готова для использования. Аналогично выращивали штамм с титром 10^-11, 10^-10.

Пример 2. Для получения биопрепарата заявленным способом брали полученные жидкие штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 в соотношении 3:1,5:0,5 и смешивали между собой. Полученную жидкую смесь вышеуказанных штаммов приливали к сухим отходам обогащения бурого угля, при этом соотношение отходов обогащения бурого угля и смеси штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИ-ИСХМ и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 составляет соответственно 50:50 мас.%. Полученную смесь перемешивали, раскладывали на горизонтальной поверхности и сушили при комнатной температуре в течение 2 суток. Просушенную смесь растирали металлическим катком с диаметром приблизительно 10 см, таким образом, чтобы не оставалось крупных кусков, в результате получили биопрепарат с фракционным составом:

2,5-3,0 мм	1,5-2,0 мм	0,5-1,0 мм	0,2-0,3 мм
0,1%	0,8%	98,0%	1,1%

содержащий штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12. В полученном биопрепарате определяли количество гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов и биомассу по сухому весу, содержание которых составило, (%): гуминовых кислот - 68,5, карбоновых кислот - 12,6, аминокислот - 2,8, полисахаридов - 3,1 и содержание общей биомассы - 14,9. Данные результаты представлены в таблице 1.

Пример 3. Аналогично примеру 2 готовили биопрепарат заявленным способом, но соотношение отходов обогащения бурого угля и смеси жидкой культуры штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 составляло соответственно 45:55 масс.%. Высушивание приготовленной смеси проводили при комнатной температуре в течение 2,5 суток. Для приготовления жидкой смеси культур штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 их брали соответственно в соотношении 3:2:0,5.

В полученном биопрепарате определяли количество гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов и биомассу по сухому весу, содержание которых составило, (%): гуминовых кислот - 72,7, карбоновых кислот - 15,3, аминокислот - 3,8, полисахаридов - 3,7 и содержание общей биомассы штаммов - 16,1. Данные результаты представлены в таблице 1.

Пример 4. Аналогично примеру 2 готовили биопрепарат заявленным способом, но соотношение отходов обогащения бурого угля и смеси жидкой культуры штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND- 610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 составляло 40:60 в масс.% соответственно. Высушивание приготовленной смеси проводили при комнатной температуре в течение 3 суток. Для приготовления жидкой смеси культур штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 их брали соответственно в соотношении 3:2:1.

В полученном биопрепарате определяли количество гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов и биомассу по сухому весу, содержание которых составило, (%): гуминовых кислот - 72,6, карбоновых кислот - 15,3, аминокислот - 3,6, полисахаридов - 3,6 и содержание общей биомассы штаммов - 16,0. Данные результаты представлены в таблице 1.

Пример 5. Аналогично примеру 2 готовили биопрепарат заявленным способом, но соотношение отходов обогащения бурого угля и смесь жидкой культуры штаммов Pseu-domonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 составляло соответственно 55:45 масс.%. При этом для приготовления жидкой смеси культуры штаммов, они взяты в соотношении соответственно 3:1,0:0,5.

Сушку отходов со смесью с жидкими штаммами проводили при комнатной температуре в течение 3 суток. В полученном биопрепарате определяли количество гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов и биомассу по сухому весу, содержание которых составило: гуминовых кислот - 67,7%, карбоновых кислот - 10,8%, аминокислот - 1,9%, полисахаридов - 2,8% и содержание общей биомассы штаммов - 11,5,0%. Данные результаты представлены в таблице 1.

В процессе получения биопрепарата заявленным способом было определено опытным путем время сушки препарата в зависимости от его влажности: препарат, содержащий шлам бурого угля в количестве 50% и жидкую смесь штаммов - 50% (Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539), вначале сушки имел влажность 60% и подсыхал в течение 2 дней. Препарат, содержащий 45% шлама и жидкой смеси штаммов - 55%, подсыхал за 2,5 суток при влажности 68%, и препарат, содержащий шлам в количестве 40% и остальное - жидкая смесь штаммов 60%, имел влажность 70% и подсыхал в течение 3 суток.

Пример 6. В качестве контроля сравнивали биопрепарат, полученный заявленным способом, по максимальному содержанию гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов и биомассы Pseudomonas fluorescens ВКГ с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens 10^-10 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 10^-10 в полученных вариантах, содержащих отходы бурого угля и смеси штаммов в соотношениях 45%-55%, 50%-50% и 40-60%, с препаратом, полученным известным способом. Результаты представлены в таблице 2.

В оптимальном варианте при соотношении 45:55% отходов обогащения бурого угля и смеси штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens 10 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 10 в биопрепарате, полученного заявляемым способом, по сравнению с аналогом состав карбоновых и аминокислот в биопрепаратах представлены в таблице 3.

Таблица 3
Биопрепарат	Производственно-ценные свойства препаратов
гуминовые кислоты, %	карбоновые кислоты, %	аминокислоты, %	полисахариды, %	биомасса микроорганизмов, мг/кг
Предлагаемый	72,7	15,3	3,8	3,7	16,1
Известный	57	11,97		-	14,0

Проведенные испытания показали, что в биопрепарате, полученным заявленным способом, содержание составило, (%): гуминовые кислоты в количестве - 72,7; карбоновые - 15,3; аминокислоты - 3,8 и полисахариды - 3,7, при содержании биомассы (мг/кг) - 16,1.

В известном препарате содержатся только гуминовые и карбоновые кислоты, (%) - соответственно 57 и 11,97. А содержание биомассы - 14,0 мг/кг. Аминокислоты и полисахариды препарат не содержит.

Количественное содержание карбоновых и аминокислот в биопрепаратах представлено в таблице 4.

Таблица 4
Биопрепарат	Карбоновые кислоты	Аминокислоты
уксусная	пропионовая	масляная	валерьяновая	всего	аспарагиновая	глютаминовая	всего
Предлагаемый	2,2	1,7	9,6	1,8	15,3	2Д	1,7	3,8
Известный	1,88	0,10	8,42	1,44	11,97	-	-	-

Как видно, биопрепарат, полученный заявленным способом, содержит значительно больше карбоновых кислот, таких как уксусной - 2,2%, в известном -1,88%; пропионовой - 1,7%, в известном 0,1%; Аминокислоты, такие как: аспарагиновая - 2,1%; глютаминовая - 1,7%, в известном препарате данные компоненты отсутствуют.

Как видно в биопрепарате, полученном заявленным способом, содержания гуминовых, карбоновых, аминокислот и полисахаридов значительно выше при минимальных затратах и сроков его изготовления.

При получении биопрепарата, заявленным способом, при содержании отходов обогащения бурого угля и смеси штаммов 50% и 50%; 45% и 55% были проведены опыты по определению активности титров штаммов, содержащих Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, 10^-12 и 10^-11, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10,10^-9 и 10^-8 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12, 10^-11 и 10^-10, данные представлены в таблице 5.

Таблица 5
Отходы обогащения бурого угля, %	Смесь штаммов, %	Титр Pseudomonas fluoresce ns ВКГ	Титр КОА-4 Pseudomonas fluoresce ns	Титр Azotobacter chroococcum АИН	Гуминовые ислоты, %	Карбоновые кислоты, %	Аминокислоты, %	Полисахариды, %	Биомасса Ps.Fluor escens ВКГ, КОА-4 Pseudomonas fluoresce ns и Az. chroococcum АИН, %
50	50	10-13	10-10	10-12	68,5	12,6	2,8	3,1	12,4
10-12	10-9	10-11	65,4	9,6	1Д	2,7	13,1
10-11	10-8	10-10	63,6	8,2	0,5	2Д	11,6
45	55	10-13	10-10	10-12	72,7	15,3	3,8	3,7	16,1
10-12	10-9	10-11	66,3	11,1	1,9	3,1	14,8
10-11	10-8	10-10	65,5	10,9	0,7	2,6	12,2

Результаты опытной проверки показали, что наилучшие результаты оказались в опыте, включающем 45% отхода обогащения бурого угля и 55% смеси штаммов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром Ю-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens. с титром 10^-10 Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12, взятых в соотношении соответственно 3:2:0,5, что видно по содержанию гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов, и по содержанию биомассы микроорганизмов, содержание которых составляет соответственно, % - 72,7; 15,3; 3,8; 3,7; 16,1.

Также в оптимальном варианте, содержащим 45% шлама обогащения бурого угля, смеси штаммов в количестве 55% был проверен титр Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539. В результате исследований было выявлено, что при титре вышеуказанных микроорганизмов - 10^-13, 10^-10 и 10^-12 были получены оптимальные варианты на содержание гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов и биомассы при соотношении штаммов: 3:2:0,5.

При содержании в препарате 50% отходов обогащения бурого угля и 50% культуральной смеси штаммов, при титрах 10^-13, 10^-10, 10^-12 соответственно штамма Pseudomonas fluorescens ВКГ, КОА-4 Pseudomonas fluorescens и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539, взятых в соотношении 3:1,5:0,5- количество гуминовых, карбоновых, аминокислот и биомассы микроорганизмов соответственно составило, (%): 68,5; 12,6;2,8; 3,1; 12,4. В препаратах с более низкими титрами количество вышеуказанных ингредиентов было значительно меньшим.

Пример 7. Для изучения возможности использования биопрепарата, полученного заявленным способом, проводили испытания в вегетационных сосудах в лабораторных условиях. Емкость вегетационных сосудов составила 3 л, высота 25 см. Сосуды заполняли почвогрунтами, загрязненными нефтепродуктами. Вес почвогрунтов при набивке составил 2,5 кг. Величина pH почвогрунтов 7,2.

В почвогрунты посеяли семена злакового растения житняка, по 30 семян на сосуд. Семена были обработаны сухим биопрепаратом, полученным заявляемым способом, содержащим штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12. Затем почвогрунты, обработанные биопрепаратом, поливались дистиллированной водой в количестве 100 мл на сосуд.

Параллельно ставились опыты с гуминовым препаратом аналога, т.е. вначале были посеяны семена житняка, после чего производилась обработка жидким препаратом гуминовых кислот в количестве 1 мл, разбавленного до 100 мл дистиллированной водой. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6
Биорепарат, полученный способом	Количество гуминовых кислот в препарате, %	Количество карбоновых кислот в препарате, %	Количество аминокислот, %	Количество полисахариды, %	Высота растений в вегетационных сосудах, см	Количество азотобактера в почвогрунтах, тыс/г
Известным	57,0	11,0	-	-	20,0	2,8
Предлагаемым	72,7	15,3	2,8	3,8	48,7	27,4

В таблице 7 представлено содержание нефтепродуктов в вегетационных сосудах до очистки и после очистки при использовании биопрепарата, полученного заявленным способом.

Таблица 7
Биопрепарат, полученный способом	Количество нефтепродуктов в почвогрунтах, %
до очистки	после очистки через месяц	после очистки через 3 месяца
Известный	100	75,6	12,01
Предлагаемый	100	1,2

Как видно, уже через месяц количество нефтепродуктов с препаратом, полученным предлагаемым способом, составило почти в 70 раз меньше.

Испытания показали, что оптимальные результаты были получены с использованием биопрепарата, полученного по предлагаемому способу. Через 20 суток высота растений в составила 48,7 см. С применением препарата, полученного по известному способу, высота растений составила лишь 20 см. Биопрепарат, полученный заявляемым способом, оказывает стимулирующее влияние и на развитие азотобактера - показателя на плодородие. Количество азотобактера возросло за 20 суток в 10 раз по сравнению с содержанием в почвогрунтах с использованием препарата гуминовых кислот по известному способу.

Таким образом, повышенное содержание карбоновых, гуминовых, аминокислот являются хорошими стимуляторами роста растений и сапрофитной микрофлоры, полисахариды принимают участие в оструктуривании почвогрунтов, что способствует повышению плодородия почвы.

Следовательно, технология получения препарата, заявленным способом, обеспечивает при минимальных затратах получение содержания гуминовых, карбоновых, аминокислот, полисахаридов в большем количестве, чем аналог, а также биомассы штаммов микроорганизмов, превосходящей по количеству биомассу аналога. При этом скорость получения препарата в 2-3 раза быстрее по сравнению с аналогом, в котором препарат получен за 10-12 суток. Кроме того, сухой биопрепарат, полученный заявленным способом, сохраняет свои полезные свойства в течение одного года, а известный - жидкий только один месяц.

Предлагаемый препарат можно использовать при рекультивации нарушенных земель в нефтяной, угольной, железорудной и золотодобывающей промышленности, а также для повышения плодородия малопродуктивных земель и восстановления плодородия футбольных газонов.

Способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами, на основе наполнителя и бактериальных культур, отличающийся тем, что готовят смесь из жидких бактериальных культур, в качестве которых берут штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 с титром 10^-13, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром 10^-10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром 10^-12 в соотношении соответственно 3:1,5:0,5-3:2:1, и осуществляют обработку отходов обогащения бурого угля путем добавления к ним полученной жидкой смеси штаммов с последующим перемешиванием и высушиванием приготовленной смеси в течение не менее 2,5 суток при комнатной температуре, при этом отходы обогащения бурого угля и предварительно подготовленную смесь штаммов берут соответственно в соотношении, мас.%: 40-50:50-60.