Модифицированные f протеины sv и способы их применения

Модифицированные f протеины sv и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Для данной заявки испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США под регистрационным № 61/121126, поданной 9 декабря 2008 г., предварительной заявки под регистрационным № 61/169077, поданной 14 апреля 2009 г., и предварительной заявки под регистрационным № 61/224787, поданной 10 июля 2009 г., каждая из которых во всех аспектах полностью включена в настоящее описание путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к модифицированным или мутированным слитым (F) протеинам респираторного синцитиального вируса и способам их получения и использования, включая иммуногенные композиции, такие как вакцины, для лечения и/или предотвращения инфекции RSV.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Респираторный синцитиальный вирус (RSV) является членом рода Pneumovirus семейства Paramyxoviridae. Человеческий RSV (HRSV) является ведущим возбудителем тяжелого заболевания нижних дыхательных путей у маленьких детей и ответственен за значительную заболеваемость и смертность у людей. RSV также признан важным возбудителем заболеваний у взрослых и пожилых людей с нарушениями иммунитета. Ввиду неполной устойчивости к RSV у инфицированного хозяина после естественной инфекции RSV может инфицировать множество раз в течение жизни в детском и взрослом возрасте.

Данный вирус имеет геном, состоящий из однонитевой негативно-смысловой РНК, которая тесно ассоциирована с вирусным протеином для образования нуклеокапсида. Вирусная оболочка состоит из липидной двухслойной структуры плазматической мембраны, которая содержит изменчиво кодированные структурные протеины. Вирусная полимераза упаковывается с вирионом и транскрибирует геномную РНК в мРНК. Геном RSV кодирует 3 трансмембранных структурных протеина, F, G и SH, 2 матричных протеина, M и M2, 3 нуклеокапсидных протеина N, P и L, и 2 неструктурных протеина, NSl и NS2.

Считается, что слияние HRSV и клеточных мембран происходит на клеточной поверхности и представляет собой необходимую стадию для передачи вирусного рибонуклеопротеина в клеточную цитоплазму во время ранних стадий инфекции. Данный процесс опосредуется слитым (F) протеином, который также способствует слиянию мембраны инфицированных клеток с мембраной соседних клеток для образования характерного синцития, что представляет собой и выраженный цитопатический эффект, и дополнительный механизм вирусного распространения. Соответственно, нейтрализация активности слияния важна для иммунитета хозяина. Действительно, было показано, что моноклональные антитела, вырабатываемые против F протеина, нейтрализуют инфекционность вируса и ингибируют слияние мембран (Calder et al., 2000, Virology 271: 122-131).

F протеин RSV разделяет структурные признаки и ограниченную, но значимую идентичность аминокислотных последовательностей с F гликопротеинами других парамиксовирусов. Он синтезируется в виде неактивного предшественника из 574 аминокислот (FO), который является котрансляционально гликозилированным на аспарагинах в эндоплазматической сети, где он собирается в гомоолигомеры. Перед достижением клеточной поверхности предшественник FO отщепляется протеазой на F2 от N-конца и Fl от C-конца. Цепи F2 и Fl остаются ковалентно связанными при помощи одной или более дисульфидных связей.

Было обнаружено, что подвергнутые иммуноаффинной очистке F протеины полной длины накапливаются в форме мицелл (также характеризуемых как розетки), подобных тем, которые наблюдаются с другими гликопротеинами вирусной мембраны полной длины (Wrigley et al., 1986, in Electron Microscopy of Proteins, Vol. 5, p. 103-163, Academic Press, London). Под электронным микроскопом молекулы в розетках представляются в виде структур, имеющих форму инвертированных конусообразных палочек (≈70%) или «леденцов на палочке» (≈30%), с их более широкими концами, выступающими из центров розеток. Конформационное состояние в форме палочки связано с F гликопротеином в неактивном состоянии перед слиянием, тогда как конформационное состояние в форме «леденца на палочке» связано с F гликопротеином в активном состоянии после слияния.

Электронная микроскопия может использоваться для дифференцировки между конформациями перед слиянием и после слияния (альтернативно обозначенными как префузогенная и фузогенная), как продемонстрировано Calder et al., 2000, Virology 271:122-131. Конформацию перед слиянием можно также отличить от фузогенной конформации (после слияния) анализами ассоциации липосом. Кроме того, конформацию перед слиянием можно отличить от фузогенной конформации с использованием антител (например, моноклональных антител), которые специфически распознают конформационные эпитопы, присутствующие на одной или другой из префузионной или фузогенной форм F протеина RSV, но не на другой форме. Такие конформационные эпитопы могут быть следствием предпочтительного воздействия антигенной детерминанты на поверхность молекулы. Альтернативно, конформационные эпитопы могут возникать в результате сближения аминокислот, которые являются несмежными в линейном полипептиде.

Ранее было показано, что F предшественник расщепляется в двух сайтах (сайте I, после остатка 109 и сайте II, после остатка 136), обоим из которых предшествуют мотивы, распознаваемые фурин-подобными протеазами. Сайт II смежен со слитым пептидом, и расщепление F протеина в обоих сайтах необходимо для слияния мембран (Gonzalez-Reyes et al., 2001, PNAS 98(17): 9859-9864). Когда расщепление завершается в обоих сайтах, то считается, что имеет переход от конусовидной палочки к палочке в форме «леденца на палочке».

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано в настоящей заявке, заявители обнаружили, что удивительно высокие уровни экспрессии слитого (F) протеина могут быть достигнуты, когда вносятся определенные модификации в структуру F протеина RSV. Такие модификации также неожиданно снижают клеточную токсичность F протеина RSV в клетке-хозяине. Кроме того, модифицированные F протеины по настоящему изобретению демонстрируют улучшенную способность проявлять формирующуюся после слияния морфологию в форме «леденца на палочке» в отличие от наблюдающейся перед слиянием «палочковой» морфологии. Таким образом, в одном аспекте модифицированные F протеины по настоящему изобретению могут также проявлять улучшенную иммуногенность по сравнению с F протеинами дикого типа. Данные модификации могут найти значимое применение в разработке вакцин и способов применения указанных вакцин для лечения и/или предотвращения RSV. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным F протеинам RSV, которые демонстрируют увеличенную экспрессию, сниженную клеточную токсичность и/или усиленные иммуногенные свойства по сравнению с F протеинами RSV дикого типа.

В одном аспекте изобретение относится к рекомбинантным F протеинам RSV, содержащим модифицированные или мутированные аминокислотные последовательности по сравнению с F протеинами RSV дикого типа. В целом, эти модификации или мутации увеличивают экспрессию, снижают клеточную токсичность и/или усиливают иммуногенные свойства F протеинов RSV по сравнению с F протеинами RSV дикого типа. В определенных иллюстративных вариантах осуществления F протеины RSV представляют собой человеческие F протеины RSV.

F протеин RSV предпочтительно содержит модифицированную или мутированную аминокислотную последовательность по сравнению с F протеином RSV дикого типа (например, как иллюстрируется в SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления F протеин RSV содержит модификацию или мутацию в аминокислоте, соответствующей положению P 102 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2). В другом варианте осуществления F протеин RSV содержит модификацию или мутацию в аминокислоте, соответствующей положению 1379 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2). В другом варианте осуществления F протеин RSV содержит модификацию или мутацию в аминокислоте, соответствующей положению M447 протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2).

В одном варианте осуществления F протеин RSV содержит две или более модификации или мутации в аминокислотах, соответствующих положениям, описанным выше. В другом варианте осуществления F протеин RSV содержит три модификации или мутации в аминокислотах, соответствующих положениям, описанным выше.

В одном определенном варианте осуществления изобретение относится к F протеину RSV, где пролин в положении 102 замещен аланином. В другом варианте осуществления изобретение относится к F протеину RSV, где изолейцин в положении 379 замещен валином. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к F протеину RSV, где метионин в положении 447 замещен валином. В определенных вариантах осуществления F протеин RSV содержит две или более модификации или мутации в аминокислотах, соответствующих положениям, описанным в указанных определенных вариантах осуществления. В определенных других вариантах осуществления F протеин RSV содержит три модификации или мутации в аминокислотах, соответствующих положениям, описанным в указанных определенных вариантах осуществления. В иллюстративном варианте осуществления F протеин RSV имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления кодирующая последовательность F протеина RSV, кроме того, оптимизирована для усиления его экспрессии в подходящей клетке-хозяине. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого. В иллюстративном варианте осуществления клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.

В одном варианте осуществления кодирующая последовательность гена F RSV с оптимизированным кодоном представляет собой SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления кодирующая последовательность гена F RSV с оптимизированным кодоном имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления F протеин RSV, кроме того, содержит, по меньшей мере, одну модификацию в криптическом поли(A) сайте F2. В другом варианте осуществления F протеин RSV, кроме того, содержит одну или более аминокислотных мутаций в сайте первичного расщепления (CS). В одном варианте осуществления F протеин RSV содержит модификацию или мутацию в аминокислоте, соответствующей положению Rl33 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2) или F протеина RSV с оптимизированным кодоном (SEQ ID NO: 4). В другом варианте осуществления F протеин RSV содержит модификацию или мутацию в аминокислоте, соответствующей положению Rl35 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2) или F протеина RSV с оптимизированным кодоном (SEQ ID NO: 4). В еще одном варианте осуществления F протеин RSV содержит модификацию или мутацию в аминокислоте, соответствующей положению Rl36 F протеина RSV дикого типа (SEQ ID NO: 2) или F протеина RSV с оптимизированным кодоном (SEQ ID NO: 4).

В одном определенном варианте осуществления изобретение относится к F протеину RSV, где аргинин в положении 133 замещен глутамином. В другом определенном варианте осуществления изобретение относится к F протеину RSV, где аргинин в положении 135 замещен глутамином. В еще одном определенном варианте осуществления изобретение относится к F протеину RSV, где аргинин в положении 136 замещен глутамином. В определенных вариантах осуществления F протеин RSV содержит две или более модификации или мутации в аминокислотах, соответствующих положениям, описанным в указанных определенных вариантах осуществления. В определенных других вариантах осуществления F протеин RSV содержит три модификации или мутации в аминокислотах, соответствующих положениям, описанным в указанных определенных вариантах осуществления. В иллюстративном варианте осуществления F протеин RSV имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 6.

В другом варианте осуществления F протеин RSV, кроме того, содержит делецию в N-концевой половине домена слияния, соответствующего аминокислотам 137-146 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6. В иллюстративном варианте осуществления F протеин RSV имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 8. В альтернативном варианте осуществления F протеин RSV имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 10.

Кроме того, в объем изобретения включены F протеины RSV, отличные от человеческого F протеина RSV (SEQ ID NO: 2), которые содержат изменения, соответствующие изменениям, описанным выше. Такие F протеины RSV могут включать без ограничения F протеины RSV из штаммов A человеческого RSV, штаммов B человеческого RSV, штаммов коровьего RSV и штаммов птичьего RSV.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к модифицированным или мутированным F протеинам RSV, которые демонстрируют увеличенную экспрессию в клетке-хозяине по сравнению с F протеинами RSV дикого типа, такими как F протеин RSV, показанный SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретение относится к модифицированным или мутированным F протеинам RSV, которые демонстрируют сниженную клеточную токсичность в клетке-хозяине по сравнению с F протеинами RSV дикого типа, такими как F протеин RSV, показанный SEQ ID NO: 2. В еще одних вариантах осуществления изобретение относится к модифицированным или мутированным F протеинам RSV, которые демонстрируют усиленные иммуногенные свойства по сравнению с F протеинами RSV дикого типа, такими как F протеин RSV, показанный SEQ ID NO: 2.

В дополнительных аспектах изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим один или более модифицированных или мутированных F протеинов, как описано в настоящей заявке. В одном варианте осуществления изобретение относится к мицелле, состоящей из одного или более модифицированных или мутированных F протеинов RSV (например, F мицелле RSV).

В другом варианте осуществления изобретение относится к вирусоподобной частице (VLP), содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV. В некоторых вариантах осуществления VLP, кроме того, содержит один или более дополнительных белков.

В одном варианте осуществления VLP, кроме того, содержит матричный (M) протеин. В одном варианте осуществления M протеин происходит из человеческого штамма RSV. В другом варианте осуществления M протеин происходит из коровьего штамма RSV. В других вариантах осуществления матричный протеин может представлять собой Ml протеин из штамма вируса гриппа. В одном варианте осуществления штамм вируса гриппа представляет собой штамм вируса птичьего гриппа. В других вариантах осуществления M протеин может быть получен из штамма вируса ньюкаслской болезни (NDV).

В дополнительных вариантах осуществления VLP, кроме того, содержит гликопротеин G RSV. В другом варианте осуществления VLP, кроме того, содержит гликопротеин SH RSV. В другом варианте осуществления VLP, кроме того, содержит N протеин нуклеокапсида RSV.

Модифицированные или мутированные F протеины RSV могут применяться для профилактики и/или лечения инфекции RSV. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу вызова иммунного ответа против RSV. Способ включает введение иммунологически эффективного количества композиции, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, индивиду, такому как человек или животное.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым вакцинным композициям, содержащим модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащим модифицированный или мутированный F протеин RSV.

В одном варианте осуществления изобретение относится к иммуногенному составу, содержащему, по меньшей мере, одну эффективную дозу модифицированного или мутированного F протеина RSV. В другом варианте осуществления изобретение относится к иммуногенному составу, содержащему, по меньшей мере, одну эффективную дозу F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к иммуногенному составу, содержащему, по меньшей мере, одну эффективную дозу VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами вакцинных составов по изобретению.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу составления вакцинной или антигенной композиции, которая индуцирует иммунитет к инфекции или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у млекопитающего, причем способ включает добавление к составу эффективной дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV. В предпочтительном варианте осуществления инфекция представляет собой инфекцию RSV.

Модифицированные или мутированные F протеины RSV по изобретению могут использоваться для получения композиций, которые стимулируют иммунный ответ, который обеспечивает иммунитет или существенный иммунитет в отношении инфекционных агентов. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции иммунитета к инфекциям или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции существенного иммунитета к инфекции вирусом RSV или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV.

Композиции по изобретению могут вызывать существенный иммунитет у позвоночного (например, человека) при введении позвоночному. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции существенного иммунитета к инфекции вирусом RSV или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу вакцинации млекопитающего против RSV, включающему введение млекопитающему вызывающего защиту количества модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции защитной реакции антител к инфекции вирусом RSV или, по меньшей мере, к одному ее симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции защитной клеточной реакции к инфекции вирусом RSV или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции защитной клеточной реакции к инфекции вирусом RSV или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции защитной клеточной реакции к инфекции вирусом RSV или, по меньшей мере, к одному ее патологическому симптому у индивида, включающему введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV.

В еще одном аспекте изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте, кодирующей модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению. В иллюстративном варианте осуществления изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный или мутированный F протеин RSV, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9.

В еще одном аспекте изобретение относится к изолированной клетке, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению. В иллюстративном варианте осуществления изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный или мутированный F протеин RSV, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9.

В еще одном аспекте изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению. В иллюстративном варианте осуществления изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный или мутированный F протеин RSV, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления вектор представляет собой бакуловирусный вектор.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения F протеина RSV, включающему (a) трансформацию клетки-хозяина для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению; и (b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, содействующих продукции указанного F протеина RSV. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный или мутированный F протеин RSV, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого. В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого, трансфицированную бакуловирусным вектором, содержащим модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения мицеллы F протеина RSV, включающему (a) трансформацию клетки-хозяина для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению; и (b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, содействующих продукции указанной мицеллы F протеина RSV. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный или мутированный F протеин RSV, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого. В иллюстративном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого, трансфицированную бакуловирусным вектором, содержащим модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 изображена структура F₀ протеина HRSV дикого типа.

На фиг. 2 изображена структура модифицированного F₀ протеина RSV с мутациями сайта расщепления, как описано в примере 3.

На фиг. 3 изображены консервативные замещения (R133Q, R135Q и R136Q) в сайте первичного расщепления модифицированного F протеина HRSV BV #541 (SEQ ID NO: 6).

На фиг. 4 изображена последовательность и структура модифицированного F протеина HRSV BV #541 (SEQ ID NO: 6).

На фиг. 5 изображена последовательность и структура модифицированного F протеина HRSV BV #622 (SEQ ID NO: 10).

На фиг. 6 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE очищенного рекомбинантного F протеина HRSV BV #622 в присутствии βME или без него.

На фиг. 7 изображена структура модифицированного F протеина HRSV BV #683 (SEQ ID NO: 8).

На фиг. 8 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE очищенного рекомбинантного F протеина HRSV BV #622 и BV #683 в присутствии βME или без него (слева) и их структуры.

На фиг. 9 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE (слева) и вестерн-блот анализ (справа) очищенного рекомбинантного F протеина HRSV BV #683 в присутствии βME или без него.

На фиг. 10 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE, используемый при анализе чистоты сканирующей денситометрией (слева) и вестерн-блоттингом (справа) очищенного рекомбинантного F протеина HRSV BV #683.

На фиг. 11 показаны изображения мицелл (розеток) очищенного рекомбинантного F протеина HRSV BV #683, полученные при электронной микроскопии с негативным окрашиванием.

На фиг. 12 изображен анализ размера частиц мицелл F протеина HRSV BV #683.

На фиг. 13 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE (слева) и вестерн-блот анализ (справа) модифицированного F протеина HRSV BV #622 и BV #623 (SEQ ID NO:21) с коэкспрессией с протеинами N HRSV и M BRSV и без нее в сборах (внутриклеточных) неочищенной клеточной культуры или образцах осадка клеток после центрифугирования разделением в 30% градиенте сахарозы и структуры BV #622 и BV #623.

На фиг. 14 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE (слева) и вестерн-блот анализ (справа) модифицированного F протеина HRSV BV #622, двойного тандемного химерного BV#636 (BV #541 + M BRSV), BV #683, BV #684 (BV #541 с L-доменом YIAL) и BV#685 (BV #541 с L-доменом YKKL) с коэкспрессией с протеинами N HRSV и M BRSV и без нее в сборах (внутриклеточных) неочищенной клеточной культуры или образцах осадка клеток после центрифугирования с коэкспрессией с протеинами N HRSV и M BRSV и без нее в сборах (внутриклеточных) и структура каждого анализированного модифицированного F протеина HRSV.

На фиг. 15 изображен окрашенный кумасси гель SDS-PAGE (слева) и вестерн-блот анализ (справа) модифицированного F протеина RSV BV #622 (SEQ ID NO: 10), двойного тандемного химерного BV#636 (BV #541 + M BRSV), BV #683 (SEQ ID NO: 8), BV #684 (BV #541 с L-доменом YIAL) и BV#685 (BV #541 с L-доменом YKKL) с коэкспрессией с протеинами N HRSV и M BRSV и без нее в образцах клеточного осадка после центрифугирования разделением в 30% градиенте сахарозы и структура каждого анализированного F протеина HRSV.

На фиг. 16 изображена структура, название клона. Описание, результаты вестерн-блоттинга и SDS-PAGE с окрашиванием кумасси и заключение для каждого модифицированного F протеина RSV, как описано в примере 9.

На фиг. 17 изображены экспериментальные процедуры исследования с контрольным заражением RSV, как описано в примере 10.

На фиг. 18 изображены результаты анализа нейтрализации RSV в 31-й и 46-й день у мышей, иммунизированных PBS, живым RSV, FI-RSV, 1 мг PFP, 1 мг PFP + квасцами, 10 мг PFP, 10 мг PFP + квасцами, 30 мг PFP, и положительный контроль (овечье анти-F антитело).

На фиг. 19 изображены титры RSV в легочных тканях мышей, иммунизированных PBS, живым RSV, FI-RSV, 1 мг PFP, 1 мг PFP + квасцами, 10 мг PFP, 10 мг PFP + квасцами, 30 мг PFP, через 4 дня после контрольного заражения инфекционным RSV.

На фиг. 20 изображен гель SDS-PAGE, окрашенный кумасси, очищенного рекомбинантного F протеина RSV BV #683, хранившегося при 2 - 8°C в течение 0, 1, 2, 4 и 5 недель.

На фиг. 21 изображены реакции нейтрализующих антител RSV A и RSV B после иммунизации живым RSV (RSV), RSV, инактивированным формалином (FI-RSV), RSV-F протеином BV #683 с алюминием и без него (PFP и PFP + Алюминиевый адъювант) и контроли PBS.

На фиг. 22 изображена легочная патология после контрольного заражения RSV у крыс, иммунизированных живым RSV, RSV, инактивированным формалином (FI-RSV), RSV-F протеином BV #683 с алюминием и без него (F-мицелла (30 мг) и F-мицелла (30 мг) + Алюминиевый адъювант), и контроли PBS.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Используемый в настоящем описании термин «адъювант» относится к соединению, которое при использовании в комбинации со специфическим иммуногеном (например, модифицированным или мутированным F протеином RSV, F мицеллой RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV) в составе усилит или иным образом изменит или модифицирует итоговый иммунный ответ. Модификация иммунного ответа включает интенсификацию или расширение специфичности каждой или обоих из реакции антител и клеточной иммунной реакции. Модификация иммунного ответа может также означать уменьшение или подавление определенных антиген-специфических иммунных реакций.

Используемый в настоящем описании термин «антигенный состав» или «антигенная композиция» относится к препарату, который при введении позвоночному, в частности птице или млекопитающему, вызывает иммунный ответ.

Используемый в настоящем описании термин «вирус птичьего гриппа» относится к вирусам гриппа, обнаруживаемым главным образом у птиц, но может также инфицировать людей или других животных. В некоторых случаях вирусы птичьего гриппа могут передаваться или распространяться от одного человека к другому. Вирус птичьего гриппа, который инфицирует людей, может вызвать пандемию гриппа, т.е. заболеваемость и/или смертность у людей. Пандемия возникает, когда появляется новый штамм вируса гриппа (вируса, к которому нет естественного иммунитета), распространяясь за пределы отдельных участков, возможно, по всему миру, и сразу инфицируя многих людей.

Используемый в настоящем описании термин «эффективная доза» в целом относится к количеству модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению, достаточному для индукции иммунитета, для предотвращения и/или облегчения инфекции или для уменьшения, по меньшей мере, одного симптома инфекции или заболевания, и/или для усиления эффективности другой дозы модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV. Эффективная доза может относиться к количеству модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, достаточному для задержки или минимизации начала инфекции или заболевания. Эффективная доза может также относиться к количеству модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, которое обеспечивает терапевтический эффект при лечении или борьбе с инфекцией или заболеванием. Кроме того, эффективная доза представляет собой количество в отношении модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, по изобретению отдельно или в комбинации с другими способами лечения, которое обеспечивает терапевтический эффект при лечении или борьбе с инфекцией или заболеванием. Эффективная доза может также представлять собой количество, достаточное для усиления собственного иммунного ответа индивида (например, человека) против последующего воздействия инфекционного агента или заболевания. Уровни иммунитета можно контролировать, например, измерением количеств нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например нейтрализацией бляшек, фиксацией комплемента, ферментным иммуносорбентным анализом или анализом микронейтрализации, или измерением клеточных реакций, таких как без ограничения цитотоксические T-клетки, антигенпредставляющие клетки, хелперные T-клетки, дендритные клетки, и/или других клеточных реакций. T-клеточные реакции могут контролироваться, например, измерением, например, количества присутствующих клеток CD4⁺ и CD8⁺ с использованием специфических маркеров флуоресцентной проточной цитометрией или анализом T-клеток, таким как без ограничения анализ пролиферации T-клеток, цитотоксический анализ T-клеток, тетрамерный анализ (TETRAMER) и/или ферментный иммуносорбентный анализ пятна (ELISPOT-анализ). В случае вакцины «эффективная доза» представляет собой дозу, которая предотвращает заболевание и/или снижает тяжесть симптомов.

Используемый в настоящем описании термин «эффективная доза» в целом относится к количеству модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, необходимому или достаточному для осуществления желательного биологического эффекта. Эффективное количество композиции представляет собой количество, которое обеспечивает достижение выбранного результата, и специалист в данной области может определить такое количество обычным экспериментированием. Например, эффективное количество для предотвращения, лечения и/или облегчения течения инфекции может представлять собой то количество, которое необходимо для вызова активации иммунной системы, приводя к развитию антиген-специфического иммунного ответа после воздействия модифицированного или мутированного F протеина RSV, F мицеллы RSV, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV, или VLP, содержащей модифицированный или мутированный F протеин RSV по изобретению. Термин также синономичен с «достаточным количеством».

Используемый в настоящем описании термин «экспрессия» относится к способу, посредством которого полинуклеиновые кислоты транскрибируются в мРНК и транслируются в пептиды, полипептиды или протеины. Если полинуклеиновая кислота происходит из геномной ДНК, то экспрессия, если выбрана соответствующая эукариотическая клетка-хозяин или организм, может включать сплайсинг мРНК. В контексте настоящего изобретения термин также охватывает выход мРНК гена F RSV и F протеинов RSV, достигаемый после их экспрессии.

Используемый в настоящем описании термин «F протеин», или «слитый протеин», или «полипептид слитого протеина» относится к полипептиду или протеину, имеющему всю или часть аминокислотной последовательности полипептида слитого белка RSV. Аналогичным образом, термин «G протеин» или «полипептид G протеина» относится к полипептиду или протеину, имеющему всю или часть аминокислотной последовательности полипептида протеина прикрепления. Были описаны и специалистам в данной области известны многочисленные слитые протеины и протеины прикрепления RSV. В документе WO/2008/114149, который полностью включен в настоящее описание путем ссылки, описаны иллюстративные варианты F и G протеинов (например, естественно встречающиеся варианты).

Используемый в настоящем описании термин «иммуногены» или «антигены» относится к веществам, таким как протеины, пептиды, нуклеиновые кислоты, которые способны вызывать иммунный ответ. Оба термина также включают эпитопы и используются взаимозаменяемо.

Используемый в настоящем описании термин «иммуностимулятор» относится к соединению, которое усиливает иммунный ответ через собственных химических посредников организма (цитокины). Данные молекулы содержат различные цитокины, лимфокины и хемокины с иммуностимулирующей, иммунопротективной и провоспалительной активностями, такие как интерфероны (IFN-γ), интерлейкины (например, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); факторы роста (например, фактор, стимулирующий колонии (CSF) гранулоцитов-макрофагов (GM) (GM-CSF)); и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как макрофагальный воспалительный фактор, лиганд Flt3, B7.1; B7.2 и т.д. Иммуностимулирующие молекулы могут вводиться в том же составе, что и VLP по изобретению, или могут вводиться отдельно, или протеин, или вектор экспрессии, кодирующий протеин, может вводиться для обеспечения иммуностимулирующего эффекта.

Используемый в настоящем описании термин «иммуногенный состав» относится к препарату, который при введении позвоночному, например млекопитающему, вызывает иммунный ответ.

Используемый в настоящем описании термин «инфекционный агент» относится к микроорганизмам, которые вызывают инфекцию у позвоночного. Обычно организмы представляют собой вирусы, бактерии, паразиты, простейшие и/или грибы.

Используемые в настоящем описании термины «мутированный», «модифицированный» или «модификация» указывают на модификацию нуклеиновой кислоты и/или полипептида, которая приводит к получению измененной нуклеиновой кислоты или полипептида. Мутации включают, например, точечные мутации, делеции или вставки одного или множества остатков в полинуклеотиде, которые включают изменения, возникающие в пределах кодир