Пептиды ттк и вакцины, их содержащие

Пептиды ттк и вакцины, их содержащие

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/216017, поданной 11 мая 2009 г., включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, конкретнее к области терапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые крайне эффективны в качестве вакцин против рака и в качестве лекарственных средств для лечения и предупреждения опухолей.

Предшествующий уровень техники

Показано, что CD8-позитивные CTL распознают эпитопные пептиды, происходящие из опухоль-ассоциированных антигенов (TAA), обнаруживаемых на молекулах класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC), и затем уничтожают клетки опухоли. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA было открыто множество других антигенов TAA, в первую очередь, с помощью иммунологических исследований (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3):725-9). Некоторые из указанных TAA в настоящее время проходят клинические испытания в качестве иммунотерапевтических мишеней.

Идентификация новых ТАА, способных вызывать сильные и специфические иммунные ответы против опухолей, служит основанием для дальнейшего развития клинического применения стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака

К сожалению, многие из противораковых вакцин, проходящих в настоящее время испытания, показывают лишь низкую частоту объективных ответов

Соответственно, сохраняется потребность в новых ТАА в качестве мишеней для иммунотерапии.

С этой целью был идентифицирован ряд генов, активированных при мелкоклеточном раке легких (SCLC) (PTL 1/WO2007/013665) и раке пищевода (PTL 2/WO2007/013671), посредством исследований профилей экспрессии генов с использованием масштабных геномных кДНК-микрочипов. Эти гены широко изучаются с целью определения среди них приемлемых кандидатов в качестве мишеней для иммунотерапии. Для специфического нацеливания на раковые клетки при иммунотерапии предпочтительные ТАА должны экспрессироваться, в первую очередь, раковыми клетками при ограниченной или при отсутствии экспрессии нормальными здоровыми тканями.

Предпочтительными ТАА в качестве мишеней иммунотерапии являются ТАА, которые необходимы для пролиферации и выживания раковых клеток. Такие ТАА могут минимизировать хорошо описанный риск ускользания от иммунного ответа раковых клеток, вызванный делецией, мутацией или подавлением ТАА, как следствие терапевтически управляемой иммунной селекции.

Используя анализ профиля экспрессии генов масштабным геномным микрочипированием кДНК, содержащим 23040 генов, определили ТТК-протеинкиназу (ТТК) в качестве одного из генов, активированных при раке легких (NPL3/Kikuchi et al., Int. Oncol. 2006 Apr; 28(4):799-805). Экспрессия ТТК специфически активирована в опухолевых клетках у более чем 80% пациентов с раком легких и раком пищевода. В то же время ТТК не экспрессирована в других нормальных органах, за исключением яичек. Совокупность данных фактов позволяет предположить, что ТТК могут применяться в качестве мишени иммунотерапии рака у пациентов с опухолями, при которых активированы ТТК. Пептиды, полученные из ТТК, которые обладают способностью индуцировать CTL против раковых клеток, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 предварительно раскрыты (см. WO2008/102557 (PTL3), результаты которой воспроизведены в настоящем описании в виде фиг.4).

Список литературы

Патентная литература

Непатентная литература

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, по крайней мере, частично, основано на открытии новых пептидов, которые могут служить в качестве мишеней иммунотерапии. Так как в общем случае ТАА воспринимаются иммунной системой как «собственные» и, следовательно, не обладают иммуногенностью, обнаружение соответствующих мишеней является крайне важным. Как уже отмечалось, ТТК (типичная аминокислотная последовательность и генная последовательность показаны в SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:39, соответственно, но не ограничены перечисленным, и типичная генная последовательность также доступна, например, из GenBank Accession No. NM_003318) идентифицирована как сверхэкспрессированная при раке, включая, но не ограничиваясь перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Таким образом, настоящее изобретение сфокусировано на ТТК как на соответствующем маркере рака и кандидате мишени иммунотерапии.

Настоящее изобретение относится к идентификации специфических эпитопных пептидов генного продукта ТТК, которые обладают способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), специфические для ТТК. Как обсуждается подробно далее, периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC), полученные от здорового донора, стимулировали, используя HLA-A*0201-связывающие кандидатные пептиды, полученные из ТТК. Затем были установлены линии CTL со специфической цитотоксичностью против HLA-A2-позитивных клеток-мишеней, подвергшихся воздействию в импульсном режиме каждого из испытуемых пептидов. Среди линий CTL, линии CTL, индуцированные пептидами, имеющими аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, демонстрируют значительную специфическую цитотоксичность против клеток, экспрессирующих HLA-А*0201 и ТТК. Данные результаты демонстрируют, что указанные пептиды (особенно пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3) представляют собой HLA-A2-ограниченные эпитопные пептиды, которые могут вызывать сильный и специфический иммунный ответ против клеток, экспрессирующих ТТК. Дополнительно, полученные результаты показывают, что ТТК высоко иммуногенны и их эпитопы представляют собой эффективные мишени для иммунотерапии опухоли/рака.

Соответственно, цель настоящего исследования представить выделенные пептиды, которые связывают HLA-антиген, в частности пептиды, которые включают аминокислотную последовательность ТТК (например, SEQ ID NO:40) или их иммунологически активные фрагменты. Указанные пептиды, как ожидают, обладают способностью индуцировать CTL и, таким образом, могут быть использованы для индуцирования CTL ex vivo, или могут быть введены индивидууму для вызова иммунных ответов против рака, такого как рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Предпочтительные пептиды представляют собой пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

Пептиды по настоящему изобретению охватывают пептиды, в которых одна, две или более аминокислот замещены, удалены и/или добавлены, до тех пор, пока модифицированные пептиды сохраняют исходную способность индуцировать CTL.

Настоящее изобретение также представляет выделенные полинуклеотиды, кодирующие любые пептиды по настоящему изобретению. Указанные полинуклеотиды, также как и пептиды по настоящему изобретению, могут быть использованы для индуцирования или получения APC со способностью индуцировать CTL, или могут быть введены индивидууму для вызова иммунных ответов против рака.

При введении индивидууму пептиды по настоящему изобретению предпочтительно презентированы на поверхности АРС, для того, чтобы индуцировать CTL, нацеленные на соответствующие пептиды. Соответственно, дополнительная цель настоящего изобретения представить средства или композиции, которые индуцируют CTL, такие средства или композиции включают один или несколько пептидов по настоящему изобретению, или полинуклеотиды, кодирующие такие пептиды. Настоящее изобретение дополнительно охватывает фармакологические средства или композиции, включающие один или несколько пептидов по настоящему изобретению, или полинуклеотидов, кодирующих такие пептиды, приготовленные для лечения и/или профилактики рака, а также для предупреждения его послеоперационного рецидива, где указанные виды рака включают, но не ограничиваются перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рака желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать АРС или экзосомы, которые презентируют любые пептиды по настоящему изобретению вместо/в добавление к пептидам по настоящему изобретению или полинуклеотидам в качестве активных ингредиентов.

Пептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению могут индуцировать АРС, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по настоящему изобретению, например, контактированием АРС, полученного от индивидуума, с пептидом по настоящему изобретению или введением полинуклеотида, кодирующего пептид по настоящему изобретению, в АРС. Указанные АРС обладают высокой способностью индуцировать CTL против целевых пептидов и применяются для иммунотерапии рака. Соответственно, настоящее изобретение включает как способы индуцирования АРС со способностью индуцировать CTL, так и АРС, полученные указанными способами.

Настоящее изобретение представляет способы индуцирования CTL, которые включают стадию совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с АРС или экзосомами, презентирующими один или несколько пептидов по настоящему изобретению на своей поверхности, или стадию введения гена, который включает полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), способный связываться с пептидом по настоящему изобретению. CTL, полученные указанными способами, находят применение в лечении и предупреждении рака, примеры которого включают, но не ограничиваются перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек. Таким образом, настоящее изобретение включает CTL, полученные способами по настоящему изобретению.

Еще одна цель настоящего изобретения представить способы для вызова иммунной реакции против рака у индивидуума, который нуждается в указанном лечении, включающие стадию введения индивидууму средства или композиции, которая содержит полипептид ТТК или его иммунологически активный фрагмент, полинуклеотиды, кодирующие полипептид ТТК, и экзосомы или АРС, презентирующие полипептид ТТК.

Применимость настоящего изобретения распространяется на ряд заболеваний, относящихся или возникающих из-за сверхэкспрессии ТТК, таких как рак, примеры которого включают, но не ограничиваются перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает следующее с [1] по [21]:

[1] Выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

[2] Выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), причем пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, в которой 1, 2 или несколько аминокислот замещены, удалены или добавлены.

[3] Выделенный пептид по [2], который обладает одной или обеими из следующих характеристик:

(а) вторая аминокислота с N-конца представляет собой или модифицирована таким образом, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина и метионина; и

(b) С-концевая аминокислота представляет собой или модифицирована таким образом, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина и лейцина.

[4] Выделенный пептид по любому из пп.[1]-[3], в которых пептид представляет собой нонапептид.

[5] Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.[1]-[4].

[6] Средство для индуцирования CTL, которое содержит один или несколько пептидов по любому из пп.[1]-[4], или один или несколько полинуклеотидов по п.[5].

[7] Фармацевтическое средство для лечения и/или профилактики рака и/или предупреждения его послеоперационного рецидива, которое содержит один или несколько пептидов по любому из пп.[1]-[4] или один или несколько полинуклеотидов по п.[5].

[8] Фармацевтическое средство по п.[7], приготовленное для введения индивидууму, у которого антиген HLA-A представляет собой HLA-A2.

[9] Фармацевтическое средство по п.[8], где HLA-A2 представляет собой HLA-A*0201.

[10] Фармацевтическое средство по п.[7] или [8], которое приготовлено для лечения рака.

[11] Способ для индуцирования антигенпрезентирующих клеток (АРС), обладающих способностью индуцировать CTL, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(а) контактирования АРС с пептидом по любому из пп.[1]-[4] in vivo, ex vivo или in vitro, и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из пп.[1]-[4] в АРС.

[12] Способ индуцирования CTL, включающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(а) совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с АРС, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4],

(b) совместного культивирования CD8-позитивных Т-клеток с экзосомами, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4], и

(с) введения в Т-клетку гена, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), способный связываться с пептидом по любому из пп.[1]-[4].

[13] Выделенная АРС, которая презентирует на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп.[1]-[4].

[14] АРС по п.[13], которая индуцирована способом по п.[11].

[15] Выделенный CTL, который нацелен на пептид по любому из пп.[1]-[4].

[16] CTL по п.[15], который индуцирован способом по п.[12].

[17] Способ вызова иммунной реакции против рака у индивидуума, который включает введение индивидууму средства, содержащего один или несколько пептидов по любому из пп.[1]-[4], один или несколько их иммунологически активных фрагментов или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих пептиды или их фрагменты.

[18] Антитело или его фрагмент против пептидов по любому из пп.[1]-[4].

[19] Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид по любому из пп.[1]-[4].

[20] Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная вектором по п.[19].

[21] Диагностический набор, содержащий пептид по любому из пп.[1]-[4], нуклеотид по п.[5] или антитело по п.[18].

В добавление к вышесказанному, другие цели и особенности настоящего изобретения станут более понятными из последующего подробного описания в сочетании с сопутствующими примерами и чертежами. Таким образом, должно быть понятно, что и вышеизложенная сущность изобретения, и последующее подробное описание, и иллюстрирующие варианты осуществления не ограничивают настоящее изобретение и другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя настоящее изобретение раскрыто в настоящем описании со ссылкой на ряд специфических вариантов осуществления, очевидно, что описание является иллюстрацией изобретения и не предназначено для его ограничения. Могут встречаться различные модификации и способы использования, известные специалисту в области техники, которые находятся в рамках настоящего изобретения, как описано в формуле изобретения. Таким образом, другие цели, особенности, преимущества и эффекты настоящего изобретения станут понятны из сущности и некоторых вариантов осуществления, описанных далее, и будут ясны специалистам в области техники. Указанные цели, особенности, преимущества и эффекты настоящего изобретения станут понятны из описанного ранее в сочетании с примерами, данными, чертежами отдельно или в сочетании со ссылками, включенными в настоящее описание.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и применения настоящего изобретения станут понятными специалистам в области техники при рассмотрении краткого описания чертежей, а также подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, изложенных далее.

[фиг.1] Фиг.1 содержит серии фотографий (a)-(j), изображающих результаты IFN-гамма ELISPOT анализа CTL, которые индуцируют пептидами, происходящими из ТТК. CTL в нижеперечисленных пронумерованных лунках демонстрируют сильную продукцию гамма-IFN по сравнению с контролем: в лунке #1 и #4 стимулированные TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:1) (a), #7 TTK-A02-9-630 (SEQ ID NO:2) (b), #5 TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3) (c), #4, #5, #6 и #7 TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO:6) (d), #5 и #7 TTK-A02-9-142 (SEQ ID NO:15) (e), #7 TTK-A02-9-146 (SEQ ID NO:19) (f), #5, #7 и #8 TTK-A02-9-564 (SEQ ID NO:20) (g), #1, #2 и #5 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:22) (h), #2 TTK-A02-10-542 (SEQ ID NO:34) (i), и #2 TTK-A02-10-661 (SEQ ID NO:35) (j). Клетки в лунках, обозначенных прямоугольником, размножают для создания линий CTL. На чертежах «+» обозначает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме, и «-» обозначает, что отсутствует продукция IFN-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых обработке каким-либо пептидом в импульсном режиме.

[фиг.2a-d] Фиг.2a-d состоит из серий линейных графиков (а)-(d), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISA, демонстрирующие продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:1) (a), TTK-A02-9-630 (SEQ ID NO:2) (b), TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3) (c), и TTK-A02-9-719 (SEQ ID NO:6) (d). Результаты демонстрируют, что CTL линии, созданные стимуляцией каждым пептидом, демонстрируют сильную продукцию интерферона-гамма по сравнению с контролем. На чертежах «+» обозначает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме, и «-» обозначает, что отсутствует продукция IFN-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме.

[фиг.2e-g] Фиг.2e-g состоит из серий линейных графиков (e)-(g), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISA, демонстрирующие продукцию IFN-гамма линиями CTL, стимулированными TTK-A02-9-142 (SEQ ID NO:15) (e) и TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:22) (f), и продукцию IFN-гамма клонами CTL, полученными из линий CTL, стимулированными TTK-A02-9-593 (SEQ ID NO:3), стимуляцией таким же пептидом (g). Результаты демонстрируют, что CTL линии, созданные стимуляцией пептидами ТТК, демонстрируют сильную продукцию интерферона-гамма по сравнению с контролем. На фигурах «+» обозначает продукцию IFN-гамма против клеток-мишеней, подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме, и «-» обозначает, что отсутствует продукция IFN-гамма против клеток-мишеней, не подвергнутых обработке соответствующим пептидом в импульсном режиме.

[фиг.3] Фиг.3 состоит из серий линейных графиков (а)-(с), изображающих специфическую CTL активность против клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют ТТК и HLA-A*0201, и опухолевых клеток, которые HLA-A2-позитивны и сверхэкспрессируют ТТК. COS7-клетки, трансфицированные HLA-A*0201 и непроцессированным геном ТТК, получают в качестве клеток-мишеней в то же время клетки COS7, трансфицированные HLA-A*0201 и непроцессированным геном ТТК, получают в качестве контролей (а) и (b). Также Н1650, опухолевую клеточную линию, которая HLA-A2 позитивна и сверхэкспрессирует ТТК, получают в качестве клеток-мишеней, в то же время опухолевые клеточные линии РС-3 и ТЕ-1, которые HLA-A2-негативны и сверхэкспрессируют ТТК, получают в качестве контролей (с). Линии CTL, созданные ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) (а), и CTL клоны, созданные из линии CTL (b), демонстрируют специфическую CTL-активность против COS7-клеток, трансфицированных и ТТК и HLA-A*0201 (черный ромб). В то же время не определяют специфическую активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих или только HLA-A*0201 (треугольник), или только ТТК (окружность). Клон CTL также демонстрирует специфическую активность CTL против опухолевой клеточной линии (HLA-A2⁺, ТТК⁺):Н1650 клеток (с) (черный прямоугольник). С другой стороны, отсутствует значимая специфическая CTL против клеток-мишеней (HLA-A2^-, ТТК⁺)(треугольник:РС-3, окружность:ТЕ-1).

[фиг.4] Фиг.4 состоит из серии линейных графиков, изображающих специфическое индуцирование активности CTL пептидов, полученных из ТТК, против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих ТТК и HLA-A*0201 (результаты эндоанализа). Графики соответствуют фиг.8b, с, d и е в заявке WO2008/102557.

Описание вариантов осуществления

Хотя какие-либо способы и вещества, похожие или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы на практике или в испытаниях вариантов осуществления настоящего изобретения, в данном документе описаны предпочтительные способы, устройства и вещества. Однако, до описания веществ и способов по настоящему изобретению, нужно понять, что настоящее изобретение не ограничено отдельными размерами, формами, величинами, веществами, методиками, протоколами и т.д., приведенными в настоящем описании, так как они могут различаться в соответствии с общепринятыми экспериментами и оптимизацией. Также должно быть понятно, что терминология, использованная в описании, употребляется только для описания отдельных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которое будет ограничено только формулой изобретения.

I. Определения

Формы единственного и множественного числа, использованные в настоящем описании, означают «по меньшей мере, один», если специально не указано иначе.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок», использованные в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к полимеру аминокислотных остатков. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько из аминокислотных остатков представляет собой модифицированный остаток или остаток, полученный искусственным путем, такой как искусственный химический аналог соответствующей природной аминокислоты, а также природные аминокислотные полимеры.

Термин «аминокислота», использованный в настоящем описании, относится к природным и синтезированным аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционально похожи на природные аминокислоты. Аминокислота может быть L-аминокислотой или D-аминокислотой. Природные аминокислоты представляют собой те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также те, которые модифицируются после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин). Фраза «аминокислотный аналог» относится к соединениям, которые имеют одинаковое химическое строение (альфа-углеродная связь с водородом, карбоксигруппой, аминогруппой и R-группой) с природной аминокислотой, но обладают измененной R-группой или измененными скелетами (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Фраза «аминокислотный миметик» относится к химическим соединениям, которые имеют различное строение, но схожие функции с общепринятыми аминокислотами.

Аминокислоты могут быть обозначены в данном описании общепринятым трехбуквенным кодом, рекомендованным IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

Термины «ген», «полинуклеотиды», «нуклеотиды» и «нуклеиновые кислоты» используются взаимозаменяемо в настоящем описании и, если не указано иначе, подобно аминокислотам указываются общепринятыми односимвольными кодами.

Термин «композиция», использованный в настоящем документе, включает продукт, содержащий специфические ингредиенты в специфических количествах, а также какой-либо продукт, который получают, напрямую или опосредованно, из комбинаций специфических ингредиентов в специфических количествах. Указанный термин в отношении фармацевтической композиции предназначен охватывать продукт, содержащий активный ингредиент (ингредиенты) и неактивный ингредиент (ингредиенты), который образует носитель, а также продукт, который получают, напрямую или опосредованно, посредством комбинации комплексирования или агрегации одного или нескольких ингредиентов, или посредством других типов реакций или взаимодействия одного или более ингредиентов. Соответственно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению охватывает любую композицию, образованную смешиванием соединения по настоящему изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя. Фраза «фармацевтически приемлемый носитель» или «физиологически приемлемый носитель», как использовано в настоящем описании, означает фармацевтически или физиологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включая, но не ограничиваясь перечисленным, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или материал, создающий капсулу, вовлеченный в перенос или транспортировку объекта, нагруженного полифармакофорами, через орган или часть тела к другому органу или части тела.

Если не указано иначе, термин «рак» относится к ракам или опухолям с избыточной экспрессией гена ТТК, примеры которых включают, но не ограничены перечисленным, рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек.

Если не оговорено иначе, термины «цитотоксический Т-лимфоцит», «цитотоксическая Т-клетка» и «CTL», используются взаимозаменяемо в настоящем описании и, если не указано иначе, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать чужеродные клетки (например, опухолевые клетки, вирусные клетки) и вызывать гибель указанных клеток.

Если не оговорено иначе, термин «HLA-А2» соответственно относится к подтипам, таким как HLA-А*0201 и HLA-А*0206.

Если не указано иначе, термин «набор», использованный в настоящем описании, применяют в отношении сочетания реагентов и других веществ. Предполагается, что набор может включать микрочип, кристалл, маркер и т.п. Не предполагается, что термин «набор» ограничивает отдельное сочетание реактивов и/или веществ.

В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению используют в контексте «лечение» рака, лечение подразумевает «эффективность», если приводит к клиническому эффекту, такому как уменьшение экспрессии гена ТТК, или к уменьшению размера, распространенности или возможного метастазирования рака у индивидуума. Если лечение назначают профилактически, «эффективность» означает замедление развития или предупреждение рака посредством предупреждения или смягчения клинических симптомов рака. Эффективность определяют любым известным способом диагностики или лечения отдельного вида рака.

В тех случаях, когда способы и композиции по настоящему изобретению используют в контексте «предупреждение» или «профилактика» рака, указанные термины взаимозаменяемо используют в настоящем документе для обозначения какого-либо действия, которое уменьшает смертность от заболевания или заболеваемость. Предупреждение и профилактика могут происходить «при первичном, вторичном и третичном уровнях предупреждения». В то время как первичное предупреждение и профилактика предотвращают развитие заболевания, вторичный и третичный уровни предупреждения и профилактики включают действия, направленные на предупреждение и профилактику прогрессирования заболевания и остроты симптомов, а также уменьшают отрицательное влияние уже развившегося заболевания восстановлением функции и уменьшением связанных с болезнью осложнений. В качестве альтернативы, предупреждение или профилактика могут включать широкий диапазон профилактических лекарственных средств, способствующих уменьшению тяжести отдельного расстройства. Например, уменьшению пролиферации и метастазирования опухолей.

В контексте настоящего изобретения, лечение, и/или профилактика рака, и/или предупреждение его послеоперационного рецидива включают любые нижеприведенные этапы, такие как хирургическое удаление раковых клеток, подавление роста раковых клеток, обратное развитие или регресс опухоли, индукция ремиссии и подавление возникновения рака, регресс опухоли и уменьшение или подавление метастазов. Эффективное лечение и/или профилактика рака уменьшает смертность и улучшает прогноз индивидуумов, страдающих раком, уменьшает уровни опухолевых маркеров в крови и ослабляет симптомы, сопутствующие раку. Например, уменьшение или смягчение симптомов на 10%, 20%, 30% или более или стабилизация заболевания составляют эффективное лечение и/или профилактику.

В контексте настоящего изобретения, термин «антитело» относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые специфически вступают в реакцию с определенным белком или его пептидом. Антитело может включать человеческие антитела, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или меченные изотопами, и фрагменты антител. Кроме того, антитело использовано в настоящем описании в широком смысле и специфически охватывает интактные моноклональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные из, по меньшей мере, двух интактных антител, и фрагменты антител, если они проявляют необходимую биологическую активность. «Антитело» означает все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

Если не оговорено иначе, все технические и специальные термины, использованные в настоящем описании, имеют одинаковое значение, что понятно специалисту в области техники.

II. Пептиды

Для демонстрации того, что пептиды, происходящие из ТТК, действуют как антиген, распознаваемый CTL, пептиды, полученные из ТТК (SEQ ID NO:40), исследуют для определения, являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными HLA-А2, которые обычно представляют собой HLA аллели (Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994).

Кандидаты HLA-А2 связывающих пептидов, полученных из ТТК, идентифицируют на основании их способностей связываться с HLA-A2. После стимуляции in vitro Т-клеток дендритными клетками (DC), обработанными указанными пептидами в импульсном режиме, CTL могут быть успешно установлены с использованием каждого из перечисленных ниже пептидов:

Перечисленные устойчивые CTL демонстрируют специфическую сильную активность CTL против клеток-мишеней, подвергнутых прерывистому воздействию соответствующих пептидов. Данные результаты демонстрируют, что ТТК представляет собой антиген, распознаваемый CTL, и что исследуемые пептиды представляют собой эпитопные пептиды ТТК, ограниченные HLA-А2.

Далее, CTL, установленные с ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3), показали более сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-А*0201 и ТТК, чем сообщалось ранее. Эти результаты демонстрируют, что ТТК-А02-9-593 (SEQ ID NO:3) является подходящим пептидом для индуцирования сильной специфической CTL-активности против клеток, сверхэкспрессирующих ТТК.

Так как ген ТТК избыточно экспрессирован в раковых клетках, таких как рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, эндометриоз, рак пищевода, рак желудка, рак желудка диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак мягких тканей и рак яичек, и не экспрессирован в большинстве неизмененных органов, он является хорошей целью для иммунотерапии. Таким образом, настоящее изобретение представляет нонапептиды (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептиды (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков), соответствующие CTL-распознаваемым эпитопам ТТК. В качестве альтернативы, настоящее изобретение представляет выделенные пептиды, которые связывают HLA-антигены и индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), пептиды состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:40 или из ее иммунологически активного фрагмента. Предпочтительные примеры нонапептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

В общем случае программное обеспечение, в настоящее время доступное в Интернете, такое как описано в Parker K.C. et al., J Immunol 1 Jan 1994, 152(1):163-75 и Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12:1007-17, может быть использовано для оценки связывающих способностей различных пептидов и HLA-антигенов in silico. Связывающая способность с HLA-антигенами может быть оценена, как описано, например, в ссылках Parker K.C. et al., J Immunol 1 Jan 1994, 152(1):163-75, Kuzushima K. et al., Blood 2001, 98(6):1872-81, Larsen M.V. et al. BMC Bioinformatics 31 Oct 2007; 8:424, Buus S. et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12:1007-17 и Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2:е796, которые суммированы, например, Lafuente E.M. et al., Current Pharmaceutical Design 2009, 15, 3209-3220. Способы для определения аффинности связывания описаны, например, в: Journal of Immunogical Methods, 1995, 185:181-190; Protein Science, 2000, 9:1838-1846. Таким образом, используя указанное программное обеспечение, могут быть выделены иммунологически активные фрагменты, происходящие из ТТК, которые обладают высокой аффинностью связывания с HLA-антигенами. Следовательно, настоящее изобретение охватывает пептиды, состоящие из каких-либо иммунологически активных фрагментов, происходящих из ТТК, которые связываются с HLA-антигенами, определенными, используя описанные известные программы. Пептиды по настоящему изобретению могут быть пептидами, состоящими из полноразмерных ТТК.

Нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению могут быть соединены с дополнительными аминокислотными остатками, если полученный пептид сохраняет способность индуцировать CTL. Аминокислотные остатки, дополненные пептидами по настоящему изобретению, могут быть составлены из любых аминокислот, если они не нарушают способность индуцировать CTL исходного пептида. Следовательно, настоящее изобретение охватывает пептиды, которые получены из ТТК и обладают аффинностью связывания с HLA-антигенами. Указанные пептиды обычно меньше чем приблизительно 40 аминокислот, чаще меньше чем 20 аминокислот, обычно меньше чем 15 аминокислот.

В общем случае изменение одной, двух или нескольких аминокислот в пептиде не будет влиять на функцию пептида, а в некоторых случаях будет даже усиливать требуемое действие исходного белка. На самом деле модифицированные пептиды (т.е. пептиды, составленные из аминокислотных последовательностей, в которых один, два или несколько аминокислотных остатков изменены (т.е. замещены, удалены, добавлены или вставлены в исходную последовательность)) изучили в отношении сохранения биологической активности