Топливные композиции, содержащие производные изопрена

Топливные композиции, содержащие производные изопрена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/187959, поданной 17 июня 2009 г., содержание которой полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Разработка новых видов возобновляемого транспортного топлива представляет собой одну из ключевых задач двадцать первого века. На современном рынке преобладает этанол, полученный в результате брожения сахарозы и крахмала, осуществляемого дрожжами, и, в меньшей степени, биодизель (сложные эфиры жирных кислот), полученный из триглицеридов. Этанол в качестве жидкого топлива имеет ограниченное применение, так как обладает более низкой удельной энергоемкостью по сравнению с углеводородами. Кроме того, этанол нельзя транспортировать в условиях обычной инфраструктуры вследствие его аффинности к воде и коррелирующих свойств. Процессы переработки возобновляемых источников углерода (биомассы, Сахаров, масел) в углеводородное топливо представляют собой привлекательную альтернативу биоэтанолу.

[0003] Изопрен (2-метил-1,3-бутадиен) представляет собой ключевое промышленное химическое вещество, которое используют, в основном, для получения синтетического каучука. На сегодняшний день изопрен получают из нефтехимических источников либо непосредственно путем крекинга нафты и других светлых нефтепродуктов, либо опосредованно путем химического синтеза (см., например, Н. Pommer и A. Nurrenbach, Industrial Synthesis of Terpene Compounds, Pure Appl. Chem., 1975, 43, 527-551; Н. М. Weitz и Е. Loser, Isoprene в Ullmann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry, седьмое издание. Electronic Release, Wiley-VCH Verlag GMBH, Вайнхайм, 2005; и Н.М. Lybarger, Isoprene в Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4^oe изд., Wiley, Нью-Йорк (1995), 14, 934-952.) Полученные в результате этого фракции изопрена-сырца, как правило, подвергают комплексным процессам очистки, чтобы удалить многочисленные близкие по химической природе примеси, многие из которых могут препятствовать последующему превращению изопрена в полимеры и другие химические вещества.

[0004] Наоборот, изопрен, полученный из биологических источников, содержит очень мало углеводородных примесей и, вместо этого, содержит множество кислородсодержащих соединений, таких как этанол, ацетальдегид и ацетон. Многие из данных соединений можно легко удалить путем приведения в контакт с водой или пропускания через оксид алюминия или другие адсорбенты.

[0005] В промышленности для получения изопрена используют нефтехимическое сырье, также необходимы технологические линии комплексной очистки перед тем, как изопрен можно будет превратить в полимеры и другие химические вещества. Необходимы экономически эффективные способы превращения полученного биологическим путем изопрена в полезные химические продукты, с тем, чтобы использовать преимущества высокой степени чистоты биоизопрена и/или уникальных профилей распределения примесей.

[0006] Все патенты, заявки на патенты, документы и статьи, цитированные в данной заявке, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] В настоящем изобретении предложены способы и системы для получения компонентов топлива из изопрена высокой степени чистоты, а также топливные композиции, полученные из изопрена высокой степени чистоты.

[0008] В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения компонента топлива из биоизопреновой композиции, включающий химическое превращение значительной части изопрена в указанной биоизопреновой композиции в неизопреновые соединения. В одном варианте реализации, указанную биоизопреновую композицию подвергают химическому превращению с помощью температурных или каталитических условий, подходящих для димеризации изопрена, с получением димера изопрена и последующего каталитического гидрирования димера изопрена с получением компонента топлива с насыщенной углеводородной цепью С10. В другом варианте реализации, указанную биоизопреновую композицию подвергают химическому превращению путем (i) частичного гидрирования биоизопреновой композиции с получением изоамилена, (ii) димеризации изоамилена с моноолефином, выбранным из группы, состоящей из изоамилена, пропилена и изобутена, с получением димата и (iii) полного гидрирования димата с получением компонента топлива, В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере приблизительно 95% изопрена в указанной биоизопреновой композиции превращают в неизопреновые соединения в процессе химического превращения. В некоторых вариантах реализации, указанную биоизопреновую композицию нагревают до температуры от приблизительно 150°С до приблизительно 250°С с получением ненасыщенного циклического димера изопрена, и указанный ненасыщенный циклический димер изопрена подвергают каталитическому гидрированию с получением компонента топлива на основе насыщенного циклического димера изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанный способ включает: (i) приведение в контакт биоизопреновой композиции с катализатором для катализа циклодимеризации изопрена с получением ненасыщенного циклического димера изопрена, и полученный ненасыщенный циклический димер изопрена подвергают каталитическому гидрированию с получением компонента топлива на основе насыщенного циклического - димера изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанный катализатор для катализа циклодимеризации изопрена, включает катализатор, выбранный из группы, состоящей из никелевого катализатора, железных катализаторов и хромовых катализаторов. В некоторых вариантах реализации, указанный этап частичного гидрирования биоизопреновой композиции включает приведение биоизопреновой композиции в контакт с газообразным водородом и катализатором для катализа частичного гидрирования изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанный катализатор для катализа частичного гидрирования изопрена включает палладиевый катализатор. В некоторых вариантах реализации, указанный этап димеризации изоамилена с моноолефином включает приведение изоамилена в контакт с моноолефином в присутствии катализатора для катализа димеризации моноолефина. В некоторых вариантах реализации, указанный катализатор для катализа димеризации моноолефина включает кислотный катализатор. В некоторых вариантах реализации, указанный способ дополнительно включает очистку изопрена из биоизопреновой композиции перед химическим превращением биоизопреновой композиции в компонент топлива.

[0009] В одном аспекте настоящего изобретения предложена система для получения компонента топлива из биоизопреновой композиции, где значительную часть изопрена в биоизопреновой композиции химически превращают в неизопреновые соединения, при этом указанная система содержит биоизопреновую композицию и (а) (i) одно или более химических веществ, способных димеризоватъ изопрен в биоизопреновой композиции, или источник тепла, способный димеризовать изопрен в биоизопреновой композиции; и (ii) катализатор, способный катализировать гидрирование димера изопрена с получением компонента топлива с насыщенной углеводородной цепью С10;

или (b) (i) химическое вещество, способное частично гидрировать изопрен в указанной биоизопреновой композиции с получением изоамилена, (ii) химическое вещество, способное димеризовать изоамилен с моноолефинами, выбранными из группы, состоящей из изоамилена, пропилена и изобутена, с получением димата, и (iii) химическое вещество, способное полностью гидрировать димат с получением компонента топлива.

[0010] В некоторых вариантах реализации указанной системы, биоизопреновая композиция содержит более чем приблизительно 2 мг изопрена и содержит больше или приблизительно 99,94% масс. изопрена по отношению к общей массе всех С5-углеводородовв композиции. В некоторых вариантах реализации указанной системы, одно или более химических веществ, способных димеризовать изопрен, включают катализатор для катализа циклодимеризации изопрена, включая катализатор, выбранный из группы, состоящей из рутениевых катализаторов, никелевых катализаторов, железных катализаторов и хромовых катализаторов. В некоторых вариантах реализации указанной системы, катализатор для гидрирования ненасыщенных димеров изопрена включает катализатор, выбранный из группы, состоящей из палладиевых катализаторов, никелевых катализаторов, рутениевых катализаторов и родиевых катализаторов. В некоторых вариантах реализации указанной системы, указанное химическое вещество, способное частично гидрировать изопрен, включает палладиевый катализатор. В некоторых вариантах реализации указанной системы, химическое вещество, способное димеризовать изоамилен с моноолефинами, включает кислотный катализатор.

[0011] В одном аспекте настоящего изобретения предложена топливная композиция, содержащая компонент топлива, полученный с помощью способов, описанных в данной заявке. В некоторых вариантах реализации, указанная топливная композиция по существу не содержит изопрен, В некоторых вариантах реализации, указанная топливная композиция имеет значение δ¹³С, которое больше, чем -22‰, или находится в диапазоне от -32‰ до -24‰.

[0012] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложена система для получения компонента топлива из изопрена, содержащая: (а) коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты; и (b) компонент топлива, полученный из по меньшей мере части изопрена высокой степени чистоты; в которой по меньшей мере часть коммерчески предпочтительное количества изопрена высокой степени чистоты подвергается химическому превращению.

[0013] В некоторых вариантах реализации указанной системы, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты включает более чем приблизительно 2 мг изопрена и включает приблизительно 99,94% масс. изопрена или более по отношению к общей массе всех С5-углеводородов в указанной композиции. В некоторых вариантах реализации, указанное коммерчески подходящее количество изопрена высокой степени чистоты включает более чем приблизительно 2 мг изопрена и включает одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, пренильных спиртов С5 и изопреноидных соединений с 10 или более атомами углерода. В некоторых вариантах реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты включает более чем приблизительно 2 мг изопрена и включает одно или более дополнительных соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, метанола, ацетальдегида, метакролеина, метилвинилкетона, 2-метил-2-винилоксирана, цис- и транс-3-метил-1,3-пентадиена, пренильного спирта С5, 2-гептанона, 6-метил-5-гептен-2-она, 2,4,5-триметилпиридина, 2,3,5-триметилпиразина. цитронеллаля, метантиола, метилацетата, 1-пропанола, диацетила, 2-бутанона, 2-метил-3-бутен-2-ола, этилацетата, 2-метил-1-пропанола, 3-метил-1-бутаналя, 3-метил-2-бутанона, 1-бутанола, 2-пентанона, 3-метил-1-бутан ола, этилизобутирата, 3-метил-2-бутеналя, бутилацетата, 3-метилбутилацетата, 3-метил-3-бутен-1-ил ацетата, 3-метил-2-бутен-1-ил ацетата, 3-гексен-1-ола, 3-гексен-1-ил ацетата, лимонена, гераниола (транс-3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ола), цитронеллола (3,7-диметил-6-октен-1-ола), (Е)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена, (г)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена и 2,3-циклогептенолпиридина; при этом количество дополнительного соединения по отношению к количеству изопрена составляет приблизительно 0,01% (масс./масс.) или более. В некоторых вариантах реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты включает более чем приблизительно 2 мг изопрена и включает меньше или приблизительно 0,5 мкг/л на соединение любого соединения в указанной композиции, которое ингибирует полимеризацию изопрена. В некоторых предпочтительных вариантах реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты получают посредством биологического процесса.

[0014] В некоторых вариантах реализации указанной системы, указанный компонент топлива содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из циклических димеров и тримеров изопрена, линейных олигомеров изопрена, ароматических и алициклических производных изопрена и кислородсодержащих производных изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанные кислородсодержащие производные изопрена представляют собой соединения, выбранные из группы, состоящей из спиртов, кетонов, сложных и простых эфиров, полученных из изопрена.

[0015] В некоторых вариантах реализации, указанный компонент топлива включает циклические димеры изопрена и указанное химическое превращение включает реакцию димеризации изопрена. В некоторых вариантах реализации, реакцию димеризации осуществляют путем нагревания коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты. В некоторых вариантах реализации, реакция димеризации изопрена позволяет получить продукт, содержащий ненасыщенные димеры изопрена, и химическое превращение дополнительно включает реакцию гидрирования ненасыщенных димеров изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанная система дополнительно включает катализатор для катализа реакции гидрирования ненасыщенных димеров изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанный катализатор для катализа реакции гидрирования ненасыщенных димеров изопрена включает катализатор, выбранный из группы, состоящей из палладиевых катализаторов, никелевых катализаторов, рутениевых катализаторов и родиевых катализаторов.

[0016] В некоторых вариантах реализации, реакцию димеризации осуществляют путем приведения коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в контакт с катализатором для катализа циклодимеризации изопрена. В некоторых вариантах реализации, указанный катализатор для катализа циклодимеризации изопрена включает катализатор, выбранный из группы, состоящей из рутениевых катализаторов, никелевых катализаторов, железных катализаторов и хромовых катализаторов. В некоторых вариантах реализации, указанный катализатор для катализа циклодимеризации изопрена представляет собой никелевый катализатор, и указанный компонент топлива включает один или более восьмичленных кольцевых димеров изопрена.

[0017] В некоторых вариантах реализации, указанный компонент топлива включает линейные и/или циклические тримеры изопрена, и химическое превращение включает каталитическую тримеризацию изопрена.

[0018] В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения компонента топлива из изопрена, включающий: (а) получение коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты; и (b) химическое превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива. В некоторых вариантах реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты включает биоизопрен.

[0019] В некоторых вариантах реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты получают Согласно этапам, включающим: (i) культивирование клеток, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид изопренсинтазы, при подходящих для получения изопрена условиях культивирования, при этом указанные клетки (1) продуцируют более чем приблизительно 400 нмоль изопрена на грамм сырой массы клеток (г_смк) в час, (2) осуществляют превращение более чем приблизительно 0,002 молярного процента углерода, который клетки потребляют из среды для культивирования, в изопрен, или (3) имеют среднюю объемную производительность по изопрену более чем приблизительно 0,1 мг изопрена/л_{бульона}/ч, и (ii) получение изопрена, В некоторых вариантах реализации, указанные клетки дополнительно содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид изопренсинтазы или полипептид мевалонатного пути (MVA).

[0020] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, химическое превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива включает: (i) нагревание коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты до температуры от приблизительно 150°С до приблизительно 250°С; (ii) превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в ненасыщенные циклические димеры изопрена;

(iii) гидрирование ненасыщенных циклических димеров изопрена с получением насыщенных циклических димеров изопрена; и (iv) получение компонента топлива. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере от приблизительно 20% до приблизительно 100% изопрена из коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты превращают в ненасыщенные циклические димеры изопрена.

[0021] В некоторых вариантах реализации указанного способа, химическое превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива включает: (i) приведение коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в контакт с катализатором для катализа циклодимеризации изопрена, (п) превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в циклические димеры изопрена; и (iii) получение компонента топлива.

[0022] В некоторых вариантах реализации указанного способа, химическое превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива включает: (i) приведение коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в контакт с катализатором для катализа циклодимеризации изопрена, (ii) превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в ненасыщенные циклические димеры изопрена; (iii) гидрирование ненасыщенных циклических димеров изопрена с получением насыщенных циклических димеров изопрена; и (iv) получение компонента топлива. В некоторых вариантах реализации указанного способа, катализатор для катализа циклодимеризации изопрена включает катализатор, выбранный из группы, состоящей из никелевого катализатора, железных катализаторов и хромовых катализаторов.

[0023] В некоторых вариантах реализации указанного способа, химическое превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива включает; (i) приведение композиции изопрена высокой степени чистоты в контакт с каталитической системой;

(ii) превращение по меньшей мере части исходной композиции изопрена в ненасыщенные димеры и/или тримеры изопрена; и (iii) гидрирование ненасыщенных димеров и/или тримеров с получением насыщенных С10 и/или С15-углеводородов.

[0024] В некоторых вариантах реализации, указанный способ получения компонента топлива из изопрена включает: (а) получение коммерчески предпочтительного количества любой из исходных композиций изопрена высокой степени чистоты, описанных в данной заявке; (b) превращение по меньшей мере части исходной композиции изопрена в кислородсодержащие производные изопрена; и возможно (с) гидрирование любых ненасыщенных кислородсодержащих производных изопрена с получением насыщенных оксигенатов. В некоторых вариантах реализации, указанные кислородсодержащие производные изопрена представляют собой соединения, выбранные из группы, состоящей из спиртов, кетонов, сложных и простых эфиров, полученных из изопрена.

[0025] В некоторых вариантах реализации, любой из способов, описанных в данной заявке, дополнительно включает очистку коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты перед химическим превращением по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива.

[0026] В одном аспекте предусмотрен непрерывный процесс получения компонента топлива из изопрена, включающий: (а) непрерывное получение коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты; и (b) непрерывное химическое превращение по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива. В некоторых вариантах реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты включает газообразную фазу, содержащую изопрен. В некоторых вариантах реализации, указанный способ дополнительно включает пропускание газообразной фазы, содержащей изопрен, в реактор для химического превращения по меньшей мере части коммерчески предпочтительного количества изопрена высокой степени чистоты в компонент топлива. В предпочтительном варианте реализации, указанное коммерчески предпочтительное количество изопрена высокой степени чистоты включает биоизопрен.

[0027] Также предусмотрена топливная композиция, содержащая компонент топлива, полученный с помощью любого из способов, описанных в данной заявке. В некоторых вариантах реализации, указанный компонент топлива включает меньше или приблизительно 0,5 мкг/л продукта из С5-углеводорода, отличного от изопрена, после того, как его подвергли этапам Согласно способам, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации, указанный компонент топлива включает один или более продуктов из одного или нескольких соединений, выбранных из группы, состоящей из этанола, ацетона, метанола, ацетальдегида, метакролеина, метилвинилкетона, 2-метил-2-винилоксирана, цис- и транс-3-метил-1,3-пентадиена, пренильных спиртов С5, 2-гептанона, 6-метил-5-гептен-2-она, 2,4,5-триметилпиридина, 2,3,5-триметилпиразина, цитронеллаля, метантиола, метилацетата, 1-пропанола, диацетила, 2-бутанона, 2-метил-3-бутен-2-ола, этилацетата, 2-метил-1-пропанола, 3-метил-1-бутаналя, 3-метил-2-бутанона, 1-бутанола, 2-пентанона, 3-метил-1-бутанола, этилизобутирата, 3-метил-2-бутеналя, бутилацетата, 3-метилбутилацетата, 3-метил-3-бутен-1-ил ацетата, 3-метил-2-бутен-1-ил ацетата, 3-гексен-1-ола, 3-гексен-1-ил ацетата, лимонена, гераниола (транс-3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ола), цитронеллола (3,7-диметил-6-октен-1-ола), (Е)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена, (Z)-3,7-диметил-1,3,6-октатриена и 2,3-циклогептенолпиридина, после того, как его подвергли этапам Согласно способам, описанным в данной заявке.

[0028] В некоторых вариантах реализации, указанная топливная композиция включает топливную композицию, имеющую значение δ¹³С, большее чем -22‰. В некоторых вариантах реализации, указанная топливная композиция имеет значение δ¹³С, которое находится в диапазоне от -22‰ до -10‰ или от -34‰ до -24‰. В некоторых вариантах реализации, указанная топливная композиция имеет значение f_м, более чем 0,9. Также предложена смесь любой из топливных композиций, описанных в данной заявке, с топливом на нефтяной основе в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 95% по массе или объему, от общей массы или объема всей топливной композиции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0029] Фигура 1 представляет собой последовательность нуклеотидов гена изопренсинтазы кудзу, кодон-оптимизированную для экспрессии в Е. coli (SEQ ID NO:1). Инициирующий кодон atg выделен курсивом, стоп-кодон выделен жирным шрифтом и вставленный сайт для PstI подчеркнут.

[0030] Фигура 2 представляет собой карту pTrcKudzu.

[0031] Фигуры 3А-С представляют собой последовательность нуклеотидов pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2). Сайт связывания рибосом (RBS) подчеркнут, инициирующий кодон изопренсинтазы кудзу обозначен жирными заглавными буквами и стоп-кодон обозначен жирными заглавными буквами. Остов вектора представляет собой pTrcHis2B.

[0032] Фигура 4 представляет собой карту pETNHisKudzu.

[0033] Фигуры 5А-С представляют собой последовательность нуклеотидов pETNHisKudzu (SEQ ID NO: 3).

[0034] Фигура 6 представляет собой карту pCL-lac-Kudzu.

[0035] Фигуры 7А-С представляют собой последовательность нуклеотидов pCL-lac-Kudzu (SEQ ID NO: 4).

[0036] Фигура 8А представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками BL21 Е. coli без вектора.

[0037] Фигура 8В представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками BL21 Е. coli с pCL-lac-Kudzu.

[0038] Фигура 8С представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками BL21 Е, coli с pTrcKudzu.

[0039] Фигура 8D представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками BL21 Е. coli с pETN-HisKudzu.

[0040] Фигура 9А представляет собой график, на котором изображена зависимость ОП от времени при ферментации BL21/pTrcKudzu Е. coli в 14-литровом ферментаторе периодического действия с подпиткой.

[0041] Фигура 9В представляет собой график, на котором изображена зависимость продукции изопрена от времени при ферментации BL21/pTrcKudzu Е. coli в 14-литровом ферментаторе периодического действия с подпиткой.

[0042] Фигура 10А представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена контрольными клетками Panteoa citrea без рекомбинантной изопренсинтазы кудзу. Серые ромбы представляют синтез изопрена, черные квадраты представляют ОП₆₀₀.

[0043] Фигура 10В представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками Panteoa citrea, экспрессирующими pCL-lac-Kudzu. Серые ромбы представляют синтез изопрена, черные квадраты представляют ОП₆₀₀.

[0044] Фигура 10С представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками Panteoa citrea, экспрессирующими pTrcKudzu. Серые ромбы представляют синтез изопрена, черные квадраты представляют ОП₆₀₀.

[0045] Фигура 11 представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена клетками Bacillus subtilis, экспрессирующими рекомбинантную изопренсинтазу. BG3594comK представляет собой штамм В. subtilis без плазмиды (продукция нативного изопрена). CF443 представляет собой штамм BG3594comK В. subtilis с pBS Kudzu (продукция рекомбинантного изопрена). IS на оси у обозначает изопрен.

[0046] Фигуры 12А-С представляют собой последовательность нуклеотидов pBS Kudzu #2 (SEQ ID NO: 5).

[0047] Фигура 13 представляет собой последовательность нуклеотидов изопренсинтазы кудзу, кодон-оптимизированную для экспрессии в Yarrowia (SEQ ID NO: 6).

[0048] Фигура 14 представляет собой карту pTrex3g, содержащей ген изопренсинтазы кудзу, кодон-оптимизированный для экспрессии в Yarrowia.

[0049] Фигуры 15А-С представляют собой последовательность нуклеотидов вектора pSPZl(MAP29Spb) (SEQ ID NO: 7).

[0050] Фигура 16 представляет собой последовательность нуклеотидов синтетического гена изопренсинтазы кудзу (Pueraria montand), кодон-оптимизированную для экспрессии в Yarrowia (SEQ ID NO: 8).

[0051] Фигура 17 представляет собой последовательность нуклеотидов синтетического гена изопренсинтазы гибридного тополя (Populus alba x Populus tremula) (SEQ ID NO: 9). Инициирующий кодон ATG выделен жирным шрифтом и стоп-кодон подчеркнут.

[0052] На Фигуре 18А (Фигуры 18А1 и 18А2) в контуре схематически показано конструирование векторов pYLA I, pYLl и pYL2 (SEQ ID NO: 75, 73. 72, 71, 70, 69).

[0053] На Фигуре 18В схематически показан план конструирования вектора pYLA(POPl) (SEQ ID NO: 68, 69).

[0054] На Фигуре 18С схематически показан план конструирования вектора pYLA(KZl).

[0055] На Фигуре 18D схематически показан план конструирования вектора pYLI(KZl) (SEQ ID NO: 66, 67).

[0056] На Фигуре 18Е схематически показан план конструирования вектора pYLI(MAP29).

[0057] На Фигуре 18F схематически показан план конструирования вектора pYLA(MAP29).

[0058] На Фигуре 19А показаны мевалонатный (MVA) и 1-дезокси-0-ксилулоза-5-фосфатный (DXP) метаболические пути для изопрена (на основании публикации F. Bouvier и др.. Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). Следующее описание содержит альтернативные названия для каждого полипептида в указанных путях и ссылку на источник, в котором описан способ измерения активности указанного полипептида (каждый из данных источников настоящим полностью включен посредством ссылки, особенно в отношении тестов на активность полипептов для полипептидов в путях MVA и DXP). Мевалонатный путь: ААСТ; Ацетил-коА-ацетилтрансфераза, MvaE, ЕС 2.3.1.9. Анализ: J. Bacterial., 184: 2116-2122,2002; HMGS; гидроксиметилглутарил-коА-синтаза, MvaS, EC 2.3.3.10. Анализ: J. Bacterial., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА-редуктаза, MvaE, EC 1.1.1.34. Анализ: J. Bacterial., 184: 2116-2122, 2002; MVK; мевалонаткиназа, ERG12, ЕС 2.7.1.36. Анализ: Curr Genet 19:9-14, 1991. РМК; фосфомевалонаткиназа, ERG8, ЕС 2.7.4.2. Анализ: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; дифосфомевалонатдекарбоксилаза, MVD1, EC 4.1.1.33. Анализ: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; изопентенилдифосфат-дельта-изомераза, IDI1, ЕС 5.3.3.2. Анализ: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Путь DXP: DXS; 1-дезоксиксилулоза-5-фосфатсинтаза, dxs, EC 2.2.1.7. Анализ: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-дезокси-0-ксилулоза-5-фосфатредуктоизомераза, dxr, EC 2.2.1.7. Анализ: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; МСТ; 4-дифосфоцитидил-2С-метил-D-эритритолсинтаза, IspD, ЕС 2.7.7.60. Анализ: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; СМК; 4-дифосфоцитидил-2-С-метил-0-эритритолкиназа, IspE, EC 2.7.1.148. Анализ: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфатсинтаза, IspF, EC 4.6.1.12. Анализ: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-гидрокси-2-метил-2-(Е)-бутенил-. 4-дифосфатсинтаза, ispG, EC 1.17.4.3. Анализ: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; HDR; 1-гидрокси-2-метил-2-(Е)-бутенил-4-дифосфатредуктаза, IspH, EC 1.17.1.2. Анализ: JACS, 126:12847-12855.2004.

[0059] На Фигуре 19В проиллюстрированы классический и модифицированный мевалонатные пути. 1- ацетил-коА-ацетилтрансфераза (ААСТ); 2 - ГМГ-КоА-синтаза (HMGS); 3 - ГМГ-КоА-редуктаза (HMGR); 4 - мевалонаткиназа (MVK); 5 -фосфомевалонаткиназа (РМК); 6 - дифосфомевалонатдекарбоксилаза (MVD или DPMDC); 7- изопентенилдифосфатизомераза (IDI); 8 фосфомевалонатдекарбоксилаза (PMDC); 9 - изопентенилфосфаткиназа (IPK). В классическом мевалонатном пути реакции с 1 по 7 идут через реакции 5 и 6, тогда как модифицированный мевалонатный путь идет через реакции 8 и 9. Р и РР в структурной формуле представляют собой фосфат и пирофосфат, соответственно. Данная фигура была взята из статьи авторов Koga и Morrii, Mocrobiology and Mol, Biology Reviews, 71:97-120, 2007, которая полностью включена посредством ссылки, особенно в отношении нуклеиновых кислот и полипептидов модифицированного мевалонатного пути. Модифицированный мевалонатный путь представлен, например, у некоторых архейных организмов, таких как Methanosarcina maw.

[0060] На Фигуре 20 (Фигуры 20А и 20В) приведены графики, на которых представлены результаты анализа методом газовой хроматографии-масс- спектрометрии (ГХ-МС) продукции изопрена рекомбинантными штаммами У. lipolytica без гена изопренсинтазы кудзу (слева) или с геном изопренсинтазы кудзу (справа), Стрелки показывают время элюирования стандартного натурального изопрена.

[0061] Фигура 21 представляет собой карту pTrcKudzu yIDI DXS Kan.

[0062] Фигуры 22A-D представляют собой последовательность нуклеотидов pTrcKudzu yIDI DXS Kan (SEQ ID NO: 10).

[0063] Фигура 23А представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pTrcKudzukan. Момент времени 0 представляет собой момент индукции изопропилтиогалактозидом (IPTG) (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена оптическая плотность ОП₆₀₀, а оси у2 - общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀, круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0064] Фигура 23В представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pTrcKudzu уIDI kan. Момент времени О представляет собой момент индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀. круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0065] Фигура 23С представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pTrcKudzu DXS kan. Момент времени О представляет собой момент индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общую производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀, круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0066] Фигура 23D представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan. Момент времени О представляет собой момент индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀, круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0067] Фигура 23Е представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pCL PTrcKudzu. Момент времени 0 представляет собой момент индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀. круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0068] Фигура 23F представляет собой график, на котором изображено получение изопрена из глюкозы клетками BL21/pCL PTrcKudzu yIDI. Момент времени О представляет собой момент индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀, круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0069] Фигура 23G представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pCL PTrcKudzu DXS. Момент времени О представляет собой момент индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Ромбы представляют ОП₆₀₀, круги представляют общую производительность в отношении изопрена (мкг/л) и квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП).

[0070] Фигура 23Н представляет собой график, на котором изображена продукция изопрена из глюкозы клетками BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan. Стрелка указывает на момент времени индукции IPTG (400 мкмоль). На оси х представлено время после индукции; на оси у представлена ОП₆₀₀, а на оси у2 представлена общая производительность в отношении изопрена (мкг/л свободного пространства над поверхностью) или удельная производительность (мкг/л свободного пространства над поверхностью/ОП). Черные ромбы представляют ОП₆₀₀, черные треугольники представляют производительность в отношении изопрена (мкг/л) и белые квадраты представляют удельную производительность в отношении изопрена (мкг/л/ОП),

[0071] Фигура 24 представляет собой карту pTrcKKDyIkIS kan,

[0072] Фигуры 25A-D представляют собой последовательность нуклеотидов pTrcKKDyIkIS kan (SEQ ID NO: 11).

[0073] Фигура 26 представляет собой карту pCL PtrcUpperPathway

[0074] Фигуры 27A-27D представляют собой последовательность нуклеотидов pCL PtrcUpperPathway (SEQ ID NO: 12).

[0075] На Фигуре 28 представлена карта кассеты, содержащей нижний мевалон