Рекомбинантный фактор viii, обладающий повышенной стабильностью

Рекомбинантный фактор viii, обладающий повышенной стабильностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 60/984518, поданной 1 ноября 2007, и предварительной заявке на патент США № 60/991304, поданной 30 ноября 2007, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства в рамках грантов HL 76213 и HL 38199 Национального института здравоохранения. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гемофилия A, наиболее распространенное заболевание среди серьезных наследственных нарушений, связанных с нарушениями свертываемости крови, возникает в результате недостатка или дефекта белка плазмы крови - фактора VIII. На сегодняшний день гемофилия неизлечима, и лечение включает замещающую терапию с применением препаратов из (очищенной) плазмы или рекомбинантного белка.

Фактор VIII циркулирует в крови в виде нековалентно связанного зависимого от ионов металла гетеродимера. В форме такого прокофактора белок содержит тяжелую цепь (HC, heavy chain), включающую домены A1(a1)A2(a2)B, и легкую цепь (LC, light chain), включающую домены (a3)A3C1C2, где строчные буквы a обозначают короткие (~30-40 остатков) участки, богатые кислыми остатками (см. Fay, “Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action,” Blood Rev. 18:1-15 (2004)). Фактор VIII активируется при протеолитическом расщеплении в областях контакта доменов A1A2, A2B и A3A3, катализируемом тромбином или фактором Xa. Продукт данной реакции, фактор VIIIa, представляет собой гетеродимер, включающий субъединицы, обозначаемые как A1, A2 и A3C1C2, который функционирует как кофактор для серин-протеазного фактора IXa при мембранозависимой конверсии зимогена фактора X в сериновую протеазу, фактор Xa (см. Fay, “Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action,” Blood Rev. 18:1-15 (2004)).

Исследования с использованием реконструкции показали, что гетеродимерная структура фактора VIII поддерживается как за счет электростатических, так и за счет гидрофобных взаимодействий (Fay, “Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits,” Arch Biochem Biophys. 262:525-531 (1988); Ansong et al., “Factor VIII A1 Domain Residues 97-105 Represent a Light Chain-interactive Site,” Biochemistry. 45:13140-13149 (2006), и внутрицепное сродство дополнительно усиливается при связывании фактора VIII с фактором фон Виллебранда (Fay, “Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits,” Arch Biochem Biophys. 262:525-531 (1988); Kaufman et al., “Regulation of Factor VIII Expression and Activity by von Willebrand Factor,” Thromb Haemost. 82:201-208 (1999)). Ионы металлов также вносят вклад в сродство внутри цепи и параметры активности (Wakabayashi et al., “Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity,” Biochemistry 40:10293-10300 (2001)). Для приобретения активной конформации фактора VIII необходим кальций. В исследованиях с использованием мутагенеза кальций-связывающий сайт был локализован в сегменте, богатом кислыми остатками в пределах домена A1 (аминокислотные остатки 110-126), и в пределах данной области были идентифицированы конкретные остатки, значимые для координации ионов (Wakabayashi et al., “Residues 110-126 in the A1 Domain of Factor VIII Contain a Ca²⁺ Binding Site Required for Cofactor Activity,” J Biol Chem. 279:12677-12684 (2004)). Недавние исследования с помощью рентгеноструктурного анализа промежуточного разрешения (Shen et al., “The Tertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII,” Blood 111:1240-1247 (2008)) подтвердили наличие такого кальций-связывающего сайта, а также позволили предположить наличие второго потенциального сайта в пределах домена A2. Анализ структуры также показал связывание двух сайтов для ионов меди 1-го типа в пределах доменов A1 и A3. Проведенные ранее функциональные исследования показали, что ионы меди способствуют объединению тяжелых и легких цепей с образованием димера, увеличивая внутрицепное сродство в несколько раз при физиологических значениях pH (Fay et al., “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Wakabayashi et al., “pH-dependent Association of Factor VIII Chains: Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu²⁺,” Biochim Biophys Acta. 1764:1094-1101 (2006); Ansong et al., “Factor VIII A3 Domain Residues 1954-1961 Represent an A1 Domain-Interactive Site,” Biochemistry 44:8850-8857 (2005)).

Нестабильность фактора VIIIa обусловлена слабыми электростатическими взаимодействиями между субъединицей A2 и димером A1/A3C1C2 (Fay et al., “Human Factor VIIIa Subunit Structure: Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2 Subunit,” J Biol Chem. 266:8957-8962 (1991); Lollar et al., “pH-dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII,” J Biol Chem. 265:1688-1692 (1990)) и приводит к снижению активности фактора Хазы (factor Xase activity) (Lollar et al., “Coagulant Properties of Hybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules,” J Biol Chem. 267:23652-23657 (1992); Fay et al., “Model for the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase: Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis,” J Biol Chem. 271:6027-6032 (1996)). Данные, касающиеся ассоциации субъединицы A2 в факторе VIIIa, ограничены, и, по-видимому, остатки в обоих доменах A1 и A3 способствуют удержанию указанной субъединицы. Было показано, что несколько точечных мутаций в факторе VIII облегчают диссоциацию A2 по сравнению с диким типом и эти остатки локализованы либо в области контакта доменов A1-A2 (Pipe et al., “Mild Hemophilia A Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation: Evidence for Nonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo,” Blood 93:176-183 (1999); Pipe et al., “Hemophilia A Mutations Associated with 1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactions within the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa,” Blood 97:685-691 (2001)), либо в области контакта доменов A2-A3 (Hakeos et al., “Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3 Subunit Interface Destabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy,” Thromb Haemost. 88:781-787 (2002)). Такие мутантные формы фактора VIII демонстрируют различия в результатах одноступенчатого и двухступенчатого анализа (Duncan et al., “Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII Methods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A,” Br J Haematol. 87:846-848 (1994); Rudzki et al., “Mutations in a Subgroup of Patients with Mild Haemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII:C Methods,” Br J Haematol. 94:400-406 (1996)), при значимом снижении значений активности, определенных с помощью последующего анализа, вследствие увеличения скорости диссоциации субъединицы A2.

Изучение домена A фактора VIII в модели, основанной на гомологии с церулоплазмином (Pemberton et al., “A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin,” Blood 89:2413-2421 (1997)), позволило предположить наличие протяженной области контакта между доменом A2 и доменами A1 и A3 с многочисленными потенциальными контактами, участвующими в связывающих взаимодействиях.

Проблема стабилизации фактора VIIIa представляет значительный интерес, поскольку более стабильная форма белка представляет лучшее средство для терапии гемофилии A, потенциально требуя меньших материальных затрат для лечения пациента (Fay et al., “Mutating Factor VIII: Lessons from Structure to Function,” Blood Reviews 19:15-27 (2005)). В связи с этим были описаны препараты фактора VIII, в которых применяли формы рекомбинантного белка с мутациями, предотвращающими диссоциацию субъединицы A2 за счет введения новых ковалентных связей между A2 и другими доменами фактора VIII (Pipe et al., “Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistant Coagulation Factor VIIIa,” Proc Natl Acad Sci USA 94:11851-11856 (1997); Gale et al., “An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa,” J. Thromb. Haemostasis 1:1966-1971 (2003)). Однако после этого было показано, что такого рода мутации могут быть нежелательными в факторе VIII, применяемом в терапевтических целях, поскольку они по существу исключают способы негативной регуляции. Это может стать причиной протромботических состояний, которые могут нанести вред. Таким образом, необходимо увеличить стабильность как фактора VIII, так и фактора VIIIa при снижении до минимума вероятности развития протромботических состояний.

Настоящее изобретение направлено на преодоление этих и других недостатков, известных в данной области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному фактору VIII, содержащему одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности как фактора VIII, так и фактора VIIIa.

Предпочтительно, одна или более мутаций представляет собой замену одного или более заряженных аминокислотных остатков на гидрофобный аминокислотный остаток в одной или обеих областях контакта доменов A1A2 или A2A3. В частности, предпочтительный рекомбинантный фактор VIII согласно настоящему изобретению включает замену остатка Glu287 фактора VIII дикого типа, замену остатка Asp302 фактора VIII дикого типа, замену остатка Asp519 фактора VIII дикого типа, замену остатка Glu665 фактора VIII дикого типа, замену остатка Glu1984 фактора VIII дикого типа, или комбинацию указанных замен.

Второй аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный фактор VIII согласно первому аспекту настоящего изобретения.

Третий аспект настоящего изобретения относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный фактор VIII согласно первому аспекту настоящего изобретения. В данный аспект настоящего изобретения также входят системы для экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащие молекулу ДНК, кодирующую рекомбинантный фактор VIII согласно настоящему изобретению, и рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие молекулу ДНК и/или систему для рекомбинантной экспрессии.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу получения рекомбинантного фактора VIII, включающему: выращивание клетки-хозяина согласно третьему аспекту настоящего изобретения при условиях, в которых клетка-хозяин экспрессирует рекомбинантный фактор VIII; и выделение рекомбинантного фактора VIII.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу лечения гемофилии A у животных. Этот способ лечения включает: введение животному, страдающему гемофилией A, эффективного количества рекомбинантного фактора VIII согласно первому аспекту настоящего изобретения, при этом у животного наблюдается эффективное свертывание крови после повреждения сосудов.

Настоящее изобретение показывает, что ряд заряженных остатков в областях контакта доменов A1A2 и A2A3 не участвует в образовании водородных связей, а напротив данные остатки могут дестабилизировать структуру фактора VIII и/или могут способствовать диссоциации субъединицы A2 после активации прокофактора фактора VIII. Как было показано в прилагаемых Примерах, замена таких заряженных остатков на гидрофобные остатки с целью увеличения внутренней гидрофобной области и уменьшения внутренней гидрофильной области усиливает сродство к связыванию внутри доменов. Показатели стабильности оценивали по активности вариантов фактора VIII при повышенной температуре и по временной динамике снижения активности фактора VIIIa, обусловленного диссоциацией субъединицы A2. Результаты данных исследований показали, что ряд мутаций вызывает увеличение стабильности, что согласуется с устранением дестабилизирующих сил, вероятно вследствие углубления заряда в области контакта домена A2. Такие стабильные варианты фактора VIII и активированный кофактор VIIIa позволят получить средство для лечения гемофилии A с улучшенными характеристиками.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 представляет собой график, иллюстрирующий активность мутантных форм фактора VIII, относительно активности фактора VIII дикого типа (WT), оцененную с помощью одноступенчатого анализа коагулирующей активности (черные столбцы) и двухступенчатого хромогенного анализа образования фактора Xa (серые столбцы). Активность дикого типа и мутантных форм фактора VIII оценивали, как описано в Примерах. Планки погрешностей соответствуют значениям стандартного отклонения, рассчитанным на основании трех независимых измерений.

На фигурах 2A-B показано снижение (потеря) активности фактора VIII дикого типа и его мутантных форм и фактора VIIIa, соответственно. На фигуре 2A фактор VIII (4 нМ) инкубировали при 55°C, и в указанные моменты времени собирали аликвоты и исследовали их с помощью анализа образования фактора Xa, как описано в Примерах. Представлены результаты для дикого типа (пунктирная линия, белые кружки), R282A (белые треугольники), S524A (белые квадраты), N684A (белые ромбы), R531A (черные кружки), S650A (черные треугольники), E287A (черные квадраты) и D302A (черные ромбы). На Фигуре 2B активируемый тромбином фактор VIIIa (4 нМ) в присутствии 40 нМ фактора IXa инкубировали при 23°C, отбирали аликвоты в указанные моменты времени и оценивали активность с помощью анализа образования фактора Xa, как описано в Примерах. Представлены результаты для дикого типа (пунктирная линия, белые кружки), R282A (белые треугольники), S524A (белые квадраты), Y1792F (белые ромбы), N684A (черные кружки), Y1786F (черные треугольники), R531A (черные квадраты), E287A (черные ромбы) и D302A (серые кружки). Результаты для выбранных вариантов с быстрой потерей активности показаны в увеличенном масштабе во вставке на Фигуре 2B.

На фигурах 3A-B представлены результаты электрофореза ДСН-ПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН)) и Вестерн-блот анализа фактора VIII дикого типа и мутантных форм фактора VIII. На Фигуре 3A показаны результаты электрофореза ДСН-ПААГ в 8% полиакриламидном геле очищенных белков мутантных форм фактора VIII и фактора VIII дикого типа (0,77 мкг), окрашенных с помощью GelCode. На фигуре 3B представлены очищенные белки фактора VIII дикого типа и мутантных форм (0,34 мкг), разделенные с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле, перенесенные на мембраны ПВДФ (поливинилиденфторид) и выявленные с помощью меченного биотином антитела R8B12. Полосы визуализировали с помощью хемифлуоресценции, как описано в прилагаемых Примерах. Дикий тип (дорожка 1), Glu272Ala (дорожка 2), Glu272Val (дорожка 3), Asp519Ala (дорожка 4), Asp519Val (дорожка 5), Glu665Ala (дорожка 6), Glu665Val (дорожка 7), Glu1984Ala (дорожка 8) и Glu1984Val (дорожка 9). MW, - маркер молекулярного веса: sFVIII, одноцепочечная форма фактора VIII: HC, тяжелая цепь: LC, легкая цепь. Наблюдаемые стехиометрические соотношения одноцепочечной формы и гетеродимера фактора VIII у дикого типа и мутантных форм фактора VIII составили 0,96 (дикий тип WT), 0,64 (Glu272Ala), 0,92 (Glu272Val), 0,74 (Asp519Ala), 0,8 (Asp519Val), 0,64 (Glu665Ala), 0,63 (Glu665Val), 0,91 (Glue1984Ala) и 0,5 (Glu1984Val).

Фигуры 4A-D иллюстрируют специфичную активность мутантных форм фактора VIII относительно активности фактора VIII дикого типа и результаты анализа образования тромбина. На Фигуре 4A представлены значения активности, определенные с помощью одноступенчатого анализа коагулирующей активности (серые столбцы) и двухступенчатого хромогенного анализа образования фактора Xa (черные столбцы), как описано в прилагаемых Примерах. На Фигурах 4B-C представлена тромбограмма белков фактора VIII. Дикий тип (пунктирная линия), Glu272Ala (белые квадраты), Glu272Val (черные квадраты), Asp519Ala (белые кружки), Asp519Val (черные кружки), Glu665Ala (белые треугольники), Glu665Val (черные треугольники), Glu1984Ala (белые ромбы) и Glu1984Val (черные ромбы). На Фигуре 4D представлены значения параметра, полученные при анализе образования тромбина. Анализ образования тромбина проводили, как описано в прилагаемых Примерах. На тромбограммах представлены средние значения из трех повторностей. Значения параметра выражены в виде величин (%) относительно дикого типа. Фактические значения для дикого типа составили 7,5±0,5 мин (лаг-период), 13,7±0,3 мин (время пика), 157,3±14,7 нМ (величина пика), 979,8±37,9 нМ/мин (эндогенный потенциал тромбина ЭПТ (ETP)). Показаны лаг-период (незаштрихованные столбцы), время пика (серые столбцы), величина пика (черные столбцы) и ЭПТ (заштрихованные столбцы). Планки погрешностей соответствуют значениям стандартного отклонения, рассчитанным на основании трех независимых измерений.

Фигуры 5A-B иллюстрируют снижение активности фактора VIII дикого типа и мутантных форм фактора VIII. Фактор VIII (4 нМ) инкубировали при различных температурах (52-60°C) и в указанные моменты времени отбирали аликвоты и определяли в них активность с помощью анализа образования фактора Xa, как описано в прилагаемых Примерах. Данные аппроксимировали с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов и рассчитывали скорость потери активности. Каждая точка соответствует среднему значению, полученному из трех независимых измерений. Показаны результаты для дикого типа WT (пунктирная линия, крестики), Glu272Ala (белые квадраты), Glu272Val (черные квадраты), Asp519Ala (белые кружки), Asp519Val (черные кружки), Glu665Ala (белые треугольники), Glu665Val (черные треугольники), Glu1984Ala (белые ромбы), Glu1984Val (черные ромбы) и полноразмерный фактор VIII Kogenate (серые кружки). На Фигуре 5A показаны характерные кривые снижения активности для фактора VIII после инкубации при 55°C. На Фигуре 5B представлены графики, иллюстрирующие скорости снижения для фактора VIII при различных температурах. Вставка на Фигуре 5B представляет собой увеличенную область графика снижения в диапазоне температур 52-55°C.

Фигура 6 представляет собой график, иллюстрирующий снижение активности фактора VIII в плазме при 37°C. Фактор VIII (1 нМ) инкубировали при 37°C в плазме, лишенной фактора VIII, и в указанные моменты времени отбирали аликвоты и исследовали их с помощью одноступенчатого анализа коагулирующей активности, как описано в прилагаемых Примерах. Представлены результаты для дикого типа (WT) (пунктирная линия, крестики), Asp519Ala (белые кружки), Asp519Val (черные кружки), Glu665Ala (белые треугольники), Glu665Val (черные треугольники), Glu1984Ala (белые ромбы), и Glu1984Val (черные ромбы). Данные аппроксимировали с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов; каждая точка соответствует среднему значению из трех независимых измерений.

Фигуры 7A-B представляют собой графики, иллюстрирующие снижение активности для фактора VIIIa дикого типа (WT) и мутантной формы в отсутствие или в присутствии фактора IXa. На Фигуре 7A показан активируемый тромбином фактор VIIIa (4 нМ), который инкубировали при 23°C. Отбирали аликвоты в указанные моменты времени и определяли в них активность с помощью анализа образования фактора Xa, как описано в прилагаемых Примерах. На Фигуре 7B показано снижение активности для фактора VIIIa дикого типа и мутантных форм фактора VIIIa в присутствии фактора IXa. Фактор VIII (4 нМ) активировали с помощью тромбина в присутствии 40 нМ фактора IXa. В указанные моменты времени отбирали аликвоты и определяли в них активность с помощью анализа образования фактора Xa, как описано в прилагаемых Примерах. Представлены результаты для дикого типа (пунктирная линия, крестики), Glu272Ala (белые квадраты), Glu272Val (черные квадраты), Asp519Ala (белые кружки), Asp519Val (черные кружки), Glu665Ala (белые треугольники), Glu665Val (черные треугольники), Glu1984Ala (белые ромбы) и Glu1984Val (черные ромбы). Данные аппроксимировали с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов; каждая точка соответствует среднему значению из трех независимых измерений.

Фигура 8 представляет собой график, иллюстрирующий специфичную активность форм фактора VIII с двумя или тремя комбинированными мутациями, в которых остатки Asp519, Glu665 и/или Glu1984 заменены на Ala или Val. Значения активности определяли с помощью одноступенчатого анализа коагулирующей активности (серые столбцы) и двухступенчатого хромогенного анализа образования фактора Xa (черные столбцы), как описано в Примерах. Планки погрешностей соответствуют значениям стандартного отклонения, рассчитанным на основании трех независимых измерений.

Фигура 9 представляет собой график, иллюстрирующий скорость снижения активности для фактора VIII дикого типа и мутантной формы фактора VIII с двумя или тремя комбинированными мутациями, в которых остатки Asp519, Glu665 и/или Glu1984 заменены на Ala или Val. Проводили эксперименты по определению снижения активности фактора VIII и оценивали скорость снижения с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов, как описано в Примерах. Серые столбцы показывают значения скорости относительно одиночных мутантов с наилучшими показателями (см. Пример 5, Фигура 5A), рассчитанные при делении на значение скорости с наилучшим показателем (наименьшим). Например, относительные значения скорости по отношению к одиночному мутанту с наилучшим показателем для двойного мутанта D519AE665A равно значению скорости падения для D519AE665A, деленному на скорость падения для D519A. Черные столбцы обозначают фактические значения параметра скорости снижения, представленные в виде ×10.

Фигура 10 представляет собой график, иллюстрирующий скорость снижения активности фактора VIIIa дикого типа и мутантных форм фактора VIII с двумя или тремя комбинированными мутациями, в которых остатки Asp519, Glu665 и Glu1984 заменены на Ala или Val. Проводили измерения снижения активности фактора VIIIa после инкубации 1,5 нМ фактора VIIIa в отсутствие фактора IXa, и скорости снижения оценивали с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов, как описано в Примерах. Серые столбцы обозначают скорости относительно одиночных мутантов с наилучшими показателями (см. Пример 7, Фигура 7A), и рассчитанные, как описано в пояснениях к Фигуре 9. Черные столбцы обозначают фактические значения параметра скорости снижения, представленные в виде ×10.

Фигуры 11A-B иллюстрируют результаты анализа образования тромбина с использованием комбинированных мутантов. На Фигуре 11A представлена тромбограмма белков фактора VIII. Анализ образования тромбина проводили, как описано в Примерах. Конечные концентрации реагентов составили 0,2 нМ (фактор VIII), 0,5 пМ (рТФ), 4 мкМ (фосфолипидные везикулы PSPCPE), 433 мкМ (флуорогенный субстрат), 13,3 мМ CalCl₂ и 105 нМ (калибровочный маркер тромбина). Представлены результаты для дикого типа (пунктирная линия), D519AE665V (белые кружки), D519VE665V (черные кружки), D519VE1984A (белые треугольники) и D519VE665VE1984A (черные треугольники). На Фигуре 11B представлены значения параметра, полученные при анализе образования тромбина. На тромбограммах представлены средние значения из трех повторностей. Значения параметра выражены в значениях (%) относительно дикого типа. Фактические значения для дикого типа составили 8,5±0,4 мин (лаг-период), 21,3±0,6 мин (время пика), 58,5±15,6 нМ (величина пика), 883,6±199,8 нМ/мин (ЭПТ). Лаг-период (белые столбцы), время пика (серые столбцы), величина пика (черные столбцы) и ЭПТ (заштрихованные столбцы). Планки погрешностей соответствуют значениям стандартного отклонения, рассчитанным на основании трех независимых измерений.

На Фигурах 12A-C представлены значения специфичной активности и скорости снижения активности для фактора VIII и фактора VIIIa относительно дикого типа для мутантов, содержащих Ala или Val вместо остатков Asp519, Glu665 и/или Glu1984 в комбинации с мутацией Glu113Ala. На Фигуре 12A представлена специфичная активность для комбинированных мутантов по сравнению с диким типом, измеренная с помощью одноступенчатого анализа коагулирующей активности (серые столбцы) и двухступенчатого хромогенного анализа образования фактора Xa (черные столбцы), как описано в Примерах. Планки погрешностей соответствуют значениям стандартного отклонения, рассчитанным на основании трех независимых измерений. На Фигуре 12B показаны результаты анализа снижения активности фактора VIII при 55°C; скорости снижения оценивали с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов, как описано в Примерах. На Фигуре 12C представлены результаты измерений снижения активности фактора VIIIa после инкубации 1,5 нМ фактора VIIIa в отсутствие фактора IXa; скорости снижения оценивали с помощью нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов, как описано в Примерах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному фактору VIII, содержащему одну или более мутаций, которые приводят к увеличению стабильности как фактора VIII, так и фактора VIIIa.

Рекомбинантный фактор VIII согласно настоящему изобретению может быть получен путем модификации последовательности аминокислот фактора VIII дикого типа или мутантной формы фактора VIII, модифицированной иным способом для изменения других свойств фактора VIII, таких как антигенность, время полужизни в кровотоке, секреция белка, сродство к фактору IXa и/илифактору X, измененные сайты инактивирующего расщепления фактора VIII, иммуногенности, срока хранения и т.п.

Подходящий фактор VIII дикого типа, который может быть модифицирован согласно настоящему изобретению, может быть получен от различных животных, включающих, без ограничения, млекопитающих, таких как человек (см., например, номер доступа в GenBank AAA52484 (последовательность аминокислот) и K01740 (последовательность нуклеотидов); и номер доступа в GenBank CAD97566 (последовательность аминокислот) и AX746360 (последовательность нуклеотидов), включенные в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме), крысы (см., например, номер доступа в GenBank AAQ21580 (последовательность аминокислот) и AY362193 (последовательность нуклеотидов), включенные в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме), мыши (см., например, номер доступа в GenBank AAA37385 (последовательность аминокислот) и L05573 (последовательность нуклеотидов), включенные в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме), морские свинки, собаки (см., например, номер доступа в GenBank AAB87412 (последовательность аминокислот) и AF016234 (последовательность нуклеотидов); и номер доступа в GenBank AAC05384 (последовательность аминокислот) и AF049489 (последовательность нуклеотидов), включенные в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме), кошки, обезьяны, шимпанзе (см., например, номер доступа в GenBank XP_529212 (последовательность аминокислот) и XM_529212 (последовательность нуклеотидов), включенные в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме), орангутаны, коровы, лошади, овцы, свиньи (см., например, номер доступа в GenBank NP_999332 (последовательность аминокислот) и NM_214167 (последовательность нуклеотидов), включенные в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме), козы, кролики и куры. Эти и другие последовательности также доступны в электронном виде на сайте Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS), на котором также представлено выравнивание последовательности аминокислот белков фактора VIII человека, свиньи, мыши и собаки. Таким образом, консервативность и гомология между белками фактора VIII млекопитающих хорошо известна.

В качестве примера последовательности нуклеотидов кДНК (комплементарной ДНК) для фактора и предполагаемые последовательности аминокислот представлены ниже в SEQ ID № 1 и 2, соответственно. Фактор VIII человека синтезируется в виде одноцепочечного белка около 300 кДа с внутренней гомологией последовательностей, составляющей последовательность «доменов» NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. В молекуле фактора VIII «домен» при использовании в настоящей заявке представляет собой непрерывную последовательность аминокислот, которая характеризуется конкретной последовательностью аминокислот и сайтами протеолитического расщепления тромбином. Если не указано иначе, домены фактора VIII включают следующие аминокислотные остатки при выравнивании последовательностей с последовательностью аминокислот фактора VIII человека (SEQ ID №: 2):

A1, остатки Ala₁-Arg₃₇₂;

A2, остатки Ser₃₇₃-Arg₇₄₀;

B, остатки Ser₇₄₁-Arg₁₆₄₈;

A3, остатки Ser₁₆₉₀-Ile₂₀₃₂;

C1, остатки Arg₂₀₃₃-Asn₂₁₇₂; и

C2, остатки Ser₂₁₇₃-Tyr₂₃₃₂.

Последовательность A3-C1-C2 включает остатки Ser₁₆₉₀-Tyr₂₃₃₂. Оставшуюся последовательность, остатки Glu₁₆₄₉-Arg₁₆₈₉, обычно рассматривают как активирующий пептид легкой цепи фактора VIII. Фактор VIII активируется в результате протеолиза тромбином или фактором Xa, который вызывает его диссоциацию от фактора Виллебранда, с образованием фактора VIIIa, выполняющего функцию прокоагулянта. Биологическая функция фактора VIIIa заключается в усилении каталитической эффективности фактора IXa по отношению к активации фактора X до величины в несколько порядков. Активируемый тромбином фактор VIIIa представляет собой гетеродимер A1/A2/A3-C1-C2 с молекулярной массой 160 кДа, который формирует комплекс с фактором IXa и фактором X на поверхности тромбоцитов или моноцитов. Термин «Частичный домен» в контексте настоящей заявки представляет собой непрерывную последовательность аминокислот, формирующих часть домена.

Ген, кодирующий человеческий фактор VIII дикого типа, имеет следующую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID №:1

gccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgacatagagaagactgacccttggtttgcacacagaacacctatgcctaaaatacaaaatgtctcctctagtgatttgttgatgctcttgcgacagagtcctactccacatgggctatccttatctgatctccaagaagccaaatatgagactttttctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggggacatggtatttacccctgagtcaggcctccaattaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttgatttcaaagtttctagtacatcaaataatctgatttcaacaattccatcagacaatttggcagcaggtactgataatacaagttccttaggacccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccactctatttggcaaaaagtcatctccccttactgagtctggtggacctctgagcttgagtgaagaaaataatgattcaaagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcgtcaacagagagtggtaggttatttaaagggaaaagagctcatggacctgctttgttgactaaagataatgccttattcaaagttagcatctctttgttaaagacaaacaaaacttccaataattcagcaactaatagaaagactcacattgatggcccatcattattaattgagaatagtccatcagtctggcaaaatatattagaaagtgacactgagtttaaaaaagtgacacctttgattcatgacagaatgcttatggacaaaaatgctacagctttgaggctaaatcatatgtcaaataaaactacttcatcaaaaaacatggaaatggtccaacagaaaaaagagggccccattccaccagatgcacaaaatccagatatgtcgttctttaagatgctattcttgccagaatcagcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagtccaaagcaattagtatccttaggaccagaaaaatctgtggaaggtcagaatttcttgtctgagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagagatggtttttccaagcagcagaaacctatttcttactaacttggataatttacatgaaaataatacacacaatcaagaaaaaaaaattcaggaagaaatagaaaagaaggaaacattaatccaagagaatgtagttttgcctcagatacatacagtgactggcactaagaatttcatgaagaaccttttcttactgagcactaggcaaaatgtagaaggttcatatgacggggcatatgctccagtacttcaagattttaggtcattaaatgattcaacaaatagaacaaagaaacacacagctcatttctcaaaaaaaggggaggaagaaaacttggaaggcttgggaaatcaaaccaagcaaattgtagagaaatatgcatgcaccacaaggatatctcctaatacaagccagcagaattttgtcacgcaacgtagtaagagagctttgaaacaattcagactcccactagaagaaacagaacttgaaaaaaggataattgtggatgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacacagatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaatagatctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgaccagggtcctattccaagacaactcttctcatcttccagcagcatcttatagaaagaaagattctggggtccaagaaagcagtcatttcttacaaggagccaaaaaaaataacctttctttagccattctaaccttggagatgactggtgatcaaagagaggttggctccctggggacaagtgccacaaattcagtcacatacaagaaagttgagaacactgttctcccgaaaccagacttgcccaaaacatctggcaaagttgaattgcttccaaaagttcacatttatcagaaggacctattccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagccttcttcagggaacagagggagcgattaagtggaatgaagcaaacagacctggaaaagttccctttctgagagtagcaacagaaagctctgcaaagactccctccaagctattggatcctcttgcttgggataaccactatggtactcagataccaaaagaagagtggaaatcccaagagaagtcaccagaaaaaacagcttttaagaaaaaggataccattttgtccctgaacgcttgtgaaagcaatcatgcaatagcagcaataaatgagggacaaaataagcccgaaatagaagtcacctgggcaaagcaaggtaggactgaaaggctgtgctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga

Человеческий фактор VIII дикого типа, кодируемый SEQ ID №:1, имеет следующую последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID №:2:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYEGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

В представленной выше последовательности некоторые заряженные остатки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, в том числе Glu287, Asp302, Asp519, Glu665 и Glu1984.

Рекомбинантный фактор VIII согласно настоящему изобретению характеризуется заменой одного или более заряженных аминокислотных остатков на гидрофобный аминокислотный остаток в одной или обеих областях контакта доменов A1A2 или A2A3. Предпочтительно замещаемый заряженный остаток представляет собой либо остаток Glu или Asp, который не участвует в образовании водородных связей между доменами A1A2 или A2A3. Гидрофобный аминокислотный остаток, который замещает заряженный остаток, может представлять собой любой остаток из Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe или Trp. Особенно предпочтительный рекомбинантный фактор VIII согласно настоящему изобретению включает замену остатка Glu287 фактора VIII дикого типа, замену остатка Asp302 фактора VIII дикого типа, замену остатка Asp519 фактора VIII дикого типа, замену остатка Glu665 фактора VIII дикого типа, замену остатка Glu1984 фактора VIII дикого типа или комбинацию указанных замен. Замены D302A, E287A, E665A, E665V, D519A, D519V, E1984A и E1984V являются предпочтительными для получения рекомбинантного фактора VIII, обладающего повышенной стабильностью как фактора VIII, так и фактора VIIIa. Предпочтительные комбинации таких замен включают, без ограничения, двойные мутанты D519AE665V, D519VE665V и D519VE1984A, а также тройные мутанты D519AE665VE1984A и D519VE665VE1984A. Предполагается, что повышенная стабильность таких мутантных форм достигается за счет стабилизации внутридоменной области фактора VIII, а также уменьшения диссоциации субъединицы A2 от A1/A3C1C2, в сравнении с фактором VIIIa дикого типа.

Подходящие последовательности мутантной формы фактора VIII, которые могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению, могут также включать любые известные ранее или идентифицированные впоследствии последовательности фактора VIII, обладающие модифицированными свойствами в отношении различных характеристик, включающих, без ограничения, антигенность, время полужизни в кровотоке, секрецию белка, сродство к фактору IXa и/или фактору X, измененные сайты инактивирующего расщепления фактора VIII, стабильность активированной формы фактора VIII, иммуногенность и срок хранения.

Один из примеров подходящего мутантного фактора VIII, который может быть модифицирован согласно настоящему изобретению, представляет собой фактор VIII, имеющий модифицированный кальций-связывающий сайт, предпочтительно по остатку 113 в SEQ ID №: 2. Примеры мутантов такого типа описаны в публикации заявки на патент США № 10/581471, авторы Fay и др., включенной в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Предпочтительно, мутант по остатку 113 также модифицирован в соответствии с одной или более мутациями, описанными выше (например, по положениям 287, 302, 519, 665 и/или 1984), с целью увеличения стабильности/увеличения специфичной активности белка фактора VIII. Примеры белков фактора VIII с высокой стабильностью/высокой специфичной активностью включают, без ограничения, белки с комбинированными заменами E113AD519A, E113AD519V, E113AE665A, E113AE665V или E113AE1984V.

Второй пример подходящего мутантного фактора VIII, который может быть модифицирован согласно настоящему изобретению, представляет собой лишенный B-д