Способ обеспечения требуемых уровней фактора 2 роста глии в плазме

Способ обеспечения требуемых уровней фактора 2 роста глии в плазме

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно § 119(е) раздела 35 свода законов США по предварительной заявке на патент США с серийным № 61/067589, поданной 29 февраля 2008 года, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Исследование, приведшее к настоящему изобретению, было финансировано частично грантом Национального института здравоохранения № RO1-NS45939-01. Правительство Соединенных Штатов имеет определенные права на настоящее изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к введению фактора 2 роста глии (GGF2) нуждающемуся в этом пациенту для обеспечения уровней GGF2 в сыворотке в пределах требуемого терапевтического окна, определяемого на основе заболевания или нарушения, поражающего пациента.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нейрегулины (NRG) и рецепторы NRG включают систему фактор роста-рецепторная тирозинкиназа для передачи сигналов от клетки к клетке, которая вовлечена в органогенез нервной, мышечной, эпителиальной и других тканей (Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7: 247-262, 1996; Burden et al., Neuron 18: 847-855, 1997). Семейство NRG состоит из трех генов, которые кодируют многочисленные лиганды, содержащие подобные эпидермальному фактору роста (EGF), иммуноглобулиновые (Ig) и другие распознаваемые домены. Многочисленные секретируемые и присоединенные к мембране изоформы функционируют в качестве лигандов в этой системе передачи сигналов. Все рецепторы для NRG являются членами семейства рецепторов EGF (EGFR) и включают EGFR (или ErbB1), ErbB2, ErbB3 и ErbB4, также известные как HER1-HER4 соответственно у людей (Meyer et al., Development 124: 3575-3586, 1997; Orr-Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1867-1871, 1993; Marchionni et al., Nature 362: 312-318, 1993; Chen et al., J. Comp. Neurol. 349: 389-400; 1994; Corfas et al., Neuron 14: 103-115, 1995; Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1064-1068, 1994; и Pinkas-Kramarski et al., Oncogene 15: 2803-2815, 1997).

Три гена NRG, Nrg-1, Nrg-2 и Nrg-3, локализуются в различных хромосомных локусах (Pinkas-Kramarski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9387-9391, 1994; Carraway et al., Nature 387; 512-516, 1997; Chang et al., Nature 387: 509-511, 1997; и Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9562-9567, 1997) и в совокупности кодируют разнообразную совокупность белков NRG. Самыми детально изученными к настоящему времени являются продукты гена Nrg-1, которые включают группу из приблизительно 15 отличных структурно-родственных изоформ (Lemke, Mol. Cell, Neurosci. 7: 247-262, 1996; и Peles and Yarden, BioEssays 15: 815-824, 1993). Впервые идентифицированные изоформы NRG-1 включали фактор дифференциации нейтрофилов (NDF; Peles et al., Cell 69, 205-216, 1992 и Wen et al., Cell 69, 559-572, 1992), херегулин (HRG; Holmes et al., Science 256: 1205-1210, 1992), индуцирующую рецепторы для ацетилхолина активность (ARIA; Falls et al., Cell 72: 801-815, 1993) и факторы роста глии GGF1, GGF2 и GGF3 (Marchionni et al. Nature 362: 312-318, 1993).

Ген Nrg-2 был идентифицирован с помощью клонирования по гомологии (Chang et al., Nature 387: 509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; и Higashiyama et al., J. Biochem. 122: 675-680, 1997) и благодаря геномным подходам (Busfield et al., Mol. Cell Biol. 17: 4007-4014, 1997). кДНК NRG-2 также известны как активатор киназ ErbB неврального и тимусного происхождения (NTAK; входящий № в GenBank - АВ005060), дивергент нейрегулина (Don-1) и фактор роста мозжечкого происхождения (CDGF; заявка РСТ WO 97/09425). Экспериментальные данные показывают, что клетки, экспрессирующие ErbB4 или комбинацию ErbB2/ErbB4, по-видимому, демонстрируют особенно сильный ответ на NRG-2 (Pinkas-Kramarski et al., Mol. Cell. Biol. 18: 6090-6101, 1998). Также известно, что продукт гена Nrg-3 (Zhang et al., выше) связывается с рецепторами ErbB4 и стимулирует их (Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998).

Домен EGFL присутствует в сердцевине всех форм NRG и необходим для связывания с рецепторами ErbB и их активации. Расшифрованные аминокислотные последовательности доменов EGFL, кодируемых в трех генах, идентичны на приблизительно 30-40% (при попарных сравнениях). Кроме того, существуют, по-видимому, по меньшей мере две субформы доменов EGFL в NRG-1 и NRG-2, которые могут сообщить различные биоактивности и тканеспецифические активности.

Клеточные ответы на NRG опосредуются через рецепторные тирозинкиназы для NRG EGFR, ErbB2, ErbB3 и ErbB4 семейства рецепторов эпидермального фактора роста (Busfield et al., 1997, Mol. Cell Biol. 17: 4007-4014; Carraway et al., 1997, Nature 387: 512-516; Chang et al., 1997, Nature 387: 509-512). Связывание с высоким сродством всех NRG опосредуется, главным образом, через либо ErbB3, либо ErbB4 (Ferguson et al., 2000, EMBO J. 19: 4632-4643). Связывание лигандов NRG приводит к димеризации с другими субъединицами ErbB и трансактивации при фосфорилировании на специфических остатках тирозина (Honegger et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10: 4035-4044; Lemmon and Schlessinger, 1994, Trends Biochem Sci. 19: 459-463; Heldin, 1995, Cell. 80: 213-223; Hubbard et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 11987-11990). При определенных установочных параметрах эксперимента почти все комбинации рецепторов ErbB, по-видимому, способны к образованию димеров в ответ на связывание изоформ NRG-1. Однако ErbB2, по-видимому, является предпочтительным партнером по димеризации, который может играть важную роль в стабилизации комплекса лиганд-рецептор.

Установлено, что GGF2 стимулирует пролиферацию, дифференциацию и защиту шванновских клеток (Goodearl et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 18095-18102; Minghetti et al., 1996, J. Neurosci. Res. 43: 684-693). Экспрессия NRG-1, ErbB2 и ErbB4 также необходима для образования трабекулы вентрикулярного миокарда во время развития мыши (Meyer and Birchmeier 1995, Nature 378: 386-390; Gassmann et al., 1995, Nature 378: 390-394; Kramer et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4833-4838). Также было установлено, что GGF2 стимулирует пролиферацию и защиту клеток кардиомиоцитов (Zhao et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 10261-10269). GGF2-опосредованная нейропротекция также продемонстрирована в моделях инсульта на животных, хотя относящиеся к дозированию параметры остаются неопределенными.

Настоящее изобретение совершенствует применение GGF2 в отношении терапевтических применений путем обеспечения руководства в отношении способов введения GGF2, которые оптимизируют терапевтическую пользу с ограничением неблагоприятных эффектов. Настоящее изобретение определяет целевые терапевтические окна для уровней концентраций GGF2 в сыворотке, которые точно определены в отношении конкретных болезненных состояний.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к введению GGF2 нуждающемуся в этом пациенту для обеспечения уровней GGF2 в плазме (сыворотке) в пределах целевого терапевтического окна, которое, как определено, является эффективным при лечении заболевания или нарушения. В соответствии с настоящим изобретением GGF2 может вводиться в фармацевтической композиции.

В соответствии с настоящим изобретением предоставляется способ избегания ингибирования миелинизации шванновскими клетками после введения фактора 2 роста глии (GGF2) субъекту, включающий обеспечение субъекта, нуждающегося в миелинизации нейронов, обеспечение GGF2 в фармацевтически приемлемом носителе, введение GGF2 субъекту и определение того, что количество GGF2 меньше количества, которое ингибирует миелинизацию шванновскими клетками.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу стимуляции миелинизации у пациента, страдающего заболеванием или нарушением, связанным со сниженными уровнями миелинизации, включающему отбор пациента, страдающего заболеванием или нарушением, связанным со сниженными уровнями миелинизации, введение пациенту фактора 2 роста глии (GGF2) в количестве, составляющем приблизительно 500 нг GGF2 на кг веса тела, посредством чего стимулируется миелинизация.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу стимуляции миелинизации у пациента, страдающего заболеванием или нарушением, связанным со сниженными уровнями миелинизации, включающему отбор пациента, страдающего заболеванием или нарушением, связанным со сниженными уровнями миелинизации, и введение пациенту фактора 2 роста глии (GGF2) в количестве, которое обеспечивает уровень в плазме, составляющий приблизительно 0,01 нМ GGF2.

В дальнейшем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу расширения диапазона терапевтических доз GGF2, когда GGF2 используется для способствования миелинизации, включающему отбор пациента с заболеванием или нарушением, связанным со сниженными уровнями миелинизации, введение пациенту GGF2 и ингибитора пути с участием Mek1/Erk, посредством чего GGF2-опосредованная миелинизация происходит при более высоких дозах GGF2, чем она могла бы происходить в отсутствие введения ингибитора пути с участием Mek1/Erk.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения того, является ли количество GGF2 терапевтически эффективным количеством для стимуляции миелинизации, включающему обеспечение субъекта, получающего терапию с использованием GGF2, и измерение уровней белка c-Jun у субъекта, посредством чего увеличение c-Jun относительно базовых уровней c-Jun указывает на то, что количество GGF2 близко к максимальному порогу терапевтической эффективности для стимуляции миелинизации.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения GGF2 вводят млекопитающему, используя схему введения доз, направленную на обеспечение узкого целевого терапевтического окна концентраций GGF2 в плазме.

Как указано в настоящем документе, известно, что GGF2 способен к стимуляции пролиферации, дифференциации и защите шванновских клеток. Также было установлено, что GGF2 стимулирует ремиелинизацию и ослабляет симптомы в моделях рассеянного склероза, в том числе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, на животных. Однако в некоторых случаях (например, при высоких концентрациях GGF2) GGF2 может предотвращать миелинизацию нейронов, сокультивируемых со шванновскими клетками.

Представленные в настоящем документе данные показывают, что GGF2 действительно способен к стимуляции миелинизации периферических нервов, но они (данные) указывают, что для обеспечения требуемой GGF2-опосредованной, стимулируемой миелинизации периферических нервов необходимо введение точных доз GGF2 нуждающемуся в этом млекопитающему. Как указано в настоящем документе, GGF2 вводят так, чтобы он находился в пределах терапевтического окна концентраций GGF2 в плазме для того, чтобы стимулировать миелинизацию. В отсутствие результатов, представленных в настоящем документе, нет оценки узкого терапевтического окна концентраций GGF2 в плазме, необходимого для стимуляции миелинизации у нуждающегося в этом млекопитающего.

Представленные в настоящем документе данные также показывают, что GGF2 достаточен для стимуляции миелинизации и избавления от недостатка миелинизации на дефицитных по CRD-Nrg1 аксонах. Однако при высоких концентрациях GGF2 ингибирует миелинизацию Erk-зависимым образом. Результаты настоящего исследования показывают, что GGF2 способен как к стимуляции, так и к ингибированию миелинизации в зависимости от концентраций, представляемых шванновским клеткам.

Соответственно, настоящее изобретение относится к удивительному обнаружению того, что существует до сего времени неосознанная положительная корреляция между GGF2-опосредованной активацией пути с участием PI3-киназы и стимуляцией миелинизации и существует отрицательная корреляция между GGF2-опосредованной активацией пути с участием Mek1/Erk и стимуляцией миелинизации. Иначе говоря, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение GGF2 можно точно регулировать для стимуляции миелинизации путем оценки уровней активации этих путей. В соответствии с настоящим изобретением целевое терапевтическое окно для GGF2 в отношении стимуляции миелинизации у субъекта представляет собой количество GGF2, которое вызывает активацию пути с участием PI3-киназы (проверяемую, например, путем выявления фосфорилированной Akt) в отсутствие выявляемой активации пути с участием Mek1/Erk (проверяемой, например, путем выявления фосфорилированной Erk).

Составы и композиции по настоящему изобретению демонстрируют специфический, требуемый профиль высвобождения, который максимизирует терапевтический эффект при минимизации неблагоприятных побочных эффектов. Требуемый профиль высвобождения может быть охарактеризован с учетом максимальной концентрации в плазме лекарственного средства или активного агента (C_max) и концентрации в плазме лекарственного средства или активного агента в конкретном интервале между введениями доз (C_tau). Отношение C_max к C_tau (C_max:C_tau) можно рассчитать на основе наблюдаемых C_max и C_tau. Интервал между введениями доз (_tau) является временем после последнего введения лекарственного средства или активного агента. В настоящей заявке интервал между введениями доз (_tau) может, например, составлять двенадцать (12) часов, в этом случае C_tau является концентрацией лекарственного средства или активного агента через двенадцать (12) часов от последнего введения.

Кроме того, составы и композиции по настоящему изобретению демонстрируют требуемый профиль высвобождения, который можно охарактеризовать с учетом максимальной концентрации в плазме лекарственного средства или активного агента в состоянии равновесия (C_maxSS) и минимальной концентрации в плазме лекарственного средства или активного агента в состоянии равновесия (C_minSS). Состояние равновесия наблюдается, когда скорость введения (поглощения) равна скорости удаления лекарственного средства или активного агента. Отношение C_maxSS к C_minSS (C_maxSS:C_minSS) можно рассчитать на основе наблюдаемых C_maxSS и C_minSS. Кроме того, составы и композиции по настоящему изобретению демонстрируют требуемый профиль высвобождения, который можно охарактеризовать с учетом средней максимальной концентрации в плазме лекарственного средства или активного агента в состоянии равновесия (C_avSS).

В варианте осуществления настоящего изобретения, направленном на нуждающегося в ремиелинизации пациента, целевые максимальные уровни GGF2 в сыворотке составляют приблизительно 0,01 нМ.

В варианте осуществления настоящего изобретения, направленном на нуждающегося в ремиелинизации пациента, целевые максимальные уровни GGF2 в сыворотке составляют любые из следующих значений, или приблизительно любые из следующих значений, или диапазоны между следующими значениями: от приблизительно 0,001 до 0,01 нг/мл; от 0,01 до 0,1 нг/мл; от 0,1 до 1,0 нг/мл; от 1,0 до 10 нг/мл; от 10 до 100 нг/мл; или от 100 до 1000 нг/мл. В конкретном варианте осуществления целевой максимальный уровень в сыворотке составляют приблизительно 1,0 нг/мл.

В варианте осуществления настоящего изобретения, направленном на перенесшего инсульт пациента, целевые максимальные уровни GGF2 в сыворотке составляют любые из следующих значений, или приблизительно любые из следующих значений, или диапазоны между следующими значениями: от приблизительно 0,00001 до 0,0001 нг/мл; от 0,0001 до 0,001 нг/мл; от 0,001 до 0,01 нг/мл; от 0,01 до 0,1 нг/мл; от 0,1 до 1,0 нг/мл; от 1,0 до 10 нг/мл; от 10 до 100 нг/мл; от 100 до 1000 нг/мл; от 1000 до 10000 нг/мл; или от 10000 до 100000 нг/мл. В конкретном варианте осуществления целевой максимальный уровень в сыворотке составляет приблизительно 0,2 мкг/мл.

В варианте осуществления настоящего изобретения, направленном на страдающего невропатией пациента, целевые максимальные уровни GGF2 в сыворотке составляют любые из следующих значений, или приблизительно любые из следующих значений, или диапазоны между следующими значениями: от приблизительно 0,001 до 0,01 нг/мл; от 0,01 до 0,1 нг/мл; от 0,1 до 1,0 нг/мл; от 1,0 до 10 нг/мл; от 10 до 100 нг/мл; или от 100 до 1000 нг/мл. В конкретном варианте осуществления целевой максимальный уровень в сыворотке составляет приблизительно 6,25 нг/мл.

В варианте осуществления настоящего изобретения, направленном на пациента с сердечной недостаточностью, целевые максимальные уровни GGF2 в сыворотке составляют любые из следующих значений, или приблизительно любые из следующих значений, или диапазоны между следующими значениями: от приблизительно 0,001 до 0,01 нг/мл; от 0,01 до 0,1 нг/мл; от 0,1 до 1,0 нг/мл; от 1,0 до 10 нг/мл; от 10 до 100 нг/мл или от 100 до 1000 нг/мл. В конкретном варианте осуществления целевой максимальный уровень в сыворотке составляет приблизительно 6,8 мкг/мл.

В соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции, содержащие GGF2, могут вводиться различными путями, известными квалифицированным в данной области техники специалистам. Может использоваться любой подходящий путь введения, например внутривенное, парентеральное, подкожное, внутримышечное, внутричерепное, внутриглазничное, глазное, внутрижелудочковое, внутрисуставное, внутрипозвоночное, интрацистернальное, внутрибрюшинное, интраназальное, аэрозольное, пероральное или местное (например, путем применения пластыря, несущего состав, способный перемещаться через кожу и поступать в кровоток) введение. Предусматривается, что пероральное введение включает включающие GGF2 перпероральные лекарственные формы с замедленным высвобождением. Описываемая в настоящем документе фармацевтическая композиция, включающая GGF2, может использоваться для лечения индивидуумов, страдающих неврологическими нарушениями, причем указанная фармацевтическая композиция максимизирует терапевтический эффект при минимизации неблагоприятных побочных эффектов.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения GGF2 вводят млекопитающему, страдающему неврологическим нарушением, связанным с демиелинизацией, причем GGF2 вводят по схеме введения доз для обеспечения и поддержания узкого целевого терапевтического окна концентраций GGF2 в плазме. Как указано в настоящем документе, введение точных доз GGF2 требуется для обеспечения уровней GGF2 в плазме (сыворотке), необходимых для терапевтической эффективности в отношении индуцирования миелинизации у нуждающегося в этом субъекта. Примеры демиелинизирующих заболеваний, при которых для обеспечения терапевтической эффективности требуется введение надлежащих доз GGF2, включают синдром Гийена-Барре, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, периферическую демиелинизацию вследствие травматического повреждения, рассеянный склероз, ретробульбарный неврит, центральную демиелинизацию вследствие травматического повреждения, поперечный миелит, прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, болезнь Девика (нейромиелит зрительного нерва), острый рассеянный энцефаломиелит, адренолейкодистрофию и адренолейконевропатию.

Во втором варианте осуществления настоящего изобретения GGF2 вводят млекопитающему, страдающему заболеванием сердечной мышцы, таким как застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, реперфузионное повреждение, химическая, вирусная или идиопатическая кардиотоксичность, аритмии, причем GGF2 вводят по схеме введения доз для обеспечения целевого терапевтического окна концентраций GGF2 в плазме.

В третьем варианте осуществления настоящего изобретения GGF2 вводят млекопитающему, перенесшему инсульт, повреждение спинного мозга или травматическое повреждение головного мозга, причем GGF2 вводят по схеме введения доз для обеспечения целевого терапевтического окна концентраций GGF2 в плазме.

Будет понятно, что для любого из детализированных в настоящем документе применений GGF2 может вводиться в любой подходящей форме, или в виде компонента фармацевтической композиции и посредством любых способов, все из которых описываются в настоящем документе и/или допускаются в данной области техники.

Соответственно, настоящее изобретение направлено на определение целевого терапевтического окна относительно терапевтически эффективного уровня GGF2 в плазме. Целевое терапевтическое окно меняется в зависимости от заболевания или нарушения, поражающего пациента, и требуемой активности, сообщаемой при обеспечении надлежащего терапевтически эффективного уровня GGF2 в плазме.

В настоящий документ также включен способ отбора индивидуумов на основе демонстрации симптомов. Также включен способ отбора индивидуумов на основе реагирования на достижение терапевтически эффективного уровня GGF2 в плазме, указанного для каждого применения.

Помимо изложенных выше способов лечения настоящее изобретение распространяется на применение любого из соединений по настоящему изобретению для приготовления лекарственных средств или в качестве лекарственных средств, которые могут вводиться для осуществления таких лечений, а также на такие соединения для осуществления раскрытых и точно определенных лечений.

Настоящим изобретением также охватывается фармацевтическая композиция, содержащая GGF2 или домен EGFL и ингибитор пути с участием Mek1/Erk и ее применение для лечения пациента, страдающего заболеванием или нарушением, связанным со сниженными уровнями миелинизации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A-C демонстрируется (А) GGF2-индуцированная активация Akt и МАРК в сокультурах шванновских клеток и нейронов DRG. Сокультуры шванновских клеток с нейронами DRG в условиях для миелинизации обрабатывали GGF (в концентрации 0,6 мкМ) и через 20 минут оценивали уровни активации Akt и МАРК с помощью анализа Вестерн-блоттингом. (В) Ингибирование U0126 GGF2-индуцированной активации МАРК. Сокультуры предварительно обрабатывали увеличивающимися дозами U0126 в течение 30 минут, а затем стимулировали GGF2. Контрольные культуры оставляли необработанными. Активацию МАРК оценивали через 20 минут. (С) Ингибирование U0126 (1 и 3 мкМ) GGF2-индуцированной активации МАРК отменяет ингибиторный эффект GGF2 на миелинизацию. Сокультуры обрабатывали совместно GGF2 и U0126 (1 и 3 мкМ) в условиях для миелинизации. Через десять-двенадцать дней культуры фиксировали и подвергали иммуноокрашиванию на МВР для определения уровня миелинизации.

На фиг.2 демонстрируется, что GGF2 стимулирует миелинизацию при низких концентрациях. Сокультуры обрабатывали GGF2 в концентрациях, находящихся в диапазоне от 0,5 до 1000 пМ (от 0,0005 до 1 нМ), в условиях для миелинизации. Через десять-двенадцать дней миелинизацию оценивали с помощью иммуноокрашивания на МВР. Конкретнее, концентрациями GGF2 слева направо являются следующие концентрации: без обработки, 0,5 пМ, 1 пМ, 3 пМ, 10 пМ, 30 пМ, 300 пМ, 600 пМ и 1000 пМ соответственно. Через десять-двенадцать дней миелинизацию оценивали с помощью иммуноокрашивания на МВР.

На фиг.3A-F демонстрируется, что ингибиторный эффект GGF на миелинизацию опосредуется через активацию Mek1/Erk. (А) Сокультуры шванновских клеток и нейронов DRG обрабатывали GGF (0,01, 0,6 и 1 нМ), и через 45 минут готовили лизаты клеток, и уровни активного Erk (p-Erk) и Akt (p-Akt) определяли с помощью анализа Вестерн-блоттингом. При использовании 1 нМ (заключенные в рамку линии) GGF индуцировал активацию и Erk, и Akt. (В) Ингибирование GGF-индуцируемой активации Erk в сокультурах. Сокультуры шванновских клеток и нейронов DRG предварительно обрабатывали U0126 в течение 30 минут, а затем добавляли GGF (0,6 нМ) при постоянном присутствии U0126. Через 45 минут готовили лизаты клеток и определяли уровень p-Erk и p-Akt. Обработка U0126 ингибировала как эндогенную, так и GGF-индуцируемую активации Erk, не оказывая влияние на активацию Akt. (C) Снимки сегментов МВР⁺ миелина, образованных в сокультурах, обработанных GGF или GGF+U0126 (1 нМ). Обработка U0126 отменяла ингибиторный эффект GGF и индуцировала миелинизацию. Контрольные культуры сохраняли без какой-либо обработки. Масштабная метка: 100 мкм. Квантификация результатов представлена в (D). (E) Ингибирование эндогенной активности Erk в сокультурах стимулирует миелинизацию. Сокультуры обрабатывали увеличивающими концентрациями U0126 (0,5, 1 и 3 нМ) в условиях для миелинизации и через 11 дней миелинизацию исследовали, как указано выше. Значительное увеличение миелинизации наблюдалось в культурах, обработанных U0126. Планки погрешностей означают ± среднеквадратическая ошибка (р<0,001). (F) Ингибирование GGF-индуцируемой активации Erk сопровождается снижением c-Jun и увеличением экспрессии Krox20. Сокультуры сохраняли в условиях для миелинизации в присутствии GGF или GGF+U0126 (0,5, 1 и 3 нМ) в течение 11 дней и лизаты клеток анализировали на экспрессию МВР, c-Jun и Krox20. В качестве контроля загрузки служил уровень актина. GGF-индуцируемая экспрессия c-Jun снижалась при обработке U0126. Уровень белка Krox20, по-видимому, увеличивался в культурах, обработанных U0126.

На фиг.4A-С демонстрируется, что GGF стимулирует миелинизацию при низкой концентрации. (А) Шванновские клетки обрабатывали различными концентрациями GGF, находящимися в диапазоне от 0,0003 до 10 нМ, и через 20 минут готовили лизаты клеток и уровни активации Erk и Akt анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (наверху) и денситометрического анализа (внизу). Увеличение активации Akt возникало в диапазоне более низких концентраций (в рамке) по сравнению с активацией Erk. (В) Сокультуры обрабатывали различными концентрациями GGF (0,0005, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,3, 0,6 и 1 нМ) в течение 11 дней в условиях для миелинизации, а затем фиксировали и подвергали иммуноокрашиванию на МВР и DAPI. Снимки контроля и культур, обработанных 0,01 нМ GGF, представлены вместе с квантификацией результатов (справа). Продемонстрирован очевидный двухфазный эффект GGF: он стимулирует миелинизацию при низких концентрациях (от 0,0005 до 0,01 нМ), ингибируя процесс при более высоких концентрациях (0,3 нМ и выше). (С) Низкая концентрация GGF (0,01 нМ) значительно увеличивала миелинизацию на нейронах CRD-Nrg1^+/- (р=0,003). Планки погрешностей показывают ± среднеквадратическая ошибка. Данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа (*: р<0,001).

На фиг.5A-D демонстрируются нуклеотидная и аминокислотная последовательности полноразмерного GGF2.

На фиг.6-11 демонстрируются нуклеотидные и аминокислотные последовательности доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGFL), 1-6.

На фиг.12 демонстрируется таблица, имеющая отношение к номенклатуре нейрегулинов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленные в настоящем документе данные показали, что для стимуляции миелинизации периферических нервов GGF2 должен вводиться млекопитающему, используя схему введения доз, направленную на обеспечение терапевтического окна, например, концентраций GGF2 в плазме или доз GGF2.

Определения

Используемые в настоящем документе термины имеют значения, общепризнанные и известные квалифицированным в данной области техники специалистам, однако для удобства и завершенности конкретные термины и их значения изложены ниже.

В настоящем документе «приблизительно» означает фактическое значение плюс или минус другая величина, устанавливая тем самым диапазон величин. В определенных предпочтительных вариантах осуществления «приблизительно» означает диапазон относительно базисной (или основной, или ссылочной) величины или величину плюс или минус вплоть до 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или 0,1%.

Под «доменом, подобным эпидермальному фактору роста» или «доменом EGFL» подразумевается полипептидный мотив, кодируемый геном NRG-1, NRG-2 или NRG-3, который связывается с ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинациями и стимулирует их и имеет структурное сходство со связывающимся с рецептором для EGF доменом, описанным в Holmes et al., Science 256: 1205-1210, 1992; патенте США № 5530109, патенте США № 5716930, заявке на патент США с серийным № 08/461097; Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998; Chang et al., Nature 387: 509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; Higashiyama et al., J. Biochem. 122: 675-680, 1997, и WO 97/09425). См. фиг.10-15 в отношении нуклеотидных и аминокислотных последовательностей доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGFL) 1-6.

Под «нейрегулином» или «NRG» подразумевается полипептид, который кодируется геном или нуклеиновой кислотой (например, кДНК) NRG-1, NRG-2 или NRG-3 и связывается с рецепторами ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинациями и стимулирует их.

Под «нейрегулином-1», «NRG-1», «херегулином», «GGF2» или «лигандом p185erbB2» подразумевается полипептид, который связывается непосредственно с рецептором ErbB2 или трансстимулирует его и кодируется геном лиганда p185erbB2, описанным в патенте США № 5530109, патенте США № 5716930 и патенте США № 7037888, содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки. См. фиг.9А-D в отношении нуклеотидной и аминокислотной последовательностей полноразмерного GGF2. См. фиг.12 в отношении таблицы, относящейся к номенклатуре нейрегулинов.

Кодируемые генами NRG-1, NRG-2 и NRG-3 полипептиды обладают доменами EGFL, которые позволяют им связываться с рецепторами ErbB и стимулировать их. Holmes и др. (Science 256: 1205-1210, 1992) установили, что домен EGFL сам по себе достаточен для связывания с рецептором p185erbB2 и его активации. Соответственно, любой полипептидный продукт, кодируемый геном NRG-1, NRG-2 или NRG-3, например полипептид, имеющий домен EGFL (например, домен EGFL, описанный в патенте США № 5530109, патенте США № 5716930, патенте США № 7037888, патенте США № 7135456 и патенте США № 7319019 или домен EGFL, описанный в WO 97/09425), кодируемый геном или кДНК нейрегулина, может использоваться в способах по настоящему изобретению для обеспечения терапевтического окна, в котором достигается эффективный уровень GGF2 в плазме (сыворотке).

Также должно быть обращено внимание на то, что используемые в настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число за исключением случаев, когда контекст четко определяет иное.

Кроме случаев, оговоренных особо, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, одинаковые с такими, в которых они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники. Хотя любые способы и материалы, схожие с описанными в настоящем документе способами и материалами или эквивалентные им, можно использовать для осуществления на практике или проверки вариантов осуществления настоящего изобретения, теперь описываются конкретные способы, устройства и материалы.

«Местное введение» означает непосредственное введение не являющимся системным путем в место болезни или нарушения или вблизи него.

Термины «пациент» и «субъект» используются в настоящем документе для ссылки на всех животных, включающих млекопитающих. Примеры пациентов или субъектов включают людей, коров, собак, кошек, коз, овец и свиней.

Используемые в настоящем документе термины «фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры, амиды и пролекарства» относятся к таким солям карбоновых кислот (карбоксилатам), солям присоединения аминокислот, сложным эфирам, амидам и пролекарствам соединений по настоящему изобретению, которые, в рамках обоснованной оценки врача, подходят для использования в контакте с тканями пациента без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствуют допустимому соотношению польза/риск и эффективны для их намеченного применения, а также цвиттерионным формам, при наличии возможности, соединений по настоящему изобретению.

Термин «пролекарство» относится к соединениям, которые быстро преобразуются in vivo с выработкой исходных соединений вышеотмеченной формулы, например, при гидролизе в крови. Детальное обсуждение предоставлено в T. Higuchi and V. Stella, “Pro-drugs as Novel Delivery Systems”, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, и в Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, оба из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Термин «соли» относится к относительно нетоксичным солям присоединения неорганических и органических кислот соединений по настоящему изобретению. Эти соли можно приготовить на месте во время конечного выделения и очистки соединений или с помощью отдельного взаимодействия очищенного соединения в его свободной основной форме с подходящей органической или неорганической кислотой и выделения таким образом образованной соли. Репрезентативные соли включают соли гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, нитрат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат и лаурилсульфонат и т.п. Они могут включать катионы на основе щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний и т.п., а также нетоксичный аммоний, тетраметиламмоний, тетраметиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и т.п. (см., например, S.M. Barge et al., “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci., 1977, 66: 1-19, который включен в настоящий документ посредством ссылки).

«Терапевтически эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для ослабления сопровождающих заболевание или болезненность симптомов, для нормализации функций организма при заболевании или нарушениях, которые приводят к ухудшению конкретных функций организма, или для обеспечения улучшения одного или нескольких клинически определяемых параметров заболевания, предпочтительно ослабления симптомов, сопровождающих заболевание, связанное, например, с демиелинизирующим заболеванием, включающих скорость хождения, мышечный тонус нижних конечностей, мышечную силу нижних конечностей или мышечную спастичность. Имеющее отношение к настоящему изобретению терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для ослабления боли или мышечной спастичности, сопровождающих подвергаемое лечению неврологическое нарушение, или количество, достаточное для приведения к улучшению половой функции, функции мочевого пузыря или кишечника у субъектов, имеющих неврологическое нарушение, которое уменьшает нервную проводимость или которое препятствует нормальным половым функциям, функции мочевого пузыря или кишечника.

«Лечение» относится к введению лекарственного средства или выполнению медицинских процедур в отношении пациента для улучшения клинического состояния пациента, в том числе уменьшения продолжительности заболевания или тяжести заболевания, или субъективного улучшения качества жизни пациента, или увеличения продолжительности жизни пациента.

В настоящем документе термин «целевое терапевтическое окно» относится к диапазону доз или диапазону концентраций в сыворотке, который обеспечивает требуемые терапевтические результаты. В отношении GGF2 в конкретном варианте осуществления целевое терапевтическое окно относится к достаточному для индуцирования миелинизации шванновскими клетками у субъекта количеству GGF2, которое меньше количества, достаточного для ингибирования миелинизации у субъекта. При удивительном обнаружении авторы настоящего изобретения определили целевое терапевтическое окно для GGF2 относительно его способности к стимуляции миелинизации путем определения относительных уровней активации пути с участием PI3-киназы и активации пути с участием Mek1/Erk. Конкретнее, авторы настоящего изобретения обнаружили до сего времени неосознанную положительную корреляцию между GGF2-опосредованной активацией пути с участием PI3-киназы и стимуляцией миелинизации и отрицательную корреляцию между GGF2-опосредованной активацией пути с участием Mek1/Erk и стимуляцией миелинизации. Иначе говоря, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение GGF2 можно точно регулировать для стимуляции миелинизации путем оценки уровней активации этих путей. Целевое терапевтическое окно для GGF2 в отношении стимуляции миелинизации у субъекта определяют как количество GGF2, которое вызывает активацию пути с участием PI3-киназы (проверяемую, например, путем выявления фосфорилированной Akt) в отсутствие выявляемой активации пути с участием Mek1/Erk (проверяемой, например, путем выявления фосфорилированной Erk). Выявление фосфорилированной Akt и фосфорилированной Erk можно выполнить, используя стандартные анализы, известные в данной области техники, включающие ELISA, Вестерн-(иммуно)блоттинг, иммуноцитохимию, in vitro анализ киназ, LC/MS (жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию), MaldiTOF MS (времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной десорбцией/ионизацией из матрицы) и другие белковые системы, известные в данной области, такие как Luminex.

Квалифицированному в данной области техники специалисту могло бы быть понятно, что другие внутриклеточные маркеры активации пути с участием PI3-киназы и активации пути с участием Mek1/Erk известны и используются в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с настоящим изобретением другие индикаторы активации пути с участием PI3-киназы и активации пути с участием Mek1/Erk могут использоваться для определения терапевтического окна, в котором GGF2 стимулирует миелинизацию.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированных, а также сольватированных формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол и т.п. В общем, сольватированные формы считаются эквивалентными несольват