Слитные белки иммуноглобулинов

Слитные белки иммуноглобулинов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к гибридному Fc человека и слитному белку иммуноглобулина, в котором гибридный Fc человека соединен с биологически активной молекулой. В частности, оно относится к гибридному Fc человека, который получен из сочетаний субклассов иммуноглобулина G человека (IgG) или комбинаций IgD и IgG человека, и слитного белка, в котором такой Fc соединен с биологически активной молекулой через ковалентную связь.

Предпосылки изобретения

Биологически активные молекулы могут обладать большим терапевтическим интересом. Однако в качестве терапевтического средства они могут обладать недостатками, так как низка их стабильность in vivo. Их период полураспада в циркуляции или период полураспада в сыворотке короток, так как в живом организме они расщепляются различными ферментами. Поэтому было бы желательно усовершенствовать период полураспада в циркуляции биологически активных молекул.

Было известно, что увеличение размера белка может увеличить его период полураспада, препятствуя удалению белка почками (Knauf et al., J. Biol. Chem. 1988. 263:15064-15070). Например, сообщалось об увеличении стабильности белка за счет присоединения активного белка к альбумину человека (Kinstler et al., Pharm. Res. 1995. 12:1883-1888). Однако, так как присоединение активного белка к альбумину человека лишь слегка увеличивает его время удержания, это не являлось эффективным способом для разработки эффективного фармацевтического состава, содержащего активный белок, который соединен с альбумином человека.

Другой способ, о котором сообщалось, состоит в модулировании гликозилирования белка. Дополнительное гликозилирование белка и введение сиаловых кислот в белки приводит к предотвращению деградации белков в печени. Но увеличение гликозилирования белков также ведет к снижению биологической активности белков.

Чтобы стабилизировать белки и предотвратить клиренс почками, белки конъюгировали с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Ковалентное конъюгирование с ПЭГ широко использовалось для доставки лекарственного средства с пролонгированным периодом полураспада (Delgado et al., 1992. 9:249-304). Однако сообщалось, что конъюгирование ПЭГ с цитокинами или гормонами приводит к снижению аффинности связывания с рецептором из-за стерических препятствий, вызванных конъюгированием.

В последнее время исследовались и разрабатывались слитные белки, производимые с использованием иммуноглобулина (Ig). Ig является важным компонентом крови. Ig человека (hIg) содержит различные классы, такие как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE (Roitt et al., «Immunology» 1989, Gower Medical Publishing, London, U. K.; New York, N. Y.). IgG человека могут быть дополнительно разделены на разные субтипы, известные как IgG1 человека (hIgG1), IgG2 человека (hIgG2), IgG3 человека (hIgG3) и IgG4 человека (hIgG4).

Иммуноглобулины состоят из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых цепей и двух легких цепей, которые связаны через дисульфидные связи и образуют тетрамеры. Каждая цепь состоит из вариабельной области и константной области. Константная область тяжелой цепи дополнительно разделена на три или четыре области (CH1, CH2, CH3 и CH4), в зависимости от изотипа. Часть Fc константной области тяжелой цепи, в зависимости от изотипа Ig, содержит шарнир, домены CH2, CH3 и/или CH4.

Относительно периода полураспада в сыворотке, IgG1, IgG2 и IgG4 обладают длительными периодами полураспада, равными 21 дню, тогда как другие иммуноглобулины обладают относительно короткими периодами полураспада, которые составляют менее чем неделю. Химерные белки, слитые с участком Fc из IgG, показывают увеличенную стабильность и увеличенный период полураспада в сыворотке (Capon et al., Nature 1989. 337:525-531). Биологически активные белки были слиты на N-конце области CH1, N-конце области Fc или на C-конце области CH3 из IgG.

В начальный период слитные белки IgG создавали с внеклеточными доменами рецепторов с поверхности клетки, таких как CD4 (Capon et al., Nature 1989. 337:525-531), TNFR (Vbhler et al., J. Immunology 1993. 151:1548-1561), CTLA4 (Linsley et al., J. Exp. Med. 1991, 173:721-730), CD86 (Morton et al., J. Immunology 1996. 156:1047-1054). Также имеют место некоторые цитокины и гормоны роста, которые были слиты с доменами IgG. Однако, в отличие от слияния с внеклеточными доменами рецепторов с поверхности клетки, слияние растворимых белков с иммуноглобулинами G приводит к снижению биологических активностей, по сравнению с неслитыми цитокинами или факторами роста. Химерные белки существуют в виде димеров, что ведет к стерическим препятствиям для взаимодействия с их молекулами-мишенями, такими как рецепторы, из-за присутствия двух активных белков в тесной близости друг к другу. Поэтому можно преодолеть эту проблему создания эффективного слитного белка.

Другое ограничение технологии слияния Fc состоит в наличии нежелательных иммунных ответов. Домен Fc иммуноглобулина также обладает эффекторными функциями, такими как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC). Эти эффекторные функции, как правило, выполняются через взаимодействие Fc-области Ig и FcR на эффекторных клетках или через связывание комплемента. Поэтому блокирование эффекторных функций Fc должно быть выполнено для снижения нежелательных реакций, таких как цитолиз клеток, высвобождение цитокинов или воспаление.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Таким образом, существует необходимость в улучшенных Fc слитных белках с минимальной потерей биологической активности и с меньшим риском нежелательных иммунных ответов.

Техническое решение

Настоящее изобретение относится к гибридному Fc, который выведен из комбинаций субклассов IgG человека или комбинаций IgD и IgG человека. Гибридный Fc эффективен, когда соединен с биологически активной молекулой для увеличения периода полураспада биологически активной молекулы в сыворотке, а также увеличения уровня экспрессии полипептида, когда экспрессируется нуклеотид, кодирующий слитный белок Fc-полипептид.

Настоящее изобретение также относится к гибридному Fc слитному полипептиду, в котором гибридный Fc соединен с биологически активной молекулой. Слитный белок иногда обозначается как «биологически активная молекула-Fc слитный белок» или просто «слитный белок». Слитный белок может содержать линкер между Fc и биологически активной молекулой. Fc может быть соединен своим N-концом с C-концом биологически активной молекулы.

Слитный белок может быть синтезирован посредством изготовления нуклеотидной конструкции, кодирующей и способной экспрессировать слитный белок, экспрессии его в клетке-хозяине и сбора слитного белка. Альтернативно, слитный белок может быть синтезирован посредством экспрессии нуклеотида, кодирующего Fc, и соединения его с биологически активной молекулой традиционным способом.

Полипептид согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения может быть представлен следующей формулой:

N'-(Z1)_P-Y-Z2-Z3-Z4-C'

где N' представляет собой N-конец и C' представляет собой C-конец полипептида;

Z1 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:14;

Y обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 99 до 162 из SEQ ID NO:14;

Z2 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 111 до 147 из SEQ ID NO:12 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14;

Z3 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24 или с 115 до 220 из SEQ ID NO:13;

Z4 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11, 220-326 из SEQ ID NO:12, 271-377 из SEQ ID NO:24 или 221-327 из SEQ ID NO:13 и

p представляет собой целое число, равное 0 или 1,

где общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 составляет от 80 до 140, включая оба предела.

Z1 может быть аминокислотной последовательностью, включающей от 5 до 9 последовательных аминокислотных остатков с C-концевой стороны аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:11, или 5-9 последовательных аминокислотных остатков с C-концевой стороны аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления Z1 может представлять собой 5, 6, 7, 8 или 9 C-концевых аминокислотных остатков из домена CH1 IgG1 (SEQ ID NO:11) или домена CH1 IgD (SEQ ID NO:14).

В другом варианте осуществления Z1 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из 5-9 аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 также может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.

Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей 5 или более, или 10 или более последовательных аминокислотных остатков из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11 или 5 или более, или 10 или более последовательных аминокислотных остатков из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14. В определенных вариантах осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11, аминокислотные остатки в положениях с 158 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях с 153 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях с 143 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях с 133 до 162 из SEQ ID NO:14, или аминокислотные остатки в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14.

Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей от 4 до 37, или 6-30 последовательных аминокислотных остатков из N-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 111 до 147 из SEQ ID NO:12(hIgG2) или с 4 до 37, или 6-30 последовательных аминокислотных остатков из N-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14 (hlgD). В определенных вариантах осуществления Z2 может представлять собой 6 N-концевых аминокислотных остатков из домена CH2 IgG2 человека или 8 N-концевых аминокислотных остатков из домена CH2 IgD человека.

Общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может быть между 80 и 140. В варианте осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет между 90 и 120, включая оба предела. В другом варианте осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет между 105 и 115, включая оба предела. В одном из вариантов осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет 108. В еще одном варианте осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет 109.

Z4 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей 90 или более, или 100 или более последовательных аминокислотных остатков в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11 (hIgG1), 220-326 из SEQ ID NO:12 (hIgG2), 271-377 из SEQ ID NO:24 (hIgG3) или от 221 до 327 из SEQ ID NO:13 (hIgG4). Z4 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11, 220-326 из SEQ ID NO:12, 271-377 из SEQ ID NO:24 или с 221 до 327 из SEQ ID NO:13.

Согласно варианту осуществления, Z3-Z4 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 118 до 223 из SEQ ID NO:11 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 224 до 330 из SEQ ID NO:11, (ii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 114 до 219 из SEQ ID NO:12 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 220 до 326 из SEQ ID NO:12, (iii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 165 до 270 из SEQ ID NO:24 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 271 до 377 из SEQ ID NO:24, и (iv) непрерывной аминокислотной последовательности из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 115 до 220 из SEQ ID NO:13 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 221 до 327 из SEQ ID NO:13.

Общее количество аминокислотных остатков полипептида согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения составляет от 154 до 288.

В одном из вариантов осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 99-113 из SEQ ID NO:11, p может быть равен 1 или 0, Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 111-147 из SEQ ID NO:12, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24 или со 115 до 220 из SEQ ID NO:13. В этом варианте осуществления, когда p равно 1, Z1 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11.

В дополнительных вариантах осуществления Z3 может быть равен от 73 до 106 последовательных аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24 или 115-220 из SEQ ID NO:13, и общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может составлять 110. Z2 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 111-116 из SEQ ID NO:12, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 120-223 из SEQ ID NO:11, 116-219 из SEQ ID NO:12, 167-270 из SEQ ID NO:24 или с 118 до 220 из SEQ ID NO:13.

В другом варианте осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14, p может быть равно 1 или 0 (нулю), Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 121 до 220 из SEQ ID NO:13. В этом варианте осуществления, когда p равно 1, Z1 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.

В дополнительных вариантах осуществления Y может представлять собой 20 последовательных аминокислотных остатков или более, 30 последовательных аминокислотных остатков или более, 40 последовательных аминокислотных остатков или более, 50 последовательных аминокислотных остатков или более или 60 последовательных аминокислотных остатков или более из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях 99-162 из SEQ ID NO:14. Z2 может представлять собой аминокислотные остатки в положениях с 163 до 170 из SEQ ID NO:14, Z3 может содержать от 71 до 100 последовательных аминокислотных остатков из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях 124-223 из SEQ ID NO:11, 120-219 из SEQ ID NO:12, 171-270 из SEQ ID NO:24 или 121-220 из SEQ ID NO:13. Общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 может составлять 108.

В одном из вариантов осуществления полипептид может кодироваться нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27. Полипептид представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29.

В варианте осуществления полипептид слит своим N-концом с биологически активной молекулой, которая проявляет увеличенный период полураспада в циркуляции по сравнению с периодом полураспада в циркуляции нативной формы указанной биологически активной молекулы. Биологически активная молекула может представлять собой полипептид, белок или apeptide. Биологически активная молекула может представлять собой полипептид, пептид или белковое лекарственное средство. Биологически активная молекула может являться растворимым белком, таким как, но без ограничений, гормон, цитокин, фактор роста, ко-стимулирующая молекула, рецептор гормона, рецептор цитокина, рецептор фактора роста или короткий пептид. Биологически активная молекула может представлять собой эритропоэтин или его варианты/фрагменты, p40 или его варианты/фрагменты (например, вариант p40, который содержит замену Asn303Gln), G-CSF или его варианты/фрагменты, Рецептор TNF, GMCSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, рецептор IL-10, TGF-β, рецептор TGF-β, IL-17, рецептор IL-17, фактор VII, CXCL-11, FSH, гормон роста человека, морфогенетический белок кости-1 (BMP-1), CTLA4, PD-1, GLP-1, бетацеллюлин, OPG, RNAK, интерферон α, интерферон β или их варианты/фрагменты. Биологически активная молекула может представлять собой секретируемый белок, который может присутствовать в зрелой форме.

В одном из вариантов осуществления предоставлен способ синтеза полипептида по п.1, где способ включает в себя стадии: (i) введение молекулы ДНК, кодирующей полипептид, в клетку-хозяин млекопитающего, (ii) выращивание клетки в условиях, в которых полипептид может быть экспрессирован в ее среду для выращивания; и (iii) сбор экспрессированного полипептида. Клетка-хозяин млекопитающего может представлять собой клетки CHO, COS или BHK.

В другом варианте осуществления предоставлен способ (i) снижения симптомов, предотвращения или лечения аутоиммунного заболевания, (ii) подавления отторжения имплантата, или (iii) предотвращения и лечения эндотоксин-индуцированного шока, включая введение терапевтически эффективного количества полипептида, описанного выше, где полипептид слит с биологически активной молекулой.

В одном из вариантов осуществления предоставлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Полипептид может обладать аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29. Молекула нуклеиновой кислоты может обладать нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:27. Молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать сигнальную последовательность или лидерную последовательность.

Согласно варианту осуществления изобретения, предоставлен экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты и клетку-хозяин, содержащую вектор. Примеры экспрессирующего вектора могут включать, без ограничений, pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1, pAD11 p40N303Q-hFc-1, pAD11 EPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-5 и pAD11 TNFR-hFc-5.

В одном из вариантов осуществления предоставлен способ доставки биологически активной молекулы в млекопитающее, включающий стадию введения молекулы нуклеиновой кислоты млекопитающему по его необходимости.

В другом варианте осуществления полипептид содержит домен Fc, который состоит из шарнирной области, домена CH2 и домена CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где указанная шарнирная область содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков шарнирной области из IgD человека или шарнирной области из IgG1 человека; указанный домен CH2 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков из домена CH2 IgG4 человека, где 4-37 последовательных аминокислотных остатков на N-конце домена CH2 IgG4 человека замещены, по меньшей мере, участком аминокислотных остатков из N-концевой области домена CH2 IgG2 человека или N-концевой области домена CH2 IgD человека, и указанный домен CH3 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH3 IgG4 человека.

Шарнирная область может содержать, по меньшей мере, участок из аминокислотных остатков шарнирной области IgG1 человека, указанный домен CH2 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH2 IgG4 человека, где 4-37 аминокислотных остатков на N-конце домена CH2 IgG4 человека замещены, по меньшей мере, участком аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgG2 человека.

Шарнирная область может содержать, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков шарнирной области IgD человека, указанный домен CH2 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH2 IgG4 человека, где 4-37 аминокислотных остатков на N-конце домена CH2 IgG4 человека замещены, по меньшей мере, участком аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgD человека.

Полипептид может дополнительно содержать домен CH1, где указанный домен CH1 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH1 IgG1 человека, и где указанный домен CH1 соединен с N-концом указанной шарнирной области. Полипептид может дополнительно содержать домен CH1, где указанный домен CH1 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH1 IgD человека, и где указанный домен CH1 соединен с N-концом указанной шарнирной области. Полипептид может дополнительно содержать второй полипептид, соединенный с N-концом указанной шарнирной области, где второй полипептид является биологически активным неиммуноглобулиновым полипептидом. Полипептид может дополнительно содержать биологически активную молекулу, соединенную с N-концом указанного домена CH1 или с C-концом указанного домена CH4 через линкер, где указанная биологически активная молекула не является иммуноглобулиновым полипептидом. Полипептид и биологически активная молекула могут быть соединены друг с другом через линкер. Линкерная молекула представляет собой альбуминовый линкер или синтетический линкер. Альбуминовый линкер содержит аминокислотную последовательность с 321 до 323, с 318 до 325, с 316 до 328, с 313 до 330, с 311 до 333 или с 306 до 338 из SEQ ID NO:25. Синтетический линкер может представлять собой пептид от 10 до 20 аминокислотных остатков, состоящий из остатков Gly и Ser. В одном из вариантов осуществления такой Gly-Ser линкер представляет собой GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO:32).

Настоящее изобретение также охватывает молекулу антитела, содержащую рекомбинантную Fc-область, рекомбинантная Fc-область описана выше.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает схематически рисунок гибридного Fc (hFc), который можно использовать в качестве носителя белка для биологически активных молекул, обозначенный как «X».

Фиг.2 показывает схематические представления hFc с последующим подробным описанием аминокислотных положений, полученных из IgG1 (SEQ ID NO:11), IgG2 (SEQ ID NO:12), IgG4 (SEQ ID NO:13) и IgD (SEQ ID NO:14). Такое же правило применяется для обозначения аминокислотных положений в полипептиде на всем протяжении заявки, если не указано иначе.

Фиг.3 показывает схематическое представление hFc, каждый из которых конъюгирован с биологически активными молекулами, обозначенными «X» на C-конце через пептид альбуминового линкера, обозначенного как «AL».

Фиг.4 показывает схематические представления hFc, конъюгированных с линкерами с последующим подробным описанием аминокислотных положений альбуминовых линкеров, полученных из альбумина человека (SEQ ID NO:25).

Фиг.5 показывает результаты графика гидрофобности для hFc-6.

Фиг.6(a) показывает результаты активностей связывания FcγRI c MabThera® (ритуксимаб), hIgG1, Энбрелом® (этанерцепт), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5 с использованием специфичного теста ELISA; Фиг.6(b) показывает результаты активностей связывания C1q с MabThera® (ритуксимаб), hIgG1, Энбрелом® (этанерцепт), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5 с использованием специфичного теста ELISA.

Фиг.7(a) показывает результаты биоактивностей EPO-IgG1 Fc, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5, EPO-hFc-6 и Aranesp® (дарбэпоэтин альфа), по сравнению с биоактивностью EPO в человеческой клеточной линии F36E; фиг.7(b) показывает результаты биоактивностей Нейласты® (пегфилграстим) и G-CSF-hFc-5 в мышиной гематопоэтической клеточной линии (NFS-60) in vitro; фиг.7(c) показывает результаты биоактивностей p40 и p40N303Q-hFc-5 в человеческих PBMC in vitro. Фиг.7(d) показывает результаты биоактивностей Энбрела® (этанерцепт) и TNFR-hFc-5 в мышиных клетках L929 in vitro; и фиг.7(e) показывает результаты биоактивностей thFc-1-AL(0)-IFN-β и thFc-1-AL(3)-IFN-β в человеческих клетках WISH in vitro.

Фиг.8(a) показывает результаты периода полураспада Aranesp® (дарбэпоэтин альфа), EPO-hFc-1 или EPO-hFc-5 in vivo, введенных обезьянам рода Cynomolgus через подкожный путь (левый график) и через внутривенный путь (правый график). Фиг.8(b) показывает результаты фармакокинетики Лейкостима® (филграстим) и G-CSF-hFc-1, введенных крысам Sprague Dawley через подкожный путь (левый график) и через внутривенный путь (правый график); фиг.8(c) показывает результаты фармакокинетики p40N303Q-hFc-5 и Энбрела® (этанерцепт), введенных обезьянам рода Cynomolgus через подкожный путь: фиг.8(d) показывает результаты фармакокинетики TNFR-hFc-5 и Энбрела® (этанерцепт), введенных крысам Sprague Dawley через подкожный путь.

Фиг.9(a) показывает результаты биоактивностей Aranesp® (дарбэпоэтин альфа) и EPO-hFc-5 in vivo, введенных обезьянам рода Cynomolgus через подкожный путь (верхний левый график) и через внутривенный путь (нижний правый график) и фиг.9(b) показывает результаты биоактивностей Лейкостима® (филграстим) и G-CSF-hFc-1 in vivo, введенных крысам Sprague Dawley через подкожный путь (нижний график) и через внутривенный путь (верхний).

Лучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к гибридному Fc фрагменту иммуноглобулина человека, который содержит шарнирную область, домен CH2 и домен CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где шарнирная область представляет собой, по меньшей мере, частичную аминокислотную последовательность шарнирной области IgD человека или шарнирной области IgG1 человека; и домен CH2 представляет собой домен CH2 IgG4 человека, участок которого, в его N-концевой области, заменен на 4-37 аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgG2 человека или домена CH2 IgD человека. Такой гибридный Fc фрагмент, при соединении с биологически активной молекулой, такой как биологически активный полипептид биологически активной молекулы, для создания Fc слитного белка, сводит к минимуму неспецифические иммунные реакции Fc слитного белка, удлиняет период полураспада в сыворотке биологически активного полипептида биологически активной молекулы и оптимизирует активность биологически активного полипептида биологически активной молекулы.

В Fc слитном белке согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения сочетание N-конца домена CH2 IgD с оставшимся участком домена CH2 IgG4 было разработано так, чтобы область полученного слитного белка, представляющая собой две различные рекомбинированные субъединицы Ig, была гидрофобной. Гидрофобная область полученного слитого белка будет расположена внутри уложенного белка, минимизируя нежелательную неспецифическую иммунную реакцию.

Термин «Fc фрагмент» или «Fc», как применяют в настоящем документе, относится к белку, который содержит константную область 1 (CH1) тяжелой цепи, константную область 2 (CH2) тяжелой цепи и константную область 3 (CH3) тяжелой цепи иммуноглобулина, и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, и константную область 1 (CL1) легкой цепи иммуноглобулина. Он может дополнительно содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Гибридный Fc или гибридный Fc фрагмент иногда обозначается в настоящем документе как «hFc».

Кроме того, Fc фрагмент по настоящему изобретению может находиться в форме, обладающей природными цепочками сахаров, увеличенными цепочками сахаров по сравнению с природной формой или уменьшенными цепочками сахаров по сравнению с природной формой, или может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление цепочек сахаров Fc иммуноглобулина может быть достигнуто способами, распространенными в данной области, такими как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизма. Удаление цепочек сахаров с Fc фрагмента приводит к резкому снижению аффинности связывания с частью C1q первого компонента комплемента C1 и уменьшению или потере антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), таким образом, не вызывая излишних иммунных ответов in vivo. В этом отношении Fc фрагмент иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме в некоторых случаях может быть более пригодным для цели настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.

Как применяют в настоящем документе, термин «дегликозилирование» относится к тем остаткам сахаров, которые ферментативно удаляются с Fc фрагмента, и термин «агликозилирование» обозначает, что Fc фрагмент синтезирован в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно E. coli.

Термин «гибрид», как применяют в настоящем документе, обозначает, что последовательности, кодирующие два или более Fc фрагментов иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в единой цепи Fc фрагмента иммуноглобулина.

В варианте осуществления гибридный Fc человека содержит шарнирную область, домен CH2 и домен CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где шарнирная область представляет собой, по меньшей мере, частичную аминокислотную последовательность шарнирной области IgD человека или шарнирной области IgG1 человека; и домен CH2 - домена CH2 IgG4 человека, участок которого, в его N-концевой части, замещен на 4-37 аминокислотных остатков N-концевой части домена CH2 IgG2 человека или домена CH2 IgD человека. Гибридный Fc человека может быть присоединен своим N-концом к C-концу биологически активной молекулы через ковалентную связь.

В другом варианте осуществления слитный полипептид из биологически активной молекулы и гибридного Fc может быть представлен следующей формулой:

N'-X-(Z1)_p-Y-Z2-Z3-Z4-C', или

N'-(Z1)_p-Y-Z2-Z3-Z4-(линкер)_q-X-C',

где N' представляет собой N-конец и C представляет собой C-конец полипептида; Z1 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:14; Y обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14; Z2 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, an N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 111 до 147 из SEQ ID NO:12 или, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14; Z3 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24, или со 115 до 220 из SEQ ID NO:13; Z4 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 221-327 из SEQ ID NO:13, и каждый из p и q представляют собой целое число, равное 0 или 1, где общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 составляет между 80 и 140, включая оба предела, линкер представляет собой линкерную молекулу, и X представляет интересующую биологически активную молекулу.

В одном из вариантов осуществления Z3-Z4 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 118 до 223 из SEQ ID NO:11 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 224 до 330 из SEQ ID NO:11, (ii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 114 до 219 из SEQ ID NO:12 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 220 до 326 из SEQ ID NO:12, (iii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 165 до 270 из SEQ ID NO:24 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 271 до 377 из SEQ ID NO:24, и (iv) непрерывной аминокислотной последовательности C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 115 до 220 из SEQ ID NO:13 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 221 до 327 из SEQ ID NO:13.

Общее количество аминокислотных остатков полипептида согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения составляет от 154 до 288.

Полипептиды с формулой N'-X-(Z1)_P-Y-Z2-Z3-Z4-C' и N'-(Z1)_P -Y-Z2-Z3-Z4-(линкер)_q-X-C' увеличивают период полураспада в циркуляции биологически активной молекулы X по сравнению с периодом полураспада в циркуляции одиночной Х при введении субъекту.

Линкер может быть получен из альбумина человека (CAA00606 SEQ ID NO:25). Линкер может содержать аминокислотную последовательность с 321 до 323, с 318 до 325, с 316 до 328, с 313 до 330, с 311 до 333 или с 306 до 338 из SEQ ID NO:25. Альтернативно, линкер может представлять собой синтетический линкер. Синтетический линкер может представлять собой пептид, состоящий всего из 10-20 остатков Gly и Ser. В одном из вариантов осуществления Gly-Ser линкер представляет собой GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO:32).

Z1 может содержать, по меньшей мере, участок домена CH1 IgG1 (SEQ ID NO:11) или IgD (SEQ ID NO:14) человека. Z1 может содержать от 5 до 9 или от 7 до 9 последовательных аминокислотных остатков C-концевой области домена CH1 IgG1 (положения 90-98 из SEQ ID NO:11) или C-концевой области домена CH1 IgD (положения 90-98 из SEQ ID NO:14). В некоторых вариантах осуществления Z1 может представлять собой 5, 6, 7, 8 или 9 C-концевых аминокислотных остатков домена CH1 IgG1 или домена CH1 IgD.

В некоторых вариантах осуществления Z1 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из от 5 до 9 аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 также может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.

Y может содержать, по меньшей мере, участок шарнирной области IgG1 или IgD человека. Y может содержать 5 или более или 10 или более последовательных аминокислотных остатков C-конца шарнирной области IgG1 (аминокислотные положения с 99 до 113 из SEQ ID NO:11) или шарнирной области IgD (аминокислотные положения 99 до 162 из SEQ ID NO:14). В определенных вариантах осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11, аминокислотные остатки в положениях со 158 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях со 153 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях со 143 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях со 133 до 162 из SEQ ID NO:14 или аминокислотные остатки в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14.

Z2 может содержать от 4 до 37, от 6 до 30, от 6 до 12, от 6 до 8, 8 или 6 последовательных аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgG2 человека (аминокислотные остатки в положениях со 111 до 147 из SEQ ID NO:12) или N-концевой области домена CH2 IgD (аминокислотные остатки в положениях со 163 до 199 из SEQ ID NO:14). В определенных вариантах осуществления Z2 может представлять собой 6 N-концевых аминокислотных остатков домена CH2 IgG2 человека (аминокислотные остатки 111-116 из SEQ ID NO:12) или 8 N-концевых аминокислотных остатков домена CH2 IgD человека (аминокислотные остатки 163-170 из SEQ ID NO:14).

Общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может составлять между 90 и 120, включая оба предела, или 105 и 115, включая оба предела.

Z4 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей 90 или более или 100 или более последовательных аминокислотных остатков домена CH3 IgG4 (аминокислотные остатки в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11, 220-326 из SEQ ID NO:12, 271-377 из SEQ ID NO:24, или с 221 до 327 из SEQ ID NO:13). Z4 может состоять из более чем 98% аминокислотных остатков или 95% аминокислотных остатков домена CH3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В одном образцовом варианте осуществления Z4 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую полную аминокислотную последова