Способ моделирования бактериальной инфекции на фоне ожоговой травмы

Способ моделирования бактериальной инфекции на фоне ожоговой травмы

Реферат

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения патогенеза инфекционного процесса на фоне ожоговой травмы с целью разработки эффективных лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий, направленных на ограничение циркуляции возбудителей инфекционных заболеваний в лечебно-профилактических учреждениях.

Установлено, что при бактериальной инфекции, вызванной культивируемыми бактериями, частота летальных исходов ожоговой болезни зависит от площади пораженной поверхности, так при ожогах площадью до 20% летальность составляет 12%, а при ожогах площадью более 40%-56,6% случаев [Сахаров С.П. Летальные исходы ожоговой болезни у детей / С.П. Сахаров, В.В. Иванов, Н.П. Шень Н.П. и др. // Скорая медицинская помощь. - 2011. - №3. - С 52-57]. Известно, что 80% всех инфекционных заболеваний вызывают микробы, образующие биопленки. Биопленки обеспечивают длительное сохранение бактерий в организме, а под влиянием различных факторов бактерии в макроорганизме могут освобождаться от биопленок и вызывать генерализованный инфекционный процесс. В биопленках бактерии не чувствительны к различным химиотерапевтическим препаратам, могут длительно сохраняться в организме, вызывая латентное или хроническое течение инфекционного заболевания. В различных стадиях инфекционного процесса бактерии вне биопленок более чувствительны к химиотерапевтическим и антибактериальным препаратам и поэтому имеется возможность инактивировать инфекционный агент с помощью известных химиотерапевтических препаратов. Так, Рейд Дэйвид [Патент RU 2478385 от 21.05.2008] разработал способ лечения хронического заболевания - муковисцидоз, вызываемого Pseudomonas aeruginosa, при использовании препаратов, препятствующих образованию биопленок бактериями P. aeruginosa с последующим применением антибиотиков.

Биопленки образуют бактерии семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Enterococcus spp., Actinomyces spp., Pseudomonas spp., Haemophilus spp.[Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека. Инфекции в хирургии. 2004; т.2. - №3. - С.16-19]. Установлено, что среди возбудителей инфекционных заболеваний, вызывающих образование биопленки, наибольшее клиническое значение имеют P. aeruginosa, S. aureus и К. pneumoniae, вызывающие прогредиентное течение инфекционных заболеваний [Воробєй С.С, Воронкова О.С, Вiннiков А.I. Бактерiальнi бiоплiвки. Quorum sensing - «Вiдчуття кворуму» у бактерiй в бioплiвках // Вiсник Днiпропетровського унiверситету. Бiологiя. Екологiя. - 2012. - Вип.20, т.1. - С.13-22].

Поэтому в ряде случаев возникает проблема перевода латентных и хронических бактериальных инфекции в острый инфекционный процесс для разработки эффективных препаратов, предназначенных для этиотропного лечения инфекционных заболеваний.

При ожоговой травме нарушается целостность кожных покровов и слизистых оболочек и происходит микробное обсеменение ожоговой поверхности микрофлорой воздуха и микробами, выделяемыми от бактерионосителей. Известно, что отделяемое ожоговой раны является идеальной средой для роста и размножения многих микроорганизмов (Pruitt В.А., 1992, Bayona О.Е., 2001, Wiechman S.A., 2004). На ожоговую поверхность возбудители инфекционных заболеваний могут проникать воздушно-капельным и контактным механизмами передачи. Питательная среда ожоговой раны обеспечивает накопление в ране бактерий, в том числе и биопленкообразующих, в частности P. aeruginosa, концентрация данного микроорганизма на поверхности ожоговой раны достигает 10⁵-10⁷ степени. Наличие церебральных поражений при ожоговой травме свидетельствует о возможном течении инфекционного процесса в головном мозгу. Одним из осложнений ожоговой травмы является гнойный менингит. Патология центральной нервной системы выявлена у 33,7% инвалидов после ожоговой травмы [Хрулев С.Е. Ожоговая травма с церебральными осложнениями у взрослых и детей (клиника, механизмы развития, профилактика). Автореф. Дис. докт. мед. наук. - Нижний Новгород, 2009. - 30 с.]. Освобожденные бактерии от биопленок становятся чувствительными к антибактериальным и химиотерапевтическим препаратам. Поэтому разработка способов предупреждения образования биопленок и их разрушение в микробных популяциях является актуальным в плане разработки эффективных этиотропных и патогенетических препаратов для лечения ожоговой болезни.

Способы моделирования экспериментальной инфекции описаны во многих патентах и в качестве инфицирующего агента авторы используют бактерии, образующие биопленки. Однако при моделировании генерализованного инфекционного процесса авторы не учитывают влияние на инфекционный процесс бактерий, находящихся в биопленках. С поверхности биопленок выделяется планктонная фракция бактерий, вызывая острый инфекционный процесс. Бактерии, находясь в биопленках, могут вызывать латентную и хроническую инфекции в восприимчивом организме, поэтому необходимо предусмотреть дополнительные способы, позволяющие уничтожить бактерии внутри биопленок.

В патенте «Способ моделирования бактериального кератита» [Патент RU 2480845, опубл. 27.04.2013] в качестве инфицирующего агента для развития инфекционного процесса использована суспензия штамма Staphylococcus aureus, образующего биопленку, а способы, предупреждающие образование биопленок, не указаны. Следовательно, не исключена возможность латентного и хронического течения заболевания.

Предложены способы воспроизведения экспериментальных инфекций, максимально приближенных к реальному клиническому течению инфекционного процесса [Патент RU 2431890, опубл. 20.10.2011; Патент RU 2363055, опубл. 27.07.2009], в которых в качестве инфицирующих агентов также использованы биопленкообразующие микроорганизмы (S. aureus, Р. aeruginosa и др.), следовательно, в этих случаях наряду с острым инфекционным процессом у экспериментальных животных будет наблюдаться и прогредиентное течение инфекционного заболевания. Известно, что P. aeruginosa может вызывать хронический инфекционный процесс [Патент RU 2478385, опубл. 10.04.2013].

Описано несколько коммерчески доступных биоцидных химиопрепаратов, например 2,2-дибромо-3-нитрилопропионамид и метилендитиоцианат, противодействующих образованию биопленок in vitro. Однако не изучено действие этих препаратов на организм человека и животных.

Колари М. с соавт. [Патент RU 2385942, опубл. 10.04.2010] предложили способ определения наличия образующих биопленку бактерий для определения необходимости использования агента, противодействующего образованию биопленок. Авторы предусмотрели возможность использования различных препаратов, препятствующих образованию биопленок бактериями. Разработанный способ предназначен и внедрен в процесс производства бумаги и картона и не применим для медицинских целей.

Описан способ предупреждения образования биопленок P. aeruginosa у пациентов с муковисцидозом и лечения хронической инфекции, вызванной P. Aeruginosa, у пациентов путем введения комплекса препаратов, включающих 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил] бензойную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и антибиотик, выбранный из следующей группы: гентамицин, амикацин, тобрамицин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, цефразидим, цефепим, цефпиром, пиперациллин, тикарциллин, меропенем, имипенем, полимиксин В, колистин и азреонам [Патент RU 2478385, опубл. 10.04.2013]. Предложенный патент выбран нами в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения («прототипа»).

Основным недостатком предложенного способа является значительная трудоемкость получения препаратов триазола и сложность применения описанной методики. Очевидно будет высокая стоимость предложенного препарата. Следует отметить, что предложенный способ не является средством того же назначения, а предназначен для лечения конкретного заболевания у людей и не используется для создания экспериментальной модели острой и генерализованной инфекции, на фоне ожоговой травмы с целью выбора эффективных методов лечения инфекционного заболевания.

Предшествующий уровень техники

В инфекционной патологии человека ведущее значение имеют латентные и хронические бактериальные инфекции. В большинстве случаев длительное сохранение возбудителей инфекционных заболеваний в организме зависит от особенностей строения микробных клеток и физиологических форм сохранения микробных популяций в восприимчивом организме. К таким защитным структурам следует отнести капсулы и биопленки микробных клеток.

Капсулы бактерий [Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. А.А. Воробьева. - М.: Медицинское информационное агенство, 2004. - 691 с.] и биопленки микробных клеток состоят из нерастворимых полисахаридов [Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека. Инфекции в хирургии. 2004; т.2. - №3. - С.16-19]. Нерастворимые полисахариды состоят из остатков глюкозы, которые соединены β-1,4-глюкозидными связями [Патент RU 2290440, опубл. 27.12.2006. Бюл. №36]. Фермент β-амилаза разрушает 1,4-глюкозидные связи с образованием глюкозы, необходимой для жизнедеятельности организма. Разрушение этих поверхностных структур микробных клеток, надо полагать, приведет к развитию острой бактериальной инфекции, что позволит разработать эффективное лечение заболеваний и ликвидировать очаг инфекционного заболевания в случае эпидемической вспышки.

Задачей настоящего изобретения является на основании разрушения нерастворимых полисахаридов, входящих в состав капсул и биопленок бактерий, разработать на экспериментальных лабораторных животных способ моделирования бактериальной инфекции на фоне ожоговой травмы с целью оптимизации лечения ожоговых больных и проведения эффективных противоэпидемических мероприятий, направленных на ограничение циркуляции возбудителей инфекционных заболеваний в лечебно-профилактическом учреждении.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат и основан на использовании агента, противодействующего образованию и способствующего разрушению поверхностных структур микробных клеток: биопленок и капсул бактерий. В результате этого микробные клетки теряют способность вызывать латентный и хронический инфекционный процесс в восприимчивом организме, а заболевание протекает в виде острой инфекции. В острой и генерализованной инфекции вегетативные формы бактерий наиболее чувствительны к неспецифическим и специфическим факторам защиты макроорганизма, а также к большему спектру антимикробных препаратов.

Предложено использовать фермент β-амилазу по новому назначению, а именно для разрушения капсул и биопленок микробных клеток, что обеспечивает наличие в организме только вегетативных форм бактерий, а в качестве фактора, способствующего развитию острой и генерализованной экспериментальной инфекции, использовали инфицирование экспериментальных животных культурабельными бактериями на фоне ожоговой термической травмы.

Кролики выбраны в качестве экспериментальной модели в связи с тем, что они получают глюкозу из нерастворимых полисахаридов с помощью фермента β-амилазы, питаясь древесиной. Питание кроликов злаками и древесиной обуславливает высокую потребность организма животных в выработке фермента β-амилазы.

Технический результат достигается тем, что согласно изобретению в качестве экспериментальной модели используют кроликов, которых в течение месяца содержат при температуре воздуха 24-26°C и кормят пищей, богатой злаками и древесиной, затем под наркозом кроликам наносят ожог площадью 10-20% площади тела животного, затем смесь культурабельных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus в концентрации 10⁵-10⁶ микробных клеток в общем объеме 1 мл смешивают с равным количеством 1% раствора фермента β-амилазы при температуре 24-26°C, а через 30 минут полученную взвесь вводят кроликам подкожно в объеме 1 мл смеси, учет развития бактериальной инфекции у экспериментальных животных проводят в течение 21 дня.

Предложенный способ осуществляют следующим образом:

Исследования проведены в виварии ФГБОУ ВПО «Государственного аграрного университета Северного Зауралья». Здоровых кроликов массой 2500-3500 грамм содержали в клетках в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). В виварии поддерживали температуру воздуха 24-26°C в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В течение месяца кроликов кормили пищей, богатой злаками и древесиной. Затем кроликов содержали в экспериментальных клетках собственной конструкции [Заявка на полезную модель №2013119320 от 26.04.2013] в течение 3-х дней для адаптации животных к новым клеткам.

Ожоговую термическую травму кроликам наносили после наркоза, проводимого по методике, предложенной А.В. Разиной [Разина А.В. Влияние различных вариантов общей анестезии и операционной травмы на организм кроликов. Автореф. канд. дисс. Троицк. - 2010]. Премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. У кроликов регистрировалось состояние общей анестезии, достаточной по глубине и продолжительности для воспроизведения экспериментальной ожоговой травмы.

Поверхность спины и боковые поверхности туловища кролика погружали в водяную баню на 10 сек при температуре 90°C. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку. Площадь ожоговой поверхности составляла 10-20% площади тела животного.

Для заражения кроликов использовали взвесь культурабельных бактерий P. aeruginosa и S. aureus. С целью развития бактериальной инфекции готовили разведения взвеси бактерий в концентрации 10⁵-10⁶ микробных клеток в 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия. Общий объем микробной взвеси в количестве 1 мл смешивали с равным объемом 1% раствора β-амилазы при температуре 24-26°C для разрушения полисахаридов микробных клеток. Смесь бактерий с β-амилазой выдерживали 30 минут при температуре 24-26°C, а затем вводили кроликам подкожно в объеме 1,0 мл смеси. Учет клинического проявления инфекционного процесса проводили в течение 21 дня.

Примеры использования предлагаемого способа

Пример 1

Исследование проведено в виварии ФГБОУ ВПО «Государственного аграрного университета Северного Зауралья». Здорового кролика массой 2800 грамм содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). В виварии поддерживали температуру воздуха 24-26°C в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В течение месяца кроликов кормили пищей, богатой злаками и древесиной. Затем кролика содержали в экспериментальной клетке собственной конструкции [Заявка на полезную модель №2013119320 от 26.04.2013] в течение 3-х дней для адаптации животного к новой клетке.

Ожоговую термическую травму кроликам наносили после наркоза, проводимого по методике, предложенной А.В. Разиной [Разина А.В. Влияние различных вариантов общей анестезии и операционной травмы на организм кроликов. Автореф. канд. дисс. Троицк. - 2010]. Премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. У кроликов регистрировалось состояние общей анестезии, достаточной по глубине и продолжительности для воспроизведения экспериментальной ожоговой травмы.

Поверхность спины и боковые поверхности туловища кролика погружали в водяную баню на 10 сек при температуре 90°C. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку.

Для заражения животных использовали взвесь культурабельных бактерий P. aeruginosa и S. aureus в концентрации, обычно определяемой у больных на поверхности ожоговых ран. С целью развития генерализованной бактериальной инфекции готовили разведения взвеси бактерий в концентрации 10⁵ микробных клеток в 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия. Общий объем микробной взвеси в количестве 1 мл смешивали с равным объеме 1% раствора β-амилазы при температуре 24-26°C для разрушения полисахаридов микробных клеток. Смесь бактерий с β-амилазой выдерживали 30 минут при температуре 24-26°C, а затем вводили кролику подкожно в объеме 1,0 мл смеси.

Кролик погиб на 15 день после нанесения термической травмы. Площадь глубокого ожога составила 18% площади тела кролика. Инфекционный процесс протекал в легочной ткани. Концентрация P. aeruginosa в легких составила 4,7×10¹⁰ микробных клеток в 1 мл. Бактерии S. aureus в органах животного не выявлены. Следовательно, инфекционный процесс у кролика вызван бактериями P. aeruginosa.

Пример 2

Исследование проведено в виварии ФГБОУ ВПО «Государственного аграрного университета Северного Зауралья». Здорового кролика массой 3200 грамм содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). В виварии поддерживали температуру воздуха 24-26°C в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В течение месяца кролика кормили пищей, богатой злаками и древесиной. Затем кролика содержали в экспериментальной клетке собственной конструкции [Заявка на полезную модель №2013119320 от 26.04.2013] в течение 3-х дней для адаптации кролика к новой клетке.

Ожоговую термическую травму кролику наносили после наркоза, проводимого по методике, предложенной А.В. Разиной [Разина А.В. Влияние различных вариантов общей анестезии и операционной травмы на организм кроликов. Автореф. канд. дисс. Троицк. - 2010]. Премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. У кролика регистрировалось состояние общей анестезии, достаточной по глубине и продолжительности для воспроизведения экспериментальной ожоговой травмы.

Поверхность спины и боковые поверхности туловища кролика погружали в водяную баню на 10 сек при температуре 90°C. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку.

Для заражения кролика использовали взвесь культурабельных бактерий P. aeruginosa и S. aureus. С целью развития продуктивной бактериальной инфекции готовили разведения взвеси бактерий в концентрации 10⁶ микробных клеток в 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия. Общий объем микробной взвеси в количествен 1 мл смешивали с равным объемом 1% раствора β-амилазы при температуре 24-26°C для разрушения полисахаридов микробных клеток. Смесь бактерий с β-амилазой выдерживали в течение 30 минут при температуре 24-26°C, а затем вводили кролику подкожно 1,0 мл смеси.

Кролик погиб на 14 день после нанесения термической травмы. Площадь глубокого ожога составила 20% площади тела кролика. Инфекционный процесс протекал в тканях печени. Концентрация P. aeruginosa в печени составила 4,2×10⁹ микробных клеток в 1 мл. Бактерии S. aureus в органах животного не выявлены. Следовательно, инфекционный процесс у кролика вызван бактериями P. aeruginosa.

Микробиологические исследования проведены на базе ООО Научно-производственное инновационное предприятие «Тюменский институт микробиологических технологий» (НПИП «ТИМТ»). Под наблюдением находилось 16 кроликов породы шиншилла массой 2500-3500 гр. Летальный исход бактериальной инфекции наблюдался в 75% случаев. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. Сравнительная характеристика предложенного способа по сравнению с «прототипом» дана в таблице 2.

Предложенный способ воспроизведения экспериментальной бактериальной инфекции позволяет изучить особенности течения инфекционного процесса на фоне ожоговой травмы в остром периоде с целью разработки эффективных лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий, направленных на ограничение циркуляции возбудителей инфекционных заболеваний в лечебно-профилактических учреждениях.

Таблица 1
Летальность кроликов породы «шиншилла», инфицированных культурабельными штаммами бактерий S. aureus и P. aeruginosa на фоне ожоговой травмы
№ кролика	Масса тела кролика (в граммах)	Площадь глубокого ожога (в %)	Летальность (в сутках)
1	3000	16,0	12
2	3000		*
3	3000	16.0	15
4	3900		*
5	2900	18,6	14
6	3000	18,0	13
7	3500		*
8	3400	20,0	12
9	2800	17,4	16
10	3200	20,0	13
11	3900	15,6	12
12	4200	16,6	15
13	3800	18,0	14
14	4500		*
15	3300	19,8	13
16	4500	14,6	14
	3493,75±120,57	17,55±0,48	13,58±0,36
Примечание: Кролики №2, 4, 7 и 14 прожили свыше 21 дня.

Таблица 2
Сравнительная характеристика предлагаемого способа и ближайшего аналога «прототипа»
п/п №№	Отличительные признаки способа	Ближайший аналог	Предложенный способ
1	Назначение предложенного способа	Для лечения хронического заболевания «Муковисцидоза»	Удаление с поверхности микробных клеток капсул и биопленок. В результате этого микробы теряют способность вызывать латентные и хронические заболевания и становятся чувствительными к химиотерапевтическим препаратам
2	Препарат, используемый для перевода бактерий из некультурабельного в культурабельное состояние	4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил] бензойная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль	β-амилаза
3	Возможность применения препарата для лечения инфекционных заболеваний у людей	Применяется только для лечения «Муковисцидоза»	β-амилаза вырабатывается в поджелудочной железе у людей и находится в крови в небольших концентрациях http://medicalplanet.su/xirurgia/122.html
4	Возможности использования препарата	Для лечения одного инфекционного заболевания: «Муковисцидоза»	Для разработки способов лечения многих инфекционных заболеваний
5	Возможность использования с эпидемиологической целью	Не предусмотрено	Имеется возможность применения предложенного способа для получения новых лечебных препаратов и для повышения эффективности дезинфекционных средств, применяемых в ЛПУ
6	Стоимость препарата	Высокая	Низкая
7	Научная новизна изобретения	Научная новизна ограничена применением только при одном инфекционном заболевании	Предложенный способ моделирования продуктивной бактериальной инфекции открывает новое направление в диагностике, лечении, профилактике и эпидемиологии бактериальных инфекций

Способ моделирования бактериальной инфекции на фоне ожоговой травмы, заключающийся в том, что в качестве экспериментальной модели используют кроликов, которых в течение месяца содержат при температуре воздуха 24-26°C и кормят пищей, богатой злаками и древесиной, затем под наркозом кроликам наносят ожог площадью 10-20% площади тела животного, затем смесь культурабельных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus в концентрации 10⁵-10⁶ микробных клеток в общем объеме 1 мл смешивают с равным количеством 1% раствора фермента β-амилазы при температуре 24-26°C, а через 30 минут полученную взвесь вводят кроликам подкожно в объеме 1 мл смеси, учет развития бактериальной инфекции у экспериментальных животных проводят в течение 21 дня.