Способ подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования

Способ подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной медицине, и биологии, в частности к гистологической технике, и может быть использовано для изготовления гистологических препаратов нематод (круглых гельминтов) при проведении научных морфологических исследований в ВУЗах и НИИ ветеринарного и биологического профиля.

В настоящее время в нашей стране и за рубежом используется стандартный способ изготовления гистологических препаратов, который не изменился за последние 60 лет (Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Изд-во «Наука», М., 1951, 447 с., Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.П., Артемьев В.Н. Гистологическая техника - 3-е изд. - Омск - Орел, 2006. - 290 с.). Стандартная схема изготовления гистологических препаратов при использовании заливки в парафин обязательно включает следующие операции.

1. Фиксация гистологического материала (кусочков различных органов и тканей). Для фиксации чаще всего используют нейтральный или забуференный раствор формалина.

2. Промывка фиксированного материала в проточной воде.

3. Обезвоживание с помощью батареи спиртов возрастающей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% и 100% этанол).

4. Пропитывание в хлороформе (или бензоле, толуоле).

5. Пропитывание в смеси хлороформа (или бензола, толуола) и парафина в термостате при 37 градусах.

6. Пропитывание расплавленным парафином в термостате при 56 градусах и заливка в парафин. Время экспозиции во всех предыдущих операциях зависят от размеров кусочков органов.

Также известен способ подготовки биологического материала для морфологического и гистологического исследования, включающий фиксацию исследуемого материала смесью 70% этилового спирта с 10% нейтральным формалином, его обезвоживание в спиртах, заливку смесью равных частей касторового масла и целлоидина, промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином (Г.А. Меркулов, Курс патологогистологической техники, Изд-во «Медицина», 1969 г., с.60-61 - прототип).

Недостатками известных технических решений являются - длительность процесса изготовления препаратов из-за продолжительного времени фиксации, подбора батареи спиртов возрастающей концентрации для обезвоживания и недостаточный срок хранения без изменения гистологических структур исследуемого материала, а также отсутствие возможности качественного морфологического и гистологического исследования срезов нематод, организм которых состоит из дыхательной, пищеварительной и других систем, состоящих из разного вида тканей, насыщенных жидкостью, что препятствует изготовлению качественных срезов, для исследования которых требуются разные смеси для фиксации и методы обезвоживания.

Техническим результатом является сокращение срока, повышение срока хранения без изменения гистологических структур исследуемого материала и качество окраски ткани исследуемого материала для исследований.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования, включающем фиксацию исследуемого материала смесью этилового спирта с 10% нейтральным формалином, его обезвоживание в спиртах, заливку смесью равных частей касторового масла и целлоидина, промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином, согласно изобретению в качестве исследуемого материала используют нематоды, фиксирующая смесь дополнительно содержит хлорид натрия в количестве не более 1 г на 100 мл смеси, при этом используют 70% этиловый спирт и берут его с 10% нейтральным формалином при следующем соотношении: 9:1, при этом фиксацию осуществляют в течение 3-4 часов, обезвоживание проводят пятикратно 96% этиловым спиртом и заливку исследуемого материала смесью касторового масла и целлоидина выдерживают в течение 10-12 часов.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что использование новой совокупности признаков, а именно: фиксирующая смесь, содержащая хлорид натрия в количестве не более 1 г на 100 мл смеси, 70% этиловый спирт и 10% нейтральный формалин, взятые соответственно при соотношении: 9:1, обезвоживание которое проводят пятикратно 96% этиловым спиртом; осуществление фиксации в течение 3-4 часов и заливка исследуемого материала смесью касторового масла и целлоидина, которую выдерживают в течение 10-12 часов, обеспечивает сокращение срока и повышение качества подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования за счет исключения набухания и сморщивания тканей исследуемого материала, а также увеличение срока хранения без изменения гистологических структур исследуемого материала. Причем следует отметить, что, по заключению паразитологов, заявляемый способ применим для исследования всех видов нематод, вызывающих болезни как у растений, так у животных и человека, например Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens - вызывают дирофиляриоз, геманхоз у животных и человека; Askaridia suis - вызывает заболевание у свиней - аскаридоз и гетерокидоз. Качественно полученный срез нематод позволяет точно описать новые виды нематод и точнее определить вид или класс, к которому они относятся, а значит, появляется возможность более точно определить метод лечения болезней, вызываемых нематодами.

Предлагаемый способ работоспособный, воспроизводимый и нашел применение в ветеринарной медицине, в частности используется на кафедре анатомии Кубанского агроуниверситета и в лаборатории гистологии Краснодарского ветеринарного НИИ, что отвечает критерию охраноспособности «промышленная применимость».

По данным научно-технической и патентной литературы не обнаружена аналогичная совокупность признаков, позволяющая достигать технический результат, получаемый заявленным способом, что позволяет утверждать о наличии «изобретательского уровня».

Сущность изобретения поясняется иллюстрирующим материалом, где на фото 1 представлен окрашенный срез нематоды, полученный стандартным способом подготовки; на фото 2 представлен окрашенный срез нематоды, полученный заявляемым способом подготовки.

Способ подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования осуществляется следующим образом.

Для исследования были отобраны нематоды вида Dirofilaria immitis, в половозрелой стадии, имеющие размер от 8 см до 24 см. Для опыта были отобраны особи размером от 1 до 2 (см).

Для подготовки нематод предварительно их помещают в фиксирующую смесь, состоящую из 70% этилового спирта с 10% нейтральным формалином, взятых в соотношении 9:1 и 1 г хлорида натрия на 100 мл смеси на 3-4 часа. Количество компонентов, входящих в состав смеси, обусловлено следующим: при использовании 70% этанола происходит не такое резкое сжатие белковых молекул, как при использовании 96% этилового спирта. С целью смягчения действия этанола добавляют 10% нейтральный формалин, который способствует физико-химическому процессу сжатия материала, потом набухания и затем вторичного сжатия, для того чтобы обеспечить баланс действия этанола и формалина, их берут в соотношении 9:1, при нарушении этого соотношения, например, если этанола будет больше, то будет большее количество не восстановленных молекул белков, а при меньшем количестве не будет осуществляться достаточное осаждение белков, что касается количества формалина, то при большем его количестве будут происходить необратимые процессы, приводящие к разрушению молекул, при меньшем количестве - будет происходить не полноценный физико-химический процесс. Таким образом, нарушение соотношения между этанолом и формалином приведет к не качественному приготовлению тканей нематод. Добавление в фиксирующую смесь хлорида натрия в количестве 1 г обеспечивает равномерную диффузию этанола с формалином в толщу материала, обеспечивая осмотическое давление, аналогичное прижизненному, сохраняя при этом физико-химические свойства ткани. При количестве меньше или больше 1 грамма нарушается равномерность диффузии, что ухудшает качество ткани. Кроме того, использование такого состава фиксирующей смеси обеспечивает возможность проводить фиксацию в более короткие сроки в течение 3-4 часов, что доказано экспериментально. При фиксации более 3-х часов уже сохраняются ткани и клетки прижизненного строения нематод, содержание и локализация химических веществ. После фиксации проводят промывку нематод от различных осадков фиксирующей смеси и пятикратное обезвоживание исследуемого материала 96% этиловым спиртом. Обезвоживание проводят в пяти чистых высушенных емкостях, заполненных 96% этиловым спиртом. Экспериментально доказано, что нет необходимости использовать батарею спиртов с повышающей концентрацией для обезвоживания нематод, ткани которых насыщены жидкостью, именно пятикратное использование 96% этилового спирта обеспечивает качественное обезвоживание, а при меньшем количестве происходит недостаточное обезвоживание, а при большем - происходит сморщивание. Далее исследуемый материал заливают смесью равных частей касторового масла и целлоидина, выдерживают в течение 10-12 часов. Использование касторового масла обеспечивает долгосрочное хранение без изменения гистологических структур исследуемого материала. Затем осуществляют промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином. После процесса заливки парафином делают срез нематод специальным режущим инструментом, например микротомом.

В условиях научно-исследовательской лаборатории кафедры анатомии Кубанского агроуниверситета проводились опыты по подготовке нематод для гистологических исследований разными способами. В результате научных исследований выяснилось, что срез (фото 2), полученный из нематод, подготовленных предложенным способом, оказался более четким, чем срез (фото 1), полученный из нематод, подготовленных стандартным способом подготовки.

Способ подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования, включающий фиксацию исследуемого материала смесью 70% этилового спирта с 10% нейтральным формалином, его обезвоживание в спиртах, заливку смесью равных частей касторового масла и целлоидина, промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют нематоды, фиксирующая смесь дополнительно содержит хлорид натрия в количестве не более 1 г на 100 мл смеси, а 70% этиловый спирт и 10% нейтральный формалин взяты соответственно при следующем соотношении: 9:1, при этом фиксацию осуществляют в течение 3-4 часов, обезвоживание проводят пятикратно 96% этиловым спиртом и заливку исследуемого материала смесью касторового масла и целлоидина выдерживают в течение 10-12 часов.