Конъюгат полисахарид-белок для индуцирования иммунного ответа и защиты против инфекции staphylococcus aureus, способы получения конъюгата (варианты), композиция, содержащая конъюгат и способы индуцирования иммунного ответа и предотвращения инфекции staphylococcus aureus

Конъюгат полисахарид-белок для индуцирования иммунного ответа и защиты против инфекции staphylococcus aureus, способы получения конъюгата (варианты), композиция, содержащая конъюгат и способы индуцирования иммунного ответа и предотвращения инфекции staphylococcus aureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет предварительных заявок на патент США №61/219143 и 61/219151 с датой подачи 22 июня 2009 г., полное описание которых включено посредством ссылки во всей их полноте.

Область изобретения

Это изобретение в общем относится к иммуногенным композициям конъюгатов капсулярных полисахаридов Staphylococcus aureus серотипов 5 и 8 и способам их получения и применения.

Предшествующий уровень техники

Люди являются природным резервуаром для грамположительных Staphylococcus aureus. Например, S.aureus могут колонизировать кожу, носовую полость и горло либо постоянно, либо временно, не вызывая заболевание. Инфекции S.aureus находятся в диапазоне от легких кожных инфекций до эндокардита, остеомиелита, бактериемии и сепсиса. S.aureus также вызывает большинство нозокомиальных инфекций, и его распространенность в локальных вспышках инфекций растет. Более того, в 2005 г. устойчивые к метициллину инфекции S.aureus (MRSA) в США были установлены в 31,8 случаев на 100000 индивидов, включая 16650 случаев смерти в 2005 г. (Klevens et al. (2007) J.Am.Med. Assoc. 298:1763-1771). Впоследствии заболевание может иметь место у лиц с ослабленным иммунитетом по причине брешей в иммунных барьерах, таких как возникающие во время хирургии, при установке постоянных катетеров или других устройств, при травме или ранениях.

S.aureus продуцирует большое число вне- и внутриклеточных антигенов, в том числе многочисленных токсинов и ферментов. Особый интерес представляют капсулярные полисахариды определенных серотипов S.aureus (см. Karakawa & Vann, "Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus" в Weinstein & Fields, eds. Seminars in Infectious Diseases IV, Bacterial Vaccines. (New York, NY; Thieme Stratton; 1982. pp.285-293), особенно капсулярные полисахариды серотипов 5 и 8. Эпидемиологические исследования на большом числе штаммов S.aureus, изолированных из отдельных лиц, показали, что от 70% до 80% относятся к капсулярным полисахаридам серотипов 5 или 8 (Arbeit et al. (1984) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2:85-91). К несчастью, сами по себе эти капсулярные полисахариды являются плохими иммуногенами.

Стафилококковые инфекции и заболевания резко возросли в последний двадцать лет, как и применение внутрисосудистых устройств и инвазивных процедур. Этот рост заболеваемости вызывает еще больше беспокойства в связи с параллельным ростом устойчивости к антибиотикам; поэтому имеется острая необходимость в иммуногенных композициях для предотвращения стафилококковых инфекций и заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на иммуногенные конъюгаты, содержащие капсулярный полисахарид S.aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с белком-носителем, и на способы получения таких конъюгатов. Капсулярные полисахариды S.aureus серотипа 5 или 8 можно получать непосредственно из бактерий, используя способы выделения, известные специалистам, их можно получать с помощью синтетических способов, либо их можно получать рекомбинантным образом, используя генно-инженерные способы, также известные специалистам. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы индукции иммунного ответа против бактерии Staphylococcus, способы предупреждения заболевания, вызываемого бактерией Staphylococcus, и способы снижения тяжести по меньшей мере одного симптома заболевания, вызываемого инфекцией бактерией Staphylococcus.

В одном из воплощений это изобретение включает иммуногенный конъюгат полисахарид-белок, содержащий выделенный капсулярный полисахарид Staphylococcus aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с белком носителем, где полисахарид имеет молекулярную массу между 20 кДа и 1000 кДа. В некоторых воплощениях иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу между 200 кДа и 5000 кДа. В одном из воплощений полисахаридная часть иммуногенного конъюгата имеет диапазон молекулярных масс между 70 кДа и 300 кДа. В одном из воплощений иммуногенный конъюгат имеет диапазон молекулярных масс между 500 кДа и 2500 кДа.

В одном из воплощений капсулярный полисахарид серотипа 5 или 8 имеет степень O-ацетилирования, равную 10-100%. В одном из воплощений степень O-ацетилирования составляет 50-100%. В одном из воплощений степень O-ацетилирования составляет 75-100%. В одном из воплощений иммуногенный конъюгат генерирует антитело, которое является функциональным при измерении по умерщвлению бактерий либо в модели эффективности на животном, либо в анализе опсонофагоцитарного умерщвления.

В одном из воплощений белок носитель иммуногенного конъюгата содержит CRM₁₉₇. В одном из воплощений CRM₁₉₇ ковалентно связан с полисахаридом посредством карбаматной связи, амидной связи или их обеих. В одном из воплощений молярное соотношение лизинов, конъюгированных с CRM₁₉₇, может составлять от примерно 10:1 до примерно 25:1. В одном из воплощений конъюгат содержит одну ковалентную связь между CRM₁₉₇ и полисахаридом по меньшей мере на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В одном из воплощений связь между белком носителем и полисахаридом имеет место один раз на каждые 5 повторяющихся единиц полисахарида.

В одном из воплощений иммуногенный конъюгат, содержащий CRM₁₉₇, содержит от 5 до 22 лизинов или от 8 до 15 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В одном из воплощений иммуногенный конъюгат, содержащий CRM₁₉₇, содержит от 5 до 23 лизинов или от 8 до 12 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом.

В одном из воплощений иммуногенный конъюгат содержит полисахарид типа 5 или 8, который O-ацетилирован на 10-100%. В одном из воплощений иммуногенный конъюгат содержит полисахарид типа 5 или 8, который O-ацетилирован на 50-100%. В одном из воплощений иммуногенный конъюгат содержит полисахарид типа 5 или 8, который O-ацетилирован на 75-100%. В некоторых воплощениях иммуногенную композицию можно использовать для получения антител, которые являются функциональными в модели эффективности на животном или в анализе опсонофагоцитарного умерщвления.

В одном из воплощений иммуногенный конъюгат содержит менее примерно 30% свободного полисахарида типа 5 или 8 по сравнению с суммарным количеством полисахарида типа 5 или 8.

В одном из воплощений иммуногенный конъюгат содержит менее примерно 20% свободного полисахарида типа 5 или 8 по сравнению с суммарным количеством полисахарида типа 5 или 8.

В одном из воплощений это изобретение включает иммуногенную композицию, содержащую иммуногенный конъюгат, как он описан здесь, и по меньшей мере один адъювант, разбавитель или носитель.

Адъювант может быть адъювантом на основе алюминия, таким как один или более чем один из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. В одном из воплощений адъювант содержит фосфат алюминия.

В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит менее примерно 30% свободного полисахарида типа 5 или 8 по сравнению с суммарным количеством полисахарида типа 5 или 8.

В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит менее примерно 20% свободного полисахарида типа 5 или 8 по сравнению с суммарным количеством полисахарида типа 5 или 8.

В одном из воплощений это изобретение включает способ индуцирования иммунного ответа на конъюгат капсулярного полисахарида Staphylococcus aureus серотипа 5 или 8 у субъекта, включающий введение этому субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, как она описана здесь.

В одном из воплощений это изобретение включает способ получения иммуногенного конъюгата полисахарид-белок, содержащего выделенный капсулярный полисахарид Staphylococcus aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с белком носителем, включающий стадии: взаимодействия выделенного капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 5 или 8 с реагентом 1,1-карбонил-ди-(1,2,4-триазол) (CDT) в органическом растворителе с получением активированного полисахарида серотипа 5 или 8; и взаимодействия активированного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем в органическом растворителе с получением конъюгата полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем.

В одном из воплощений способ активации капсулярного полисахарида Staphylococcus aureus серотипа 5 или 8 дополнительно включает лиофилизацию выделенного полисахарида серотипа 5 или 8 и ресуспендирование лиофилизированного полисахарида в органическом растворителе. В одном из воплощений ресуспендированный полисахарид активируют и затем непосредственно подвергают взаимодействию с белком носителем. В одном из воплощений активированный выделенный полисахарид серотипа 5 или 8 выделяют перед взаимодействием с белком носителем. В одном из воплощений выделенный активированный полисахарид серотипа 5 или 8 лиофилизируют с получением лиофилизированного активированного выделенного полисахарида серотипа 5 или 8 перед взаимодействием полисахарида с белком носителем. В одном из воплощений способ получения выделенного конъюгата полисахарида с белком носителем включает стадию лиофилизации белка носителя с получением лиофилизированного белка носителя перед взаимодействием белка носителя с полисахаридом. В одном из воплощений способ получения выделенного конъюгата полисахарида с белком носителем включает стадию ресуспендирования лиофилизированного активированного выделенного полисахарида серотипа 5 или 8 и лиофилизированного белка носителя в органическом растворителе в качестве части взаимодействия активированного выделенного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем.

В одном из воплощений способ получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 с белком носителем включает стадию разбавления реакционной смеси активированного полисахарида и белка носителя и поддержания рН от примерно 8,8 до примерно 9,2 в течение по меньшей мере 4 часов при температуре от примерно 20°С до примерно 26°С.

В одном из воплощений реакционную смесь активированного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 и белка носителя поддерживают при рН примерно 9,0 в течение по меньшей мере 4 часов при температуре примерно 23°С.

В одном из воплощений способ получения выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 с белком носителем включает стадию выделения конъюгата выделенного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком после его получения. В одном из воплощений органический растворитель, используемый в способе получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 с белком носителем, представляет собой полярный апротонный растворитель. В одном из воплощений полярный апротонный растворитель выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO). В одном из воплощений способа получения конъюгата выделенного полисахарида с белком носителем органический растворитель представляет собой DMSO.

В одном из воплощений способ получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 с белком носителем включает стадию доведения концентрации воды в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 5 и CDT в органическом растворителе, до примерно 0,1-0,3%. В одном из воплощений концентрацию воды в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 5 и CDT в органическом растворителе, доводят до примерно 0,2%.

В одном из воплощений стадия активации выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 включает взаимодействие полисахарида с количеством CDT, которое составляет примерно 20-кратный молярный избыток относительно количества полисахарида, присутствующего в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 5 и CDT в органическом растворителе.

В одном из воплощений способ получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 8 с белком носителем включает стадию определения содержания воды в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 8. В одном из воплощений CDT добавляют к реакционной смеси для активации полисахарида в количестве, примерно равном количеству CDT, которое является эквимолярным количеству воды, присутствующей в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 8 и CDT в органическом растворителе.

В одном из воплощений CDT добавляют к реакционной смеси для активации полисахарида в таком количестве, что оно находится в молярном соотношении примерно 0,5:1 по сравнению с количеством воды, присутствующей в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 8 и CDT в органическом растворителе. В одном из воплощений CDT добавляют к реакционной смеси для активации полисахарида в таком количестве, что оно находится в молярном соотношении примерно 0,75:1 по сравнению с количеством воды, присутствующей в реакционной смеси, содержащей капсулярный полисахарид типа 8 и CDT в органическом растворителе.

В одном из воплощений способ, который включает стадию выделения активированного полисахарида, включает стадию диафильтрации.

В одном из воплощений способа, который включает лиофилизацию белка-носителя, белок-носитель перед лиофилизацией подвергают диафильтрации против NaCl, и массовое соотношение NaCl/белок носитель доводят до примерно 0,5-1,5. В одном из воплощений соотношение NaCl и белка носителя составляет примерно 1.

В одном из воплощений белок-носитель, используемый в способе получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 и белка носителя, содержит CRM₁₉₇.

В одном из воплощений CRM₁₉₇, используемый в способе получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 с белком носителем, подвергают взаимодействию с активированным полисахаридом серотипа 5 или 8 в массовом соотношении примерно 1:1.

В одном из воплощений способ получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 с белком носителем включает стадию смешивания капсулярного полисахарида типа 5 или 8 с имидазолом или триазолом перед перемешиванием с CDT в органическом растворителе.

В одном из воплощений способ получения конъюгата выделенного капсулярного полисахарида S.aureus типа 5 или 8 с белком носителем включает стадию гидролиза конъюгата полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем для удаления непрореагировавших активационных групп.

В одном из воплощений в этом изобретении предложен способ получения иммуногенного конъюгата, содержащего выделенный капсулярный полисахарид Staphylococcus aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с белком носителем, включающий стадии: взаимодействия капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 5 или 8 с 3-(2-пиридилдитио)-пропионилгидразидом (PDPH) и карбодиимидом в органическом растворителе с получением полисахарида, связанного с PDPH; взаимодействия полисахарида, связанного с PDPH, с восстановителем с получением активированного полисахарида; выделения активированного полисахарида серотипа 5 или 8 с получением выделенного активированного полисахарида серотипа 5 или 8; предоставления активированного белка носителя; взаимодействия выделенного активированного полисахарида серотипа 5 или 8 с активированным белком носителем с получением конъюгата полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем; посредством которых получают иммуногенный конъюгат, содержащий выделенный капсулярный полисахарид S.aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с белком носителем. В одном из воплощений активированный белок носитель выделяют перед взаимодействием активированного белка носителя с активированным полисахаридом.

В одном из воплощений стадия выделения активированного белка носителя дополнительно включает лиофилизацию выделенного активированного полисахарида серотипа 5 или 8 с получением лиофилизированного активированного полисахарида серотипа 5 или 8.

В одном из воплощений бромуксусная кислота включает N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS).

В одном из воплощений способ получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 8 с белком носителем, в котором используют PDPH, включает использование органического растворителя, который представляет собой полярный апротонный растворитель. В одном из воплощений полярный апротонный растворитель выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF), диметилацетамида, N-метил-2-пирролидона и гексаметилфосфорамида (НМРА). В одном из воплощений органический растворитель представляет собой диметилсульфоксид (DMSO).

В одном из воплощений карбодиимид, используемый в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH, представляет собой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDAC).

В одном из воплощений способ получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, включает стадию взаимодействия капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с PDPH и EDAC в органике в массовом соотношении полисахарид:PDPH:EDAC примерно 1:5:3.

В одном из воплощений восстанавливающий агент, используемый в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором использует PDPH и EDAC, представляет собой дитиотрейтол (DTT).

В одном из воплощений активация белка носителя в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, включает взаимодействие белка носителя с бромуксусной кислотой.

В одном из воплощений стадия выделения активированного полисахарида серотипа 5 или 8 в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, включает диафильтрацию.

В одном из воплощений способ получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, включает стадию гидролиза конъюгата полисахарида серотипа 5 и 8 с белком носителем для удаления непрореагировавших активационных групп. В одном из воплощений стадия гидролиза конъюгата полисахарида серотипа 5 и 8 с белком носителем включает добавление гидрохлорида цистеамина.

В одном из воплощений способ получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, дополнительно включает выделение иммуногенного конъюгата, содержащего выделенный капсулярный полисахарид S.aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с белком носителем.

В одном из воплощений выделение конъюгата полисахарида серотипа 5 и 8 с белком носителем включает диафильтрацию.

В одном из воплощений белок-носитель, используемый в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, содержит CRM₁₉₇.

В одном из воплощений CRM₁₉₇ в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с CRM₁₉₇, в котором используют PDPH и EDAC, добавляют в массовом соотношении CRM₁₉₇:молекула капсулярного полисахарида примерно 1:1.

В одном из воплощений активированный капсулярный полисахарид типа 5 или 8, используемый в способе получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, имеет размер от примерно 50 кДа до примерно 500 кДа.

В одном из воплощений иммуногенный конъюгат, получаемый способом получения конъюгата капсулярного полисахарида серотипа 5 или 8 с белком носителем, в котором используют PDPH и EDAC, имеет размер между примерно между 400 кДа и примерно 5000 кДа.

В одном из воплощений в этом изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгат капсулярного полисахарида типа 5 или 8 с белком носителем, получаемым любым описанным здесь способом.

В одном из воплощений в этом изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгат капсулярного полисахарида типа 5 или 8 с белком носителем, получаемый любым описанным здесь способом, и по меньшей мере один адъювант, разбавитель или носитель. В одном из воплощений иммуногенные композиции содержат адъювант на основе алюминия, который может быть выбран из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. В одном из воплощений описанные здесь иммуногенные композиции содержат адъювант, представляющий собой фосфат алюминия.

Описанные здесь иммуногенные композиции могут содержать менее 30% и менее 20% свободного полисахарида типа 5 или 8 по сравнению с суммарным количеством полисахарида типа 5 или 8. Описанные здесь иммуногенные композиции можно хранить в воде или в буфере с низкой ионной силой с нейтральным рН.

В одном из воплощений в этом изобретении предложен способ редуцирования или предупреждения стафилококковой инфекции, заболевания или состояния, ассоциированного с бактериями Staphylococcus, у субъекта, включающий стадию введения терапевтического или профилактического количества иммуногенной композиции, как она описана здесь, этому субъекту. В одном из воплощений инфекция, заболевание или состояние выбраны из группы, состоящей из инвазии Staphylococcus aureus, сепсиса и носительства.

В одном из воплощений в этом изобретении предложен способ редуцирования или предупреждения стафилококковой инфекции у субъекта, проходящего хирургическую процедуру, включающий стадию введения профилактически эффективного количества иммуногенной композиции, как она описана здесь, этому субъекту перед хирургической процедурой.

В одном из воплощений способ по этому изобретению включает замену CDT на CDI.

В одном из воплощений в этом изобретении предложен капсулярный полисахарид Staphylococcus aureus типа 5 или 8, имеющий молекулярную массу между 50 кДа и 800 кДа, ковалентно связанный с белком носителем, где объединенная молекулярная масса полисахарида, ковалентно связанного с белком носителем, находится между примерно 400 кДа и 5000 кДа.

В одном из воплощений полисахарид, ковалентно связанный с белком носителем, содержит полисахаридную часть, которая имеет диапазон молекулярных масс между 70 кДа и 300 кДа. В одном из воплощений полисахарид, ковалентно связанный с белком носителем, имеет диапазон молекулярных масс между 500 кДа и 2500 кДа.

В одном из воплощений часть, представляющая собой белок носитель, полисахарида, ковалентно связанного с белком носителем, содержит CRM₁₉₇. В одном из воплощений CRM₁₉₇ ковалентно связан с полисахаридом посредством карбаматной связи, амидной связи или их обеих. В некоторых воплощениях молярное соотношение конъюгированных лизинов к CRM₁₉₇ составляет от примерно 10:1 до примерно 25:1. В некоторых воплощениях полисахарид, ковалентно связанный с белком носителем, содержит по меньшей мере одну ковалентную связь с CRM₁₉₇ по меньшей мере на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В некоторых воплощениях полисахарид, ковалентно связанный с белком носителем, содержит по меньшей мере одну связь между CRM₁₉₇ и полисахаридом, которая приходится на каждые 5 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В некоторых воплощениях CRM₁₉₇ часть полисахарида, ковалентно связанного с CRM₁₉₇, содержит от 5 до 22 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В некоторых воплощениях CRM₁₉₇ часть полисахарида, ковалентно связанного с CRM₁₉₇, содержит от 5 до 23 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В некоторых воплощениях CRM₁₉₇ часть полисахарида, ковалентно связанного с белком носителем, содержит от 8 до 15 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом. В некоторых воплощениях CRM₁₉₇ часть полисахарида, ковалентно связанного с белком носителем, содержит от 8 до 12 лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом.

В одном из воплощений в этом изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая полисахарид S.aureus типа 5 или 8, ковалентно связанный с белком носителем, как он описан здесь, и по меньшей мере один адъювант, разбавитель, или носитель.

В одном из воплощений в этом изобретении предложен способ введения иммуногенной композиции, содержащей полисахарид S.aureus типа 5 или 8, ковалентно связанный с белком носителем, как он описан здесь, субъекту для получения иммунного ответа, как описано здесь.

В одном из воплощений в этом изобретении предложен способ выделения полисахарида с молекулярной массой между 20 кДа и 1000 кДа.

В одном из воплощений в этом изобретении предложено антитело, генерируемое капсулярным полисахаридом, иммуногенным конъюгатом или иммуногенной композицией по настоящему изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Настоящее изобретение будет лучше понято, и иные признаки, аспекты и преимущества, чем те, что указаны выше, станут очевидными при рассмотрении его нижеследующего подробного описания. В этом подробном описании делаются ссылки на следующие графические материалы.

Фиг.1 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 8 (N-ацетилманнозаминуроновая кислота обозначена как ManNAca, N-ацетил-L-фукозамин обозначен как L-FucNAc, и N-ацетил-D-фукозамин обозначен как D-FucNAc).

Фиг.2А показывает анализ фракций при ионообменной хроматографии (Q-Сефароза) капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 8 (анализ O-ацетила) и тейхоевой кислоты (анализ фосфата); Фиг.2Б показывает анализ фракций при ионообменной хроматографии (Q-Сефароза) капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 8 способом двойной иммунодиффузии.

Фиг.3А показывает влияние рН (3, 5, 4 или 5) при 95°С на снижение молекулярной массы капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 8 при тепловой обработке; Фиг.3Б показывает влияние температуры (55°С, 75°С или 95°С) при рН 3,5 на снижение молекулярной массы капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 8 при тепловой обработке.

Фиг.4 показывает молекулярную массу очищенного капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 8 по сравнению с капсулярным полисахаридом серотипа 5 с течением времени в ходе нагревания при рН 3,5 и 4,5, соответственно, и 95°С.

Фиг.5 показывает повышенное выживание мышей, которые получали конъюгат капсулярного полисахарида серотипа 8 с CRM₁₉₇ (ромбики) при сравнении с контролями, которые получали AlPO₄ (кружки).

Фиг.6 показывает повторяющуюся полисахаридную структуру полисахарида S.aureus серотипа 5 (N-ацетилманнозаминуроновая кислота обозначена как ManNAcA, N-ацетил-L-фукозамин обозначен как L-FucNAc, и N-ацетил-D-фукозамин обозначен как D-FucNAcA).

Фиг.7А показывает анализ фракций при ионообменной хроматографии (Q-Сефароза) полисахарида S.aureus серотипа 5 (анализ O-ацетила) и тейхоевой кислоты (анализ фосфата); Фиг.7Б показывает анализ фракций при ионообменной хроматографии (Q-Сефароза) полисахарида S.aureus серотипа 5 способом двойной иммунодиффузии.

Фиг.8А показывает влияние рН (3,5, 4 или 5) при 95°С на снижение молекулярной массы капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 5 при тепловой обработке; Фиг.8Б показывает влияние температуры (55°С, 75°С или 95°С) при рН 3,5 на снижение молекулярной массы капсулярного полисахарида S.aureus серотипа 5 при тепловой обработке.

Фиг.9 показывает ослабление пиелонефрита у мышей, которые получали конъюгат полисахарида серотипа 5 с CRM₁₉₇ по сравнению с контролями, которые получали забуференный фосфатами физиологический раствор (PBS) (затемненная область представляет обработанных мышей).

Фиг.10 показывает колониеобразующие единицы (КОЕ), выделенные из почек после заражения S. aureus PFESA0266 мышей, вакцинированных высокомолекулярным (HMW) CP5-CRM, низкомолекулярным (LMW) CP5-CRM или контрольным PP5-CRM.

Фиг.11 показывает сравнение титров ОРА (геометрические средние) из сывороток, полученных от мышей, вакцинированных разными композициями полисахаридного конъюгата (высокомолекулярный (HMW) CP5-CRM, низкомолекулярный (LMW) CP5-CRM). Группы состояли из 5-9 мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общий обзор

Настоящее изобретение относится к иммуногенным конъюгатам, содержащим капсулярные полисахариды S. aureus серотипа 5 или 8, конъюгированные с белками носителями, и к способам их получения и применения. Новые признаки иммуногенных конъюгатов по этому изобретению включают в себя профили молекулярной массы полисахаридов и получаемых конъюгатов, соотношение конъюгированных лизинов на белке носителе CRM₁₉₇ и числа лизинов, ковалентно связанных с полисахаридом, число ковалентных связей между белком носителем и полисахаридами как функцию повторяющихся единиц полисахарида и относительное количество свободного полисахарида по сравнению с общим полисахаридом. Термин ″свободный полисахарид″ при использовании здесь означает полисахарид, который не конъюгирован с белком носителем, но, тем не менее, присутствует в конъюгатной композиции.

Способы получения иммуногенных конъюгатов по этому изобретению включают ковалентное конъюгирование капсулярных полисахаридов с белками носителями посредством химической конъюгации с участием CDI (1,1-карбонилдиимидазол), CDT (1,1-карбоил-ди-1,2,4-триазол) или PDPH (3-(2-пиридилдитио)-пропионилгидразид). CDI специфичен только для конъюгации СР8. Использование CDI/CDT имеет результатом одноуглеродный или нуль-углеродный линкер между капсулярным полисахаридом и белком носителем, в то время как использование PDPH имеет результатом ковалентную тиоэфирную связь между капсулярным полисахаридом и белком носителем.

Дополнительные поперечные линкеры для -SH (тиолированный СР) к -NH₂ связям включают, без ограничения ими, следующие: сульфо-LC-SMPT; сульфо-LC-SMPT (4-сульфосукцинимидил-6-метил-а-(2-пиридилдитио)-толуамидо]гексаноат)); сульфо-KMUS (N-[k-малеимидоундеканоилокси]-сульфосукцинимидный эфир); сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинимидил-6-(3'-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат), который расщепляется тиолами; сульфо-SMPB (сульфосукцинимидил-4-[п-малеимидофенил]бутират); сульфо-SIAB (N-сульфосукцинимидил[4-йодацетил]аминобензоат); сульфо-EMCS ([N-е-малеимидокапроилокси]-сульфосукцинимидный эфир); ЕМСА (N-е-малеимидокапроевая кислота); сульфо-SMCC (сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат); сульфо-MBS (м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир); сульфо-GMBS (N-[g-малеимидобутирилокси]сульфосукцинимидный эфир); ВМРА (N-β-малеимидопропионовая кислота); 2-иммунотиолана гидрохлорид; 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты N-сукцинимидиловый эфир; 3-малеимидопропионовой кислоты N-сукцинимидиловый эфир; 4-малеимидомасляной кислоты N-сукцинимидиловый эфир; SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-метил-а-[2-пиридилдитио]толуол)); LC-SMCC (сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбокси-[6-амидокапроат]); KMUA (N-k-малеимидоундекановая кислота); LC-SPDP (сукцинимидил-6-(3-[2пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат); SMPH (сукцинимидил-6-[β-малеимидопропионамидо]гексаноат); SMPB (сукцинимидил-4-[п-малеимидофенил]бутират); SIAB (N-сукцинимидил-[4-йодацетил]-аминобензоат); EMCS ([N-е-малеимидокапроилокси]-сукцинимидный эфир); SMCC (сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1 -карбоксилат); MBS (м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир); SBAP (сукцинимидил-3-[бромацетамидо]пропионат); BMPS (N-[β-малеимидопропилокси]сукцинимидный эфир); AMAS (N-(a-малеимидоацетокси)сукцинимидный эфир); SIA (N-сукцинимидилйодацетат) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)-аминобензоат.

Агенты можно также поперечно связывать, используя поперечные линкеры от групп -SH к группам -ОН. Такие поперечные линкеры включают, без ограничения, РМР1 (N-[п-малеимидофенил]изоцианат).

Композиции и способы, описанные здесь, являются полезными во многих применениях. Например, конъюгаты можно использовать в получении конъюгатных иммуногенных композиций для защиты реципиентов от инфекций S.aureus. Альтернативно, различные конъюгаты можно использовать в получении антител против бактериальных капсулярных полисахаридов, которые затем можно использовать в исследовательских и клинических лабораторных анализах, таких как детектирование и серотипирование бактерий. Такие антитела можно также использовать для создания пассивного иммунитета у субъекта. В некоторых воплощениях антитела, полученные против бактериальных полисахаридов, являются функциональными либо в моделях эффективности на животном, либо в анализе опсонофагоцитарного умерщвления.

Если не указано иначе, все использованные здесь технические и научные термины имеют то же значение, как они понимаются обычным специалистом в области, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и вещества, такие же, как те, что описаны здесь, или эквивалентные им, можно использовать в практике или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и вещества раскрыты здесь. В описании воплощений и формуле этого изобретения будет использована определенная терминология в соответствии с определениями, указанными ниже. При использовании здесь формы единственного включают в себя отсылки к множественному числу, если контекст не диктует четко обратное. Таким образом, например, отсылки к "способу" включают в себя один или более чем один способ и/или стадию описанного здесь типа и/или становящихся очевидными обычному специалисту в данной области при чтении этого описания и так далее.

При использовании здесь "примерно" означает в пределах статистически значимого диапазона величин, таких как указанный диапазон концентраций, временная рамка, молекулярная масса, температура или рН. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, в типичных случаях в пределах 20%, в более типичных случаях все еще в пределах 10%, и даже в более типичных случаях в пределах 5% данной величины или диапазона. Возможные вариации, охватываемые термином "примерно", должны зависеть от конкретной исследуемой системы, и их может легко оценить обычный специалист в данной области. Всякий раз, когда в этом описании указан диапазон, каждое целое число в этом диапазоне также предусмотрено в качестве воплощения этого изобретения.

Отмечено, что в этом описании такие термины, как "содержит", "содержал", "содержащий", "охватывает", "охватывающий" и тому подобные могут иметь значение, придаваемое им в патентном законодательстве США, например, они могут означать "включает в себя", "включал в себя", "включающий в себя" и тому подобные. Такие термины относятся к введению конкретных ингредиентов или совокупностей ингредиентов без исключения любых других ингредиентов. Такие термины, как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из", имеют значение, придаваемое им в патентном законодательстве США, например, они позволяют включение дополнительных ингредиентов или стадий, которые не умаляют новых или основных характеристик этого изобретения, то есть они исключают дополнительные неуказанные ингредиенты или стадии, которые умаляют новые или основные характеристики этого изобретения, и они исключают ингредиенты или стадии из уровня техники, такие как документы в данной области техники, которые цитируются здесь или включены сюда посредством ссылки, особенно постольку, поскольку цель этого документа состоит в определении воплощений, которые являются патентоспособными, например, новых, неочевидных, изобретательских относительно уровня техники, например относительно документов, цитированных здесь или включенных сюда посредством ссылки. А также термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США; а именно, они являются терминами закрытого типа. Соответственно, эти термины относятся к включению конкретного ингредиента или совокупности ингредиентов и исключению всех других ингредиентов.

Иммуногенные конъюгаты

Как описано выше, настоящее изобретение относится к иммуногенным конъюгатам, содержащим капсулярные полисахариды S.aureus серотипа 5 или 8, конъюгированные с белками носителями. В одном из воплощений этого изобретения предложены иммуногенные конъюгаты, содержащие капсулярный полисахарид S.aureus серотипа 5 или 8, конъюгированный с молекулой или белком носителем, имеющие один или более из следующих признаков: полисахарид имеет молекулярную массу между 50 кДа и 700 кДа; иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу между 500 кДа и 2500 кДa; и конъюгат содержит менее чем примерно 30% свободного полисахарида относительно суммарного полисахарида. В некоторых воплощениях полисахарид имеет молекулярную массу между 20 кДа и 1000 кДа. В некоторых воплощениях иммуногенный конъюгат имеет молекулярную массу между 200 кДа и 5000 кДа. В других воплощениях конъюгат содержит менее чем примерно 25%, примерно 20%, примерно 15%, примерно 10% или примерно 5% свободного полисахарида относительно суммарного полисахарида.

"Конъюгаты" при использовании здесь содержат капсулярный полисахарид, обычно с желаемым диапазоном молекулярных масс, и белок-носитель, причем капсулярный по