Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака

Слитый белок dlk1-fc и его применение для ингибирования метастазов рака, полинуклеотид, кодирующий белок, вектор, клетка-хозяин, способ получения слитого белка, композиция и способ ингибирования метастазов рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для лечения метастазов рака, содержащей слитой белок DLK1-Fc, который обладает способностью ингибировать метастазы рака.

Предшествующий уровень техники

Рак является одним из самых серьезных заболеваний, представляющих угрозу жизни человека. В Южной Корее, рак является причиной № 1 смертности людей за последние несколько лет. В США, по причине смертности, рак занимает второе место после сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на огромное число исследований, которые проводились ранее и проводятся в настоящее время, раковые заболевания, по сравнению с заболеваниями, которыми когда-либо страдало человечество, достигли катастрофических масштабов, и каждый год уносят миллионы жизней, причем затраты на их лечение исчисляются астрономическими суммами.

Рак можно рассматривать как генетическое заболевание на клеточном уровне, и считается, что развитие этого заболевания происходит из-за возникновения мутаций генов, таких как онкогены и гены-суппрессоры опухоли. Применяемые в настоящее время методы лечения рака включают хирургические операции, химиотерапию, лучевую терапию и иммунотерапию, однако пока еще не существует эффективного решения проблем, связанных с ингибированием роста злокачественной опухоли и ее рецидивов.

Одна из наиболее важных биологических особенностей рака заключается в том, что раковые опухоли могут мигрировать, что является самым главным препятствием при разработке средств для лечения рака. Действительно, при диагностике первичной опухоли, примерно у 60% всех пациентов с солидными опухолями обнаруживается небольшая, но клинически обнаружимая миграция опухоли, и широко известно, что самой главной причиной смерти большинства раковых больных являются метастазы. Процесс метастазирования заключается в проникновении опухолей в локальную ткань с образованием новых сосудов (то есть ангиогенезом), в котором участвует опухолевый ангиогенный фактор (TAF). Новые сосуды, образуемые опухолью, имеют много дефектов, которые позволяют раковым клеткам легко проникать в ткань. Для проникновения клеток раковой опухоли в ткань и ее метастазирования требуется присутствие множества рецепторов на поверхности раковой клетки, таких как ламининовый рецептор, необходимый для адгезии к матриксу и к базальной мембране ткани; различных ферментов, необходимых для растворения стромы нормальных тканей, таких как коллагеназа типа IV, активатор плазминогена и катепсин D; фактора роста, аутокринного фактора миграции опухоли (AMF); а также осуществление экспрессии онкогенов.

Большие надежды возлагаются на разработку веществ, обладающих ингибирующим действием на метастазы, так как в настоящее время почти не существует средств, способных ингибировать метастазы. Уже сообщалось, что вещества, включающие сульфированный полисахарид, N-диазоацетиловое производное глицина, фермент нейраминидазу и фибронектины (FN), обладают ингибирующим действием на метастазы. Но, как известно, ни одно из этих средств не поступало в промышленное производство, и пока нет данных, указывающих на то, что ингибирующие действия на метастазы оказывают сами эти вещества. Если будет разработан эффективный метод ингибирования миграции опухолей, то лечение, которое будет спасать человека от летального исхода, вызываемого метастазами, станет реальностью.

В этих целях был исследован дельта-подобный 1 гомолог (DLK1), являющийся членом семейства рецепторов notch/delta/serrate, который представляет собой трансмембранный гликопротеин, кодируемый геном dlk1, локализованным в положении 14q32, и состоит из 280 внеклеточных областей, содержащих 383 аминокислоты, 24 трансмембранных сегментов и 56 цитоплазматических доменов. Среди доменов во внеклеточной области присутствуют 6 повторяющихся доменов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF) и имеющих 3 сайта N-гликозилирования и 7 сайтов О-гликозилирования. Как объяснялось ранее, DLK1 представляет собой трансмембранный белок, причем известно также, что он представляет собой внеклеточную часть белка, которая слущивается с клеточной мембраны под действием фермента, конвертирующего фактор некроза опухоли альфа (TACE), и обладает независимой функцией (Yuhui Wang and Hei Sook Sul, Molecular and cellular biology. 26(14): 5421-5435, 2006).

Было обнаружено, что DLK1 имеет различные формы, размер которых при гликозилировании на клеточной мембране составляет 50~60 кДа (Smas C.M. and Sul H.S., Cell. 73:725-34, 1993), и 4 варианта сплайсинга при альтернативном сплайсинге (Smas C.M. et al., Biochemistry. 33:9257-65, 1994). Из них, два самых больших варианта имеют сайты расщепления протеолитическими ферментами, которые разрезаются ферментом ТАСЕ с образованием двух растворимых форм размером 50 кДа и 25 кДа (Yuhui Wang et al., Journal of Nutrition. 136:2953-2956, 2006) (см. фиг.1).

DLK1 широко известен как фетальный антиген 1 (FA1) (Jensen C.H. et al., European Journal of Biochemistry. 225:83-92, 1994), поскольку он экспрессируется, главным образом, на стадии развития организма в эмбриональной ткани (Smas C.M. et al., Cell. 73:725-34, 1993; Kaneta M. et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000) и в плаценте, а в частности он экспрессируется в высоких концентрациях в материнской сыворотке. Имеются некоторые сообщения об экспрессии DLK1 в железистых клетках поджелудочной железы (Kaneta M. et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000), в клетках яичника или в скелетных мышечных трубочках (Floridon C. et al., Differentiation. 66:49-59, 2000). Экспрессия DLK1 в большинстве тканей прекращается после рождения и наблюдается в ограниченном ряде клеток, таких как преадипоциты (Smas C.M. et al., Cell. 73:725-34, 1993), клетки панкреатических островков (Carlsson C et al., Endocrinology. 138:3940-8, 1997), стромальные клетки тимуса (Kaneta M. et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000) или клетки коры надпочечника (Halder S.K. et al., Endocrinology. 139:3316-28, 1998). Экспрессия DLK1 также известна как моноаллельная экспрессия по отцовской линии, вызываемая метилированием (Schmidt J.V. et al., Genes and Development. 14:1997-2002, 2000; Takada S. et al., Current Biology 10:1135-8, 2000; Wylic A.A. et al, Genome Research. 10:1711-8, 2000).

DLK1 широко известен как преадипоцитарный фактор-1 (Pref-1), который играет определенную роль в ингибировании дифференцировки адипоцитов и который в большинстве случаев исследовался именно с этой точки зрения (Smas C.M. et al., Cell. 73:725-34; Villena J.A. et al., Hormone and Metabolic Research. 34:664-70, 2002). Кроме того, известно, что DLK1, помимо ингибирования дифференцировки адипоцитов, также ингибирует дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток (Sakajiri S. et al., Leukemia. 19:1404-10, 2005; Li L et al., Oncogene. 24:4472-6, 2005), регулирует дифференцировку лимфоидных клеток-предшественников (Bauer S.R. et al., Molecular and Cellular Biology. 18:5247-55, 1998; Kaneta M et al., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000) и участвует в процессах заживления ран (Samulewicz S.J. et al., Wound Repair and Regeneration. 10:215-21, 2002). Однако до сих пор почти не проводились исследования по влиянию DLK1 на раковые клетки.

Недавно проводились исследования по взаимосвязи между DLK1 и несколькими типами раковых опухолей, сверхэкспрессирующих DLK1 в глиомных клетках, и было обнаружено, что кДНК DLK1, если он экспрессируется в глиомных клетках, способствует увеличению уровня пролиферации глиомных клеток и тем самым увеличению степени миграции этих клеток (Yin D. et al., Oncogene. 25:1852-61, 2006). В литературе также сообщалось, что экспрессия DLK1 в раковых клетках печени выше, чем в нормальных клетках печени, и что, при снижении уровня экспрессии DLK1 опухоль значительно уменьшается, на что указывал тест, проводимый с использованием киРНК (Huang J. et al., Carcinogenesis. 28(5):1094-1103, 2007). Недавно сообщалось, что цитоплазматический домен DLK1 играет важную роль в онкогенезе (Yuri K. et al., Cancer Research. 69(24):OF1-10, 2009). До настоящего времени исследования растворимого DLK1, который представляет собой внеклеточную часть, слущиваемую с клеточной мембраны под действием ТАСЕ, были сосредоточены, главным образом, на функции ингибирования дифференцировки адипоцитов. Однако пока еще не проводились исследования по взаимосвязи между внеклеточным растворимым доменом DLK1 и раковым заболеванием.

Поэтому авторами было разработано настоящее изобретение, в основу которого были положены: получение ими рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего ген растворимого домена во внеклеточной области DLK1 вместе с генами Fc-домена антигена IgG; экспрессия и очистка слитого белка DLK1-Fc из клеток 293Е; и подтверждение, путем измерения фармакокинетических (ФК) параметров, заметного снижения степени миграции раковых клеток под действием слитого белка DLK1-Fc и его эффективности как лекарственного средства, ингибирующего метастазы, что дает основание утверждать, что слитый белок DLK1-Fc может быть с успехом использован в качестве эффективного ингредиента в композициях для ингибирования метастазов опухоли.

Описание

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является получение слитого белка DLK1-Fc и композиции против метастазов рака, содержащей DLK1-Fc в качестве эффективного ингредиента.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанной цели было разработано настоящее изобретение, которое относится к растворимому внеклеточному домену DLK1 (дельта-подобному гомологу 1).

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему внеклеточный растворимый домен DLK1, к рекомбинантному вектору, содержащему указанный полинуклеотид, и к штамму трансфицированной рекомбинантной клетки, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к внеклеточному растворимому домену DLK1 и к слитому белку DLK1-Fc, в который входит Fc-домен человеческого антитела.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему слитый белок DLK1-Fc, к рекомбинантному вектору, содержащему указанный полинуклеотид, и к штамму трансфицированной рекомбинантной клетки, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения слитого белка DLK1-Fc, включающему стадии:

1) культивирования рекомбинантного клеточного штамма; и

2) выделения слитого белка DLK1-Fc из среды для культивирования клеточного штамма.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для ингибирования метастазов рака, содержащей растворимый внеклеточный домен DLK1, полученный как описано выше, или слитый белок DLK1-Fc, используемый в качестве эффективного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов рака, включающему стадию введения фармацевтически эффективного количества внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc, полученного как описано выше, индивидууму с метастазами опухоли.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc для получения композиции для ингибирования метастазов рака.

Преимущественные эффекты

Слитый белок DLK1-Fc согласно изобретению, по сравнению с не слитым белком, имеет высокую стабильность, значительно снижает степень миграции клеток различных клеточных линий рака и оказывает превосходное действие, направленное на ингибирование метастазов рака даже при низких концентрациях, а поэтому он может быть использован в качестве эффективного ингредиента в композиции для ингибирования метастазов рака.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 проиллюстрирована структура белка DLK1, где

S: сигнальный пептид

1-6: повторяющиеся домены, подобные эпидермальному фактору роста (EGF)

JM: юкстамембранный домен

Tm: трансмембранный домен

Cy: внутриклеточный домен

На фиг.2 проиллюстрирована степень экспрессии гена DLK1 в ткани пациента, страдающего раком.

На фиг.3 проиллюстрирована степень экспрессии гена DLK1 в раковых клетках.

На фиг.4 представлена праймерная последовательность (SEQ ID NO. 2: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3'; и SEQ ID NO. 3: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3'), используемые в целях конструирования экспрессионного вектора для экспрессии слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.5 представлена структура вектора pYK602-His-DLK1, который представляет собой экспрессионный вектор для экспрессии слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.6 представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO. 1) клонированного DLK1.

На фиг.7 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO. 4) клонированного DLK1.

На фиг.8 проиллюстрирована экспрессия слитого белка DLK1-Fc, полученного из среды для культивирования клеток и выделенного после индуцирования экспрессии слитого белка DLK1-Fc в клетках 293Е.

На фиг.9 представлены результаты электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле для подтверждения присутствия очищенного слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.10 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака толстой кишки (SW620) под действием среды для культивирования клеток, содержащей слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.11 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии меланомы кожи (MDA-MB-435) под действием среды для культивирования клеток, содержащей слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.12 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии меланомы кожи (MDA-MB-435) под действием среды для культивирования клеток, содержащей внеклеточный растворимый домен DLK1 и растворимый слитый белок DLK1-Fc, где

sDLK1, sDLK1-Fc и Fc используются в концентрации 10 мкг/мл соответственно.

На фиг.13 представлен график, иллюстрирующий ингибирование миграции клеточной линии меланомы кожи (MDA-MB-435) под действием среды для культивирования клеток, содержащей внеклеточный растворимый домен DLK1 и растворимый слитый белок DLK1-Fc, где

sDLK1, sDLK1-Fc и Fc используются в концентрации 10 мкг/мл соответственно.

На фиг.14 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака молочной железы (Hs578T) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.15 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака молочной железы (MCF-7) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.16 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака матки (HeLa) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.17 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака толстой кишки (SW480) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.18 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака толстой кишки (HT29) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.19 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака почек (786-О) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.20 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака почек (UO-31) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.21 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака печени (HepG2) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.22 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака печени (SNU449) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.23 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака печени (SNU398) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.24 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака легких (A549) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.25 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака легких (NCIH23) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.26 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака легких (NCIH460) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.27 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака яичника (MDAH2774) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.28 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака яичника (IGROV-1) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.29 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака поджелудочной железы (Aspc-1) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.30 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака поджелудочной железы (HPAC) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.31 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака поджелудочной железы (MIA paca-2) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.32 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака желудка (SNU638) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.33 проиллюстрировано ингибирование миграции клеточной линии рака желудка (AGS) под действием среды для культивирования клеток, содержащей растворимый слитый белок DLK1-Fc.

На фиг.34 показаны число клеток в каждой клеточной линии, состав хемоаттрактанта и время инкубирования, используемые в тесте на подтверждение действия растворимого слитого белка DLK1-Fc, направленного на ингибирование миграции раковых клеток.

На фиг.35 представлен результат проведения теста на фармакокинетическое действие растворимого слитого белка DLK1-Fc.

На фиг.36 представлены фармакокинетические параметры sDLK1.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение более подробно описано ниже.

Настоящее изобретение относится к растворимому домену внеклеточной части DLK1 (дельта-подобного гомолога 1), к полинуклеотиду, кодирующему внеклеточный растворимый домен DLK1, к рекомбинантному вектору, содержащему указанный полинуклеотид, и к рекомбинантному клеточному штамму, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Внеклеточный растворимый домен DLK1, предпочтительно, может иметь, но не ограничивается ею, аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4.

Полинуклеотид, кодирующий указанный внеклеточный растворимый домен DLK1, предпочтительно может иметь, но не ограничивается ею, генную последовательность SEQ ID NO. 1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к внеклеточному растворимому домену DLK1 и к слитому белку DLK1-Fc, с которым объединен Fc-домен человеческого IgG.

Термин «слитый белок DLK1-Fc» означает рекомбинантную молекулу, содержащую фрагмент, происходящий от константного домена тяжелой цепи антитела. Fc-содержащий слитый белок может включать Fc-домен антитела, произвольно выбранного из Ig пяти классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), то есть включать весь константный домен СН2 и СН3 или его часть. Так, например, слитый белок DLK1-Fc может быть получен в форме, содержащей весь константный домен или часть константного домена тяжелой цепи на карбокси- и амино-концах внеклеточного растворимого домена DLK1. В другом примере, Fc-слитый белок может иметь форму, содержащую часть константного домена из двух или более тяжелых цепей антитела, а в описании настоящей заявки две тяжелые цепи Fc могут быть связаны дисульфидной связью или ковалентной связью. В другом примере, DLK1-часть слитого белка DLK1-Fc может иметь форму, содержащую два или более внеклеточных растворимых домена DLK1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему слитый белок DLK1-Fc, к рекомбинантному клеточному штамму, содержащему указанный полинуклеотид, и к трансфицированному рекомбинантному вектору, где указанный рекомбинантный вектор трансфицируют в клетку-хозяина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения слитого белка DLK1-Fc, включающему стадии:

1) культивирования рекомбинантного клеточного штамма; и

2) выделения слитого белка DLK1-Fc из среды для культивирования клеточного штамма.

Экспрессионным вектором, содержащим указанный ген, предпочтительно, является, но не ограничиваются им, вектор pYK602-His. При этом может быть использован любой вектор при условии, что он включает промотор экспрессии и Fc-домен млекопитающего.

Предпочтительной клеткой млекопитающего является, но не ограничивается ею, клетка 293Е. При этом может быть использован любой клеточный штамм млекопитающего, в котором данный промотор является функциональным.

В отличие от результатов предшествующих исследований, результаты, полученные авторами настоящего изобретения в ранее проведенных исследованиях с использованием микромассивов, показали, что уровень экспрессии DLK1 (см. фиг. 2) был значительно снижен, и такой феномен наблюдался, в частности, в тканях раковой опухоли молочной железы, поджелудочной железы и яичника (фиг. 2). Кроме того, за исключением лишь некоторых клеточных штаммов, экспрессия DLK1 в 67 раковых клеточных штаммах была очень низкой (см. фиг. 3). Исходя из вышеописанного характера экспрессии, можно сделать предположение, что DLK1 может функционировать как ген-суппрессор опухоли, а также как онкоген. В этом исследовании, в частности, использовался только растворимый домен, который представляет собой внешнюю часть клеточной мембраны, слущенной с клеточной мембраны под действием фермента, конвертирующего фактор некроза опухоли альфа (ТАСЕ), а поэтому он обладает как паракринным, так и аутокринным действием.

Растворимый Fc-слитый белок широко используется в in vitro экспериментах и в in vivo экспериментах и, по сравнению с не слитым белком, имеет много преимуществ, например он обладает более высокой стабильностью, в частности, в экспериментах на животных (Meg L et al., Methods in Molecular Biology 378:33-52, 2007). В настоящее время, растворимый Fc-слитый белок имеет широкое применение, поскольку он сохраняет антигенную специфичность лекарственных препаратов, содержащих человеческое антитело, что позволяет избежать вырабатывания множества иммунологических реакций. Репрезентативным лекарственным препаратом на основе человеческого антитела, содержащим растворимый Fc-слитый белок, является этанерцепт (Etanercept), то есть лекарственный препарат для лечения артрита, который выпускается фирмой Amgen и который получают путем объединения растворимого домена рецептора TNF2 с Fc человеческого IgG1 (патент США № 5447851).

В конкретном примере настоящего изобретения, для клонирования DLK1 в вектор pYK602-His осуществляли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием смеси библиотек ДНК (почек, плаценты, поджелудочной железы и печени) в качестве матрицы, а также праймеров SEQ ID NO. 2 (5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3') и SEQ ID NO. 3 (5'-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3') для селективной амплификации внеклеточного растворимого домена белка DLK1, после чего ПЦР-продукт подвергали ферментативной реакции с ферментом рестрикции SfiI, и получали рекомбинантный вектор pYK602-His-DLK1 путем объединения вектора pYK602-His и DLK1 (фиг. 4 и 5).

После этого ДНК pYK602-His-DLK1 переносили в клетки 293Е, восстанавливали на среде, и экспрессию слитого белка DLK1-Fc оценивали с помощью вестерн-блот-анализа (фиг. 8). Очистку проводили на колонке с белком А на среде с подтвержденной экспрессией, рН очищенного белка DLK1-Fc нейтрализовали, затем проводили диализ с использованием физиологического раствора, забуференного фосфатом калия (PBS), и осуществляли количественную оценку с помощью ВСА-анализа, после чего завершение очистки и количественной оценки подтверждали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (фиг. 9). Затем бактериальный эндотоксин удаляли из очищенного слитого белка DLK1-Fc на колонке с EndoTrap Red. В результате получали слитый белок DLK1-Fc.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для ингибирования метастазов рака, содержащей внеклеточный растворимый домен DLK1, полученный, как описано выше, или слитый белок DLK1-Fc в качестве эффективного ингредиента.

Раковым заболеванием может быть по меньшей мере одно заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака кожи, рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака кости, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой кишки, рака легких, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака заднего прохода, рака толстой кишки, рака фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почек, рака уретры, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки и опухолей центральной нервной системы, а более предпочтительно заболевание, выбранное из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака желудка и рака поджелудочной железы.

В конкретном примере настоящего изобретения было проанализировано влияние полученного слитого белка DLK1-Fc на раковую клеточную линию. То есть был проведен анализ на миграцию раковой клеточной линии с применением метода Chen H.C., Methods in molecular biology. 294:15-22, 2005, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, в результате исследования влияния очищенного слитого белка DLK1-Fc на метастазы различных раковых клеток было подтверждено, что слитый белок DLK1-Fc может ингибировать метастазы рака кожи (фиг. 11), рака молочной железы (фиг. 14 и 15), рака матки (фиг. 16), рака толстой кишки (фиг. 17 и 18), рака почек (фиг. 19 и 20), рака печени (фиг. 21-23), рака легких (фиг. 24-26), рака яичника (фиг. 27 и 28), рака поджелудочной железы (фиг. 29-31) и рака желудка (фиг. 32 и 33).

Кроме того, полученный внеклеточный растворимый домен DLK1 селективно экспрессировали и очищали, а затем использовали для обработки злокачественной меланомы кожи. В результате сравнения было подтверждено, что внеклеточный растворимый домен DLK1 может также заметно снижать степень миграции раковых клеток (фиг. 12 и 13).

Кроме того, для исследования эффективности указанного соединения в качестве лекарственного средства для ингибирования метастазов рака, на мышах был проведен эксперимент по определению фармакокинетических параметров. Принимая во внимание тот факт, что в этом эксперименте было инъецировано 5 мг/кг препарата (то есть 100 мкг/мышь в расчете на фактическую массу мыши) и что общий объем крови мыши составляет приблизительно 2 мл, максимальная концентрация, которая может быть введена путем внутривенной инъекции, составляет 50 мкг/мл. В соответствии с этим, значение 38,96 мкг/мл (Cmax), которое было получено в эксперименте с перитониальной инъекцией, можно считать высоким. Максимальная концентрация наблюдалась через 4 часа после инъекции (Tmax). Время полужизни, означающее время сохранения стабильности лекарственного средства in vivo, составляет приблизительно 20 часов, что указывает на то, что это лекарственное средство является достаточно стабильным in vivo (см. фиг. 36). Поскольку концентрация 10 мкг/мл является очень эффективной для ингибирования метастазов, если исходить из того факта, что концентрация приблизительно 10 мкг/мл сохраняется в течение 48 часов, то очевидно, что такое лекарственное средство, которое представляет собой новое лекарственное средство, является достаточно безопасным и эффективным для ингибирования метастазов рака (фиг. 35).

В соответствии с этим, растворимый домен во внеклеточном домене DLK1 или слитый белок DLK1-Fc, полученные, как описано выше, могут быть с успехом использованы в качестве эффективного ингредиента в композиции для ингибирования метастазов рака.

Композиция согласно изобретению может дополнительно включать эффективный ингредиент одного или нескольких типов с одинаковыми или аналогичными функциями. Композиция, предназначенная для введения, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель одного или нескольких типов. Композиция согласно изобретению включает 0,0001-10 масс.% или, предпочтительно, 0,001-1 масс.% белка в расчете на общую массу композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может включать физиологический раствор, дистиллированную воду, раствор Рингера, забуференный физиологический раствор, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и смесь одного или нескольких вышеперечисленных компонентов, а при необходимости, он может включать и другие стандартные добавки, такие как антиоксидант, буферный раствор, бактериостат или т.п. Композиция может быть также получена в виде лекарственной формы для инъекции, такой как водный раствор, суспензия или эмульсия, таблетка, капсула, порошок или драже, приготовленные путем дополнительного включения разбавителей, диспергирующего вещества, поверхностно-активного вещества, связующего вещества и замасливателя. Кроме того, указанная композиция может быть приготовлена в любой нужной форме в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, или от ингредиентов, входящих в состав данной композиции, с применением метода, описанного в публикации Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).

Композиция для ингибирования метастазов рака согласно изобретению может быть введена парентерально (например, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или местно) или перорально в дозе, которая может варьироваться в широких пределах в зависимости от массы тела, возраста, пола и состояния здоровья индивидуума, а также от режима питания, времени введения, способа введения, скорости экскреции и тяжести заболевания пациента. Для взрослых мужчин массой 60 кг количество вводимого белка составляет в пределах 0,738 мкг~7,38 г (в соответствии со стандартом, утвержденным Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), США), а предпочтительно в пределах 7,38 мкг~0,738 г (максимально допустимая доза 12,3 мкг), причем указанное количество белка желательно вводить один раз через день, однако схема введения может быть определена в соответствии с потребностями пациента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов рака, включающему стадию введения фармацевтически эффективного количества внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc, полученного как описанного выше, индивидууму с метастазирующей опухолью.

Внеклеточный растворимый домен DLK1 может предпочтительно иметь, но не ограничиваются ею, аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4.

Термин «слитый белок DLK1-Fc» означает рекомбинантную молекулу, содержащую фракцию, происходящую от константного домена тяжелой цепи. Fc-содержащий слитый белок может включать полноразмерные константные домены СН2 и СН3 или их часть, такую как Fc-домен антитела, произвольно выбранного из Ig пяти классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Так, например, слитый белок DLK1-Fc может быть получен в форме, содержащей весь константный домен или часть константного домена тяжелой цепи на карбокси- или амино-концах указанного внеклеточного растворимого домена. В другом примере, Fc-содержащий слитый белок может также иметь форму, включающую константные домены из двух или более тяжелых цепей антитела, где две тяжелые цепи могут быть соединены дисульфидной связью или ковалентной связью. В другом примере, DLK1-часть Fc-содержащего слитого белка может также иметь форму, включающую два или более внеклеточных растворимых домена DLK1.

Раковым заболеванием может быть заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака кожи, рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака кости, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой кишки, рака легких, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака заднего прохода, рака толстой кишки, рака фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почек, рака уретры, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки и опухолей центральной нервной системы, а более предпочтительно заболевание, выбранное из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака желудка и рака поджелудочной железы.

В зависимости от цели применения способ ингибирования метастазов рака согласно изобретению может включать парентеральное введение (например, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное или местное введение) в дозе, которая может варьироваться в широких пределах в зависимости от массы тела, возраста, пола и состояния здоровья индивидуума, а также от режима питания, времени введения, способа введения, скорости экскреции и от тяжести заболевания у пациента. В соответствии с настоящим изобретением, белок может быть введен, например, взрослым мужчинам массой в 60 кг (в соответствии со стандартом, утвержденным Управлением по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), США), в количестве, составляющем в пределах 0,738 мкг~7,38 г, а предпочтительно 7,38 мкг~0,738 г (максимально допустимая доза 12,3 мкг), причем указанное количество белка желательно вводить один раз через день, однако способ введения может варьироваться в зависимости от потребностей пациента.

В соответствии с настоящим изобретением был сконструирован рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий ген внеклеточного растворимого домена DLK1 вместе с геном Fc-домена антитела IgG, и был экспрессирован и очищен слитый белок DLK1-Fc из клеток 293Е, после чего было подтверждено заметное снижение степени миграции клеток под действием слитого белка DLK1-Fc, а также была подтверждена его эффективность как лекарственного средства для ингибирования метастазов рака путем вычисления фармакокинетических параметров. Это результат показал, что введение внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc индивидууму с метастазами опухоли может быть с успехом применено в способе ингибирования метастазов рака.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению внеклеточного растворимого домена DLK1 или слитого белка DLK1-Fc, полученного, как описанного выше, для получения композиции для ингибирования метастазов рака.

Внеклеточный растворимый домен DLK1 может предпочтительно иметь, но не ограничиваются ею, аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4.

Термин «слитый белок DLK1-Fc» означает рекомбинантную молекулу, содержащую фракцию, происходящую от константного домена тяжелой цепи. Fc-содержащий слитый белок может включать полноразмерные константные домены СН2 и СН3 или их часть, такие как Fc-домен антитела, произвольно выбранного из Ig пяти классов (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Так, например, слитый белок DLK1-Fc может быть получен в форме, содержащей весь константный домен или часть константного домена тяжелой цепи антитела на карбокси- или амино-концах указанного внеклеточного растворимого домена. В другом примере, Fc-содержащий слитый белок может также иметь форму, включающую константные домены из двух или более тяжелых цепей антитела, где две тяжелые цепи могут быть соединены дисульфидной связью или ковалентной связью. В другом примере, DLK1-часть Fc-содержащего слитого белка может также иметь форму, включающую два или более внеклеточных растворимых домена DLK1.

Раковым заболеванием может быть заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака кожи, рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака кости, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой кишки, рака легких, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака заднего прохода, рака толстой кишки, рака фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почек, рака уретры, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки и опухолей центральной нервной системы, а более предпочтительно заболевание, выбранное из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, из рака кожи, рака молочной железы, рака матки, рака толстой кишки, рака почек, рака печени, рака легких, рака яичника, рака желудка и рака подже