Моноклональное антитело человека против альфа-токсина из s. aureus и его применение в лечении или предотвращении образования абсцесса

Моноклональное антитело человека против альфа-токсина из s. aureus и его применение в лечении или предотвращении образования абсцесса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу человека, специфичному в отношении альфа-токсина S. aureus, гибридоме, продуцирующей указанное антитело, нуклеиновым кислотам, кодирующим его, а также к клеткам-хозяевам, трансфецированным указанными нуклеиновыми кислотами. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения указанного моноклонального антитела. Дополнительно, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно антитело или по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антитело. Настоящее изобретение также относится к применению указанного моноклонального антитела для лечения или предотвращения образования абсцесса.

Золотистый стафилококк (S. aureus) - это факультативно анаэробная грамположительная сферическая бактерия, которая считается оппортунистическим патогеном. S. aureus обычно колонизирует нос, кожу и слизистую оболочку желуд очно-кишечного тракта здоровых людей. В любой момент времени риблизительно 20-30% населения инфицированы S. aureus. У здоровых людей эти бактерии часто вызывают вторичные инфекции, такие как прыщи и фурункулы. Как правило, слизистые оболочки и эпидермальные барьеры (кожа) защищают от инфицирования S. aureus. Нарушение целостности этих естественных барьеров в результате повреждений, таких как ожоги, травмы или хирургические операции, значительно увеличивает риск инфицирования и может стать причиной тяжелых и/или системных заболеваний. Болезни, которые подавляют иммунную систему (например, сахарный диабет, поздние стадии почечной недостаточности, рак, СПИД и другие вирусные инфекции), а также иммуносупрессивные виды терапии, например, такие как облучение, химиотерапия и трансплантационная терапия, увеличивают риск инфекции. Оппортунистические инфекции, вызванные S. aureus, могут стать довольно серьезными и индуцировать развитие эндокардита, бактериемии, остеомиелита и образование абсцессов, которые, в свою очередь, могут быть причиной серьезных заболеваний и смерти. Стафилококковые инфекции могут быть разделены на локализованные инфекции, такие как пневмония, и клинически более сложные стафилококковые инфекции, такие как сепсис и образование абсцессов, вызванное диссеминацией патогенна в отдаленный орган.

Во всем мире S. aureus является главной причиной сепсиса, инфекций кожи, мягких тканей, а также нижних дыхательных путей. На протяжении многих лет количество случаев заболеваемости как внутрибольничными, так и внебольничными инфекциями неуклонно растет. Помимо этого, лечение подобных инфекций осложнилось появлением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. В развитых странах, таких как США, устойчивость метициллин-резистентных штаммов золотистого стафилококка (МРЗС) к антибиотикам β-лактамного ряда является серьезной проблемой в больницах и других медицинских учреждениях. Важно, что заболеваемость всеми инвазивными инфекциями, вызываемыми МРЗС, включая внебольничные инфекции, является высокой по сравнению с другими бактериальными патогенами, и 20% этих инфекций приводят к смерти. Дополнительно, появление приобретенной устойчивости к ванкомицину дополнительно ограничило возможности лечения тяжелых стафилококковых инфекций.

S. aureus имеет разнообразный арсенал факторов вирулентности, вносящих вклад в патогенез заболевания. Их можно грубо разделить на поверхностные белки и белки, секретируемые во внешнюю среду. Поверхностные белки включают как структурные компоненты клеточной стенки бактерий, такие как пептидогликан и липотейхоевые кислоты, так и поверхностные белки, преимущественно экспрессируемые в течение фазы экспоненциального роста, включая белок А, фибронектин-связывающий белок и фактор слипания. Секретируемые белки, как правило, выделяются из бактериальных клеток во время стационарной фазы роста бактерий и включают несколько токсинов, таких как альфа-токсин (также известный как альфа-гемолизин), энтеротоксин В, лейкоцидины (включая лейкоцидин Пантон-Валентина, ПВЛ), липазу и протеазу V8. Однако, несмотря на большой объем знаний о биохимических и молекулярных свойствах этих токсинов, их точная роль в патогенезе инфекций, вызванных S. aureus, не ясна до конца.

Экспериментальные подтверждения и эпидемиологические данные позволяют предположить, что альфа-токсин может быть вовлечен в патогенез пневмонии наряду с другими цитотоксинами (Me Eiroy et al, 1999). Предполагают, что альфа-токсин связывается с поверхностными рецепторами восприимчивых клеток-хозяев и таким образом прикрепляется к поверхности клетки. Это событие способствует олигомеризации токсина в гептамерную структуру, формирующую раннюю пору, с последующим встраиванием β-цилиндрической структуры с диаметром поры 2 нм в плазматическую мембрану. Образование поры приводит к потере целостности мембраны, дестабилизирует клетки и, в конечном итоге, инициирует апоптоз и лизис клетки. К образованию поры, индуцированному альфа-токсином, особенно чувствительны такие клетки, как лимфоциты, макрофаги, альвеолярные эпителиальные клетки, легочный эндотелий и эритроциты. В то же время гранулоциты и фибробласты, по-видимому, устойчивы к лизису (Me Eiroy et al, 1999).

Точная роль альфа-токсина в воспалительной реакции и индукции врожденного иммунного ответа на бактериальные инфекции понятна не полностью. S. aureus экспрессирует ряд других факторов вирулентности, и на сегодняшний день вклад каждого фактора вирулентности в проявление болезни понятен не до конца и представляет собой задачу для разработки профилактики и лечения клинически сложных инфекций, вызванных золотистым стафилококком.

Как известно, альфа-токсин является одним из факторов вирулентности при развитии у хозяина инфекции, индуцированной S. aureus, и в ряде исследований подчеркивалась важность альфа-токсина в течении болезни, например, инстилляция очищенного альфа-токсина кролику или в легочные ткани крысы вызывает сосудистую утечку и легочную гипертензию, которую связывают с высвобождением различных сигнальных молекул (например, фосфатидилинозитола, оксида азота, простагландинов и тромбоксана А2). В литературе было показано, что невосприимчивость к альфа-токсину защищает от вредного воздействия токсинов, однако разработка вакцин против альфа-токсина остается серьезной проблемой.

Wardenburg и Schneewind (2008) показали, что тяжесть болезни легких у мышей коррелирует с уровнями альфа-токсина, вырабатываемого определенным изолятом золотистого стафилококка. Кроме того, авторы показали, что иммунизация против варианта альфа-токсина, неспособного к формированию поры, индуцирует развитие невосприимчивости к пневмонии, вызываемой S. aureus. Эти данные согласуются с результатами исследования той же группы, демонстрирующими, что альфа-токсин важен для патогенеза внебольничной пневмонии, вызываемой (метициллин-резистентный золотистый стафилококк). В другом эксперименте авторы показали, что антитела к альфа-токсину также защищали эпителиальные клетки легких человека от S. aureus-индуцированного лизиса (Wardenburg and Schneewind (2008)).

Хотя эти результаты показывают, что альфа-токсин участвует в разрушении тканей легких, остается неясным, является ли смерть животных в описанных выше экспериментах результатом прямого разрушения клеток легких токсином или чрезмерной воспалительной реакции или обеих причин. Пассивный перенос антител к альфа-токсину значительно снижал уровень циркулирующего интерлейкина 1β-цитокина, который, как известно, сопутствует острому повреждению легких. Таким образом, логично заключить, что воспалительный ответ может вносить свой вклад в повреждение легких, опосредуемое альфа-токсином.

При локализованной инфекции, такой как пневмония у людей, у приблизительно 40% пациентов с пневмонией, вызванной S. aureus, развиваются инфекции кровяного русла и диссеминированное поражение. Распространение бактериальной инфекции может привести к общему заражению крови и обсеменению удаленного органа. Инфекция кровяного русла может привести к септицемии, быстро прогрессирующему и часто летальному осложнению инфекций, обусловленных S. aureus.

Распространение инфекции S.aureus также часто наблюдается у модельных животных с пневмонией, вызванной S. aureus, причем также у приблизительно 40% животных развивается диссеминированная бактериемия вследствие повреждения тканей и проникновения инфекции через слои эпителия в кровяное русло и лимфатическую ткань. Тем не менее, диссеминация во многом зависит от генетического фона используемой линии животных, а также потенциала врожденной иммунной системы, такого как активация нейтрофилов для контроля роста, например, животные линии C57B/L, характеризующейся истощением нейтрофилов, очень восприимчивы к инфицированию почек золотистьм стафилококком, в то время как иммунокомпетентные животные устойчивы к инфекциям. Напротив, животные линии А/J очень чувствительны к инфекциям, в основном вследствие задержанного поступления нейтрофилов в почки (von Kockritz-Blickwede, 2008).

Хотя данные о структуре и функции белков S.aureus стали более полными, разработка эффективной вакцины остается трудной задачей.

Была сделана попытка безопасно обеспечить иммунитет к альфа-токсину и бактериям S.aureus с использованием композиций, содержащих комбинацию антител, которые специфично связываются с антигеном - альфа-токсином S.aureus, и антител, которые специфично связываются с другим бактериальным антигеном (WO 2007/145689). Эти композиции хотя и включают количества антител, которые сами по себе не являются эффективными, нейтрализуют инфекции и/или обеспечивают защиту от инфекции в результате синергетической активности комбинации антител.

Было показано, что защитная эффективность указанной комбинации антител, нейтрализующих токсин S.aureus, и опсонических антител через 72 часа после инфицирования изолятом S.aureus выше, чем защитный эффект иммунизации только нейтрализующими или только опсоническими антителами. Комбинация опсонических и нейтрализующих токсин антител продемонстрировала защитный эффект, предотвращая инфицирование кожи и мягких тканей, а также диссеминацию органов. Тем не менее, раскрытых в заявке на патент нейтрализующих анти-альфа-токсин антител самих по себе не достаточно для предотвращения диссеминации органа/образования абсцесса или нейтрализации инфекции.

Другая попытка была сделана Heveker с соавт.(1994а, 1994b), который описывает нейтрализующие моноклональные антитела человека и мыши, направленные против альфа-токсина S.aureus. Моноклональное антитело человека подтипа IgG/лямбда охарактеризовано через последовательность и демонстрируют нейтрализацию.

Описанная Heveker (1994а) линия клеток гибридомы человека, продуцирующая антитела к альфа-токсину, была изолирована с использованием периферических лейкоцитов крови здорового добровольца, ранее иммунизированного испытательной вакциной, содержащей альфа-анатоксин S.aureus. Поскольку альфа-анатоксин, использованный в исследовании Heveker, представляет собой химически модифицированный альфа-токсин, можно предположить, что изменение действительно делает антигенные детерминанты менее иммуногенными или даже неиммуногенными. Следовательно, этот подход, как таковой, не может приводить к образованию такого же эффективного иммунитета, как это было продемонстрировано для других бактериальных токсинов, таких как токсин холеры: токсоид вакцины стимулировал образование анти-токсиновых антител, которые не вызывали развитие невосприимчивости к инфекциям (Levine(1983)).

В литературе идентифицированы различные факторы, являющиеся важнейшими факторами вирулентности для образования абсцесса, такие как токсины, пептидогликаны, внеклеточные факторы и ферменты. Предположение о возможной роли альфа-токсина в образовании абсцессов было высказано Kapral et al. (1980). Сообщалось, что альфа-токсин резко накапливается в абсцессе после его созревания, при этом не было продемонстрировано, является ли альфа-токсин необходимым для образования абсцесса. Вторая публикация, сделанная Adiam et al. (1977), отрицала ключевую роль альфа-токсина в образовании абсцесса. Авторы показали, что альфа-токсин играет ключевую роль в распространении геморрагической формы инфекционного мастита кроликов (blue-breast), наблюдаемого при естественных вспышках заболевания. Они воспроизвели в лаборатории клиническую картину, используя два штамма стафилококков, не являющихся близкими. Высокие титры циркулирующих анти-альфа-токсиновых антител привели к формированию защиты от этой летальной формы мастита. Таким образом, нейтрализующий титр антител может предотвращать летальный исход, изменяя клиническую картину в сторону состояния, характеризующегося менее тяжелыми абсцессами. Тем не менее, нейтрализация альфа-токсина не влияла / не предотвращала образование абсцесса у кроликов. В более поздней публикации Kielian et al. (2001) исследовали роль альфа-токсина в образовании абсцесса в мозге мышей. В эксперименте авторы имплантировали штамм дикого типа S. aureus и его мутанты в ткани мозга лобных долей и оценили способность каждого штамма вызывать абсцессы мозга. Авторы использовали штаммы, мутантные в локусах, связанных с экспрессией известных факторов вирулентности, например, мутанты по локусу sarA и agr, каждый из которых участвует в общей регуляции важных факторов вирулентности. Так как альфа-токсин находится под контролем регуляторной системы sarA/agr, авторы также включили в свои эксперименты штамм, мутантный по альфа-токсину. Экспериментальные данные показали, что репликация штаммов бактерий, мутантных по альфа-токсину или локусу sarA/agr, снизила вирулентность бактериальных клеток при инъецировании в череп по сравнению с изогенным контрольным штаммом RN6390, что привело в результате к снижению количества бактерий и уменьшению обнаруживаемых очагов воспаления в мозге животных по сравнению с большими, хорошо сформированными абсцессами у мышей, получавших изогенный штамм.

Тем не менее, в экспериментальной модели абсцесса мозга мутантные штаммы были не полностью авирулентны и поэтому нельзя исключить того, что помимо альфа-токсина, дополнительный фактор или факторы могут играть важную роль/роли в образовании абсцесса мозга.

Роль альфа-токсина в образовании абсцесса была оценена в других экспериментальных условиях, как это изложено Schwan et al. (2003) в анализе локальной, системной и абсцесс-формирующей инфекционной стафилококковой модели. Авторы заметили, что с течением времени негемолитические штаммы золотистого стафилококка стали более распространенными в мышиных моделях абсцесса и моделях ран, но не в тканях органов, связанных с системными инфекциями. Например, в смешанной инфекции с использованием всех вариантов штамма золотистого стафилококка RN6390 (гипергемолитический, гемолитический и негемолитический) в модели абсцесса, гипергемолитическая группа заметно снизилась на 7 день после заражения, а негемолитическая популяция значительно увеличилась. Секвенирование некоторых мутантов, полученных путем направленного мутагенеза, показало наличие мутаций в гене agrC или в межгенной области agrA-agrC, которые приводили к снижению активности как альфа-токсина, так и дельта-токсина. При анализе определенных мутантных штаммов на активность agr (agr-) или альфа-токсина (hla-) в абсцессе, ране и системной модели инфекции, agr-мутантный штамм и hla-мутантный штамм не показали каких-либо различий общего количества бактерий в абсцессах мышей на 4-й день по сравнению с исходными штаммами дикого типа (RN6390). То же справедливо для локальных инфекций (модель раны), в то время как в модели системной инфекции произошла значительная очистка hla- и agr-мутантного штамма. Результат явно указывает на важность альфа-токсина в системных инфекциях, но не в локальных инфекциях или в образовании абсцесса. Действительно, смешанные инфекции, вызванные штаммами hla-мутанта и дикого типа, показали в модели абсцесса небольшое преобладание популяции hla-мутанта над штаммом дикого типа. Далее, авторы заключили, что мутации agr вызывают снижение экспрессии альфа- и дельта-токсинов, которые, в свою очередь, способствовуют преимущественному росту этой agr-мутантной группы в смешанной популяции клеток S. aureus, присутствующей в абсцессах и ранах. Результаты явно противоречат результатам, описанным Kielian et al., где отсутствие альфа-токсина снижало бактериальную вирулентность. Поэтому роль альфа-токсина в образовании абсцесса не ясна.

В целом, отсутствуют свидетельства, указывающие на единственный фактор вирулентности как основную движущую силу в образовании абсцесса. Поэтому исследование было сосредоточено на обнаружении дополнительных факторов, которые не полностью контролируется золотистым стафилококком, таких как факторы окружающей среды или определенных структурных участков, как общих ключевых факторов в формировании абсцесса. Например, последние данные о факторах вирулентности, влияющих на формирование абсцессов, указывают на влияние несвязанных двухвалентных ионов металлов, таких как Мп2+и Са2+, в образовании абсцесса и размножении бактерий в нем. Хелатирование ионов металлов у животных ингибирует образование абсцессов в печени и подавляет размножение S. aureus в абсцессе (Corbin 2008). С другой стороны, Tzianabos et al. (2001) предположил, что для образования патологических структур, например, абсцессов в тканях, такой организм как S. Aureus нуждается в факторах вирулентности, присутствующих на поверхности бактериальной клетки. Авторы показали, что штаммы, тесно ассоциированные с клиническими случаями формирования абсцессов, могут иметь один или несколько полисахаридов, связанных с клеточной стенкой и содержащих цвиттерионные участки в молекуле (химическое соединение, общий заряд которого равен нулю, но при этом электрически нейтральная молекула несет формально положительные и отрицательные заряды на различных атомах). При отсутствии цвиттерионного участка абсцесс не формируется. Авторы пришли к выводу, что эти полисахаридные полимеры могут модулировать образование абсцесса организмом. Кроме того, они представили доказательства участия в этом процессе не только основных полисахаридов СР5 и СРВ, но и липотейхоевой кислоты (LTA), дополнительного хорошо известного фактора вирулентности, присутствующего в клеточной стенке. Они также идентифицировали цвиттерионный участок в молекуле липотейхоевой кислоты и, таким образом, расширили свою гипотезу формирования абсцесса, включив в нее наличие цвиттерионного участка в любом факторе вирулентности, являющемся ключевым при формировании абсцесса.

Основываясь на результатах, указывающих на то, что различные факторы способствуют формированию абсцесса, индуцируемому S.aureus, специалист в данной области не может ожидать, что нейтрализация только одного фактора позволит предотвратить образование абсцесса.

Таким образом, задачей изобретения является создание средств и способов для профилактики и лечения клинически сложного инфекционного заболевания, вызванного S.aureus, такого как образование абсцесса.

Соответственно, одной технической задачей, лежащей в основе настоящего изобретения, является создание моноклонального антитела, специфичного к альфа-токсину S. aureus, причем антитело обладает in vivo защитной способностью против клинически сложного инфекционного заболевания, вызванного S.aureus, такого как образование абсцесса.

Указанная техническая задача решается при помощи моноклонального антителаопределенного ниже.

Согласно настоящему изобретению предложено моноклональное антитело, обозначенное 243-4, и специфичное в отношении альфа-токсина S. aureus, причем вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1 в участке CDR1, SEQ ID NO: 2 в участке CDR2 и SEQ ID NO: 3 в участке CDR3, и вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере одну из SEQ ID NO:1 в участке CDR1, SEQ ID NO:2 в участке CDR2 и SEQ ID NO:3 в участке CDR3, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит по меньшей мере одну из SEQ ID NO:4 в участке CDR1, SEQ ID NO:5 в участке CDR2 и SEQ ID NO:6 в участке CDR3, либо фрагмент или мутеин указанного антитела, способный связывать альфа-токсин S. aureus, причем мутеин моноклонального антитела несет по меньшей мере одну консервативную замену в любом из участков CDR тяжелой или легкой цепи антитела.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации согласно настоящему изобретению предложено человеческое моноклональное антитело, специфичное для альфа-токсина S. aureus, где вариабельная область легкой цепи антитела состоит из SEQ ID NO:1 в участке CDR1, SEQ ID:2 в участке CDR2 и SEQ ID NO:3 в участке CDR3, и где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит SEQ ID NO:4 в участке CDR1, SEQ ID NO:5 в участке CDR2 и SEQ ID NO:6 в участке CDR3, либо их фрагмент или мутеин, способный связывать альфа-токсин S. aureus, где мутеин моноклонального антитела несет по меньшей мере одну консервативную замену в любом из участков CDR (гипервариабельных участков) тяжелой или легкой цепи антитела.

Неожиданно было обнаружено, что моноклональные антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют высокую способность препятствовать образованию абсцесса. Предотвращение развития абсцесса было продемонстрировано на модели с использованием почек мышей путем введения моноклонального антитела человека, специфичного к альфа-токсину, согласно настоящему изобретению. Судя по строению токсина, который является скорее секретируемым белком, а не компонентом (полисахаридом) клеточной стенки, любой прямой бактерицидный эффект, такой как уничтожение бактериальной клетки, или непрямая эффекторная функция, опосредуемая иммунной системой, например опсоно-фагоцитарное уничтожение патогена, обусловленное активацией системы комплемента, могут быть исключены и не являются причиной отсутствия образования абсцесса.

В настоящем описании термин «моноклональное антитело» включает любое моноклональное антитело человека или его часть, независимо от источника получения. Предпочтительным является полностью человеческое моноклональное антитело. Предпочтительным является получение моноклонального антитела при помощи гибридомы. Гибридома может быть гибридомой клеток млекопитающих, например мышиных, крупного рогатого скота или человека. Предпочтительной является гибридома человеческого происхождения. Для получения моноклонального антитела человека пригодны гибридомы, полученные путем осуществления слияния B-клетки человека с клеткой миеломы или гетеромиеломы.

B-клетки человека могут быть получены путем иммунизации здорового субъекта или путем отбора выздоравливающих пациентов с последующим отборам у них образцов крои, из которых могут быть выделены В-клетки. выделение B-клеток из образцов крови может быть осуществлено известными способами (см., например. Current Protocols in Immunology. Chapter 7.1. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Изд. Wiley & sons, Eds. J.C. Coligan et al.). Слияние B-клетки человека с клеткой миеломы или гетеромиеломы с получением гибридомы осуществляют в соответствии со стандартными методиками согласно классическому подходу Koler и Milstein. К пригодным клеткам миеломы относятся производные P3X63, такие как P3X63Ag8. 653 (ATCC CRL-1580) или SP2/Q (АТСС CRL-1646). Пригодные клетки гетеромиеломы включают, например, F3B6 (ATCC HB-8785). Полученные гибридомы могут быть подвергнуты отбору в соответствии с известными процедурами. Гибридомы культивируют в соответствующей культуральной среде и выделяют антитело из супернатанта.

Моноклональное антитело также может быть получено методами генной инженерии и, в частности, прививкой сегментов CDR, определенных в формуле изобретения, на доступные моноклональные антитела,

путем замены участка CDR основного антитела на сегменты специфичных CDR, как определено формуле изобретения.

Термин «участок CDR» обозначает гипервариабельный участок антитела, то есть участок, определяющий специфичность антитела к определенному антигену. Три участка CDR (CDR1-CDR3) как на легкой, так и на тяжелой цепи, отвечают за связывание антигена.

Участок CDR имеет следующую локализацию в тяжелой цепи:

Участок CDR1: аминокислоты с 26 по 33 в экзоне VH,

Участок CDR2: аминокислоты с 51 по 58 в экзоне VH,

CDR3 участок: аминокислоты с 97 до 110 в экзоне VH.

Положение участков CDR не зависит от класса антитела, то есть IgM, IgA или IgG.

Участок CDR имеет следующую локализацию в легкой цепи лямбда-типа:

Участок CDR1: аминокислоты с 26 по 33 в экзоне Vλ,

Участок CDR2: аминокислоты с 51 по 58 в экзоне Vλ,

CDR3 участок: аминокислоты с 90 до 110 в экзоне Vλ.

Сопоставление (выравнивание) аминокислотых последовательносте й экзонов VH, Vχ и Vλ может быть получено из базы данных V Base (http://imqt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/.

Термин «фрагмент» обозначает любой фрагмент антитела, способный связываться с альфа-токсином S. aureus. Фрагмент имеет длину не менее 10 аминокислот, предпочтительно 20, наиболее предпочтительно 50 аминокислот. Кроме того, предпочтительно, если фрагмент включает связывающий участок антитела. В предпочтительном случае фрагмент являлется Fab, F(ab')2, одноцепочечным или доменным антителом. Наиболее предпочтительным является фрагмент Fab, или F(ab')2, или их смесь. Фрагменты антитела могут быть гликозилированы, например содержать углеводные остатки в вариабельных областях антитела.

Соответственно, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает моноклональное антитело, как определено в настоящем описании, причем антитело представлено Fab, F(ab')2, одиночной цепью или доменным фрагментом антитела.

Термин «мутеин» включает любые мутеины моноклонального антитела, отличающиеся добавлением, удалением и/или заменой по меньшей мере одной аминокислоты. Предпочтительным вариантом реализации является наличие в мутеине моноклонального антитела по меньшей мере одной консервативной замены в любом из участков CDR тяжелой или легкой цепи антитела, как указано в формуле изобретения. Наиболее предпочтительным вариантом реализации является наличие в мутеине не более 5, не более 4, предпочтительно не более 3 и особенно предпочтительно не более 2 консервативных замен. Способность фрагмента или мутеина антитела связываться с альфа-токсином S. aureus определяют прямым иммуноферментным анализом, как это описано в разделе «Примеры»: очищенный альфа-токсин иммобилизуют на твердой фазе планшетов для ИФА. Фрагменты антитела или мутеины антител инкубируют с иммобилизованным альфа-токсином, после чего связанные антитела или их мутеины визуализируют с помощью соответствующего вторичного антитела, конъюгированного с ферментом.

Термин «консервативная замена» обозначает замену одной аминокислоты, принадлежащей к определенной физико-химической группе, на аминокислоту, принадлежащую к той же физико-химической группе. Физико-химические группы определяются следующим образом:

Физико-химическая группа неполярных аминокислот включает в себя: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин и триптофан. Группа аминокислот, имеющих незаряженные полярные боковые цепи, состоит из аспарагина, глутамина, тирозина, цистеина и цистина. Физико-химическая группа аминокислот с положительно заряженной полярной боковой цепью состоит из лизина, аргинина и гистидина. Физико-химическая группа аминокислот с отрицательно заряженной полярной боковой цепью состоит из аспарагиновой и глутаминовой кислот и их карбоксилат-анионов, называемых также аспартат и глутамат.

Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает моноклональное антитело, специфичное к альфа-токсину S. aureus, в котором вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, или фрагменты указанного антитела, способные связываться с альфа-токсином S. aureus, либо вариант указанного антитела, способный связываться с альфа-токсином S. aureus, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 85% идентична SEQ ID NO:7 и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 85% идентична SEQ ID NO:8. В настоящем описании термин «вариант» относится к полипептиду, в котором аминокислотная последовательность демонстрирует определенную степень идентичности с аминокислотной последовательностью, приведенной в перечне последовательностей.

Термин «% идентичность», известный специалистам в данной области, обозначает степень схожести между двумя или более полипептидными молекулами, которая определяется соответствием последовательностей. Процент «идентичности» вычисляется на основании процента идентичных участков в двух или более последовательностях с учетом пропусков или других особенностей последовательностей.

Процент идентичности близких полипептидов может быть определен с помощью известных методик. Как правило, используют специальные компьютерные программы с алгоритмами, учитывающими особые требования. Предпочтительные методики для определения идентичности сначала генерируют наибольшее сходство между изучаемыми последовательностями. Компьютерные программы для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются, пакет программ GCG, в том числе GAP (Devereux J et al., (1984); Genetics Computer Group, Университет Висконсина, Мэдисон (Висконсин); BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S et al., (1990)). Программа BLAST X может быть получена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и из других источников (Справочник BLAST, Altschul S et al., NCB NLM NIH Бетесда, Мэриленд, 20894; Altschul S et al., 1990). Для определения процента идентичности может быть использован хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.

Ниже представлены предпочтительные параметры для сравнения последовательностей:

Алгоритм: Needleman S.В.и Wunsch C.D.(1970),

Матрица сравнения: BLOSUM62 из Henikoff C. и Henikoff J.G. (1992),

Штраф за пропуск в последовательности: 12,

Штраф за длину пропуска в последовательности: 2.

Программа GAP также подходит для использования с указанными параметрами. Указанные выше параметры являются стандартными (параметры по умолчанию) для сравнения аминокислотных последовательностей, в которых пробелы на концах не уменьшают значение идентичности. Когда очень короткие последовательности сравнивают с базовой последовательностью, дополнительно может потребоваться увеличение значения математического ожидания до 100000, а в некоторых случаях уменьшение длины слова (размер слова) до 2.

Могут быть использованы дополнительные алгоритмы модели, штраф за создание разрыва, штраф за удлинение разрыва и матрицы сравнения, включая указанные в "Справочнике программ", пакет Висконсина, версия 9, сентябрь 1997 года. Выбор будет зависеть от сравнения, которое должно быть сделано, и в дальнейшем от того, выполняется ли сравнение между парами последовательностей, в этом случае предпочтительными являются GAP или Best Fit, или между одной последовательностью и большой базой данных по последовательностям, в этом случае предпочтительными являются FASTA и BLAST. Сходство в 85%, определенное при помощи указанных алгоритмов, описывается как 85% идентичность. То же самое применимо к более высокой степени идентичности.

В предпочтительном варианте реализации, варианты согласно настоящему изобретению имеют идентичность, равную 85% или больше, предпочтительно 90% или больше, и наиболее предпочтительно 95% и больше.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения, моноклональное антитело является антителом человека. В настоящем описании термин «человеческий» означает, что моноклональное антитело человека практически не содержит аминокислотных последовательностей чужеродных видов, в предпочтительном варианте моноклональное антитело человека (человеческое моноклональное антитело) полностью состоит только из аминокислотной последовательности человека.

Легкая цепь моноклонального антитела согласно настоящему изобретению может быть каппа- или лямбда-типа.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения легкая цепь принадлежит к лямбда-типу. Легкая цепь может быть представлена природной цепью, включая природные перестройки, генетически модифицированной или синтетической легкой цепью.

Тяжелая цепь моноклонального антитела согласно настоящему изобретению может быть выбрана из изотипов IgM, IgA, или IgG, предпочтительно IgG.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации изобретения тяжелая цепь моноклонального антитела принадлежит IgG.

В настоящем описании термин «способный связываться» относится к связыванию, которое происходит между антителом и распознанным антигеном, к которому направлено данное антитело. Этот тип связывания является специфичным, в отличие от неспецифично, которое происходит в отсутствие антигена.

Антитела, способные связываться с альфа-токсином, получают с использованием гибридомной технологии, в которой В-клетки представляют собой В-клетки млекопитающих, например, мыши, крупного рогатого скота или человека. Предпочтительным вариантом В-клеток являются В-клетки человека. Помимо этого, моноклональное антитело, способное связываться с альфа-токсином, может быть получено путем CDR-пересадки участков CDR, как указано в формуле изобретения, на доступные моноклональные антитела, с получением моноклонального антитела, специфичного в отношении альфа-токсина S. aureus согласно настоящему изобретению.

Согласно следующему варианту реализации в изобретении предложено моноклональное антитело, способное связываться с альфа-токсином S. aureus, которое может быть получено из В-клеток млекопитающих, например мышей, крупного рогатого скота или человека, предпочтительным вариантом являются человеческие В-клетки или гибридомы, полученные путем слияния указанных В-клеток человека с клетками миеломы или гетеромиеломы.

Согласно следующему варианту реализации изобретения предложена гибридома, способная продуцировать моноклональные антитела, связывающиеся с альфа-токсином S. aureus, определенным в настоящей заявке.

В настоящем описании термин "альфа-токсин» относится к бактериальному белку, вырабатываемому S. aureus. После связывания с поверхностью клетки-хозяина альфа-токсин подвергается олигомеризации до гептамера. Образование поры является основной причиной апоптоза и лизиса клеток. Для потенциальной защиты от патогена фундаментальное значение имеет способность моноклонального антитела связываться как с мономерной, так и с олигомерной формой альфа-токсина, продуцируемого S. aureus.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации изобретения моноклональное антитело согласно настоящему изобретению способно специфично связывать мономерные и олигомерные формы альфа-токсина S. aureus. В соответствии с другим вариантом реализации моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент или мутеин способны специфично связываться как с мономерной, так и олигомерной формой альфа-токсина S. aureus или с обеими формами.

В настоящем описании термин «олигомерные формы» включает форму, отличную от мономерной формы альфа-токсина, такую как димерная, тримерная, тетрамерная, пентамерная, гаксамерная, гептамерная и т.д., или полимерные формы, такие как гептамерная форма альфа-токсина, предшествующая формированию поры.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации моноклональное антитело согласно настоящему изобретению модифицировано по N-концу, внутренней области или С-концу. Модификации включают ди-, олиго- или полимеризацию мономерной формы, например путем поперечногосшивания с использованием дициклогексилкарбодиимида. Полученные таким образом ди-, олиго-, или полимеры могут быть разделены гель-фильтрацией. Дальнейшие модификации включают модификации боковой цепи, например изменения остатков е-амино-лизина или амино- и карбокси-концевые модификации, соответственно. Дальнейшие модификации включают посттрансляционные модификации, например гликозилирование и/или частичное или полное дегликозилирование белков и образование дисульфидных связей. Антитела могут также быть конъюгированы с меткой, такой как ферментная, люминесцентная или радиоактивная метки. Предпочтительный ва