Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей

Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива.

Из литературных источников известен способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка, в котором в качестве одного из маркеров метастазирования используется фактор ингибитора апоптоза bcl-2 (RU 2445632 C1, опубл. 20.03.2012 г., Бюл. №8, G01N /33). Способ включает в себя определение маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркера апоптоза p53, отличающийся тем, что у больных раком желудка различного морфологического строения проводят иммуногистохимическое исследование (ИГХ), дополнительно определяют маркер апоптоза bcl-2 и устанавливают, что при абсолютных значениях при перстневидно-клеточном раке: p53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: p53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: p53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12% прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах, а при p53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов.

Известен способ прогнозирования метастазирования увеальной меланомы на основе маркеров апоптоза Bax и Bcl-2 (см. RU 2242766 C1, G01N 33/68, опубл. 20.12.2004). Способ включает иммуногистохимическое определение в удаленной опухоли наличия клеток, экспрессирующих Bax, и отличается тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих Bcl-2, и если первые выявляют, а вторые не выявляют, то прогнозируют высокую вероятность метастазирования. Однако приведенные известные исследования в совокупности факторов, выявляемых при иммуногистохимическом исследовании не обеспечивают прогнозирование неблагоприятного течения сарком мягких тканей.

Известен способ прогнозирования рецидива заболевания, в котором до и после операции по удалению саркомы мягких тканей у мужчин и женщин проводят биохимическое определение уровня креатинкиназы в крови больного и при показателях фермента до и после операции в пределах нормы прогнозируют длительный безрецидивный период, а при уровне фермента, значительно превышающем норму после операции, прогнозируют появление рецидива в ближайшие месяцы после операции (RU 2471191 C2, опубл. 27.12.2012, Бюл. №36).

Однако на наш взгляд предлагаемый авторами способ прогнозирования рецидива опухолевого образования по уровню креатинкиназы не совсем специфичен для сарком мягких тканей.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение точности и информативности способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей.

Технический результат достигают тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, и при выявлении клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 26 прогнозируют благоприятный исход.

Выбор в качестве маркеров метастазирования сарком мягких тканей таких белков, как EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, обусловлен их ролью в развитии рецидивирующего процесса. Так, белок CD34 локализуется в клетках эндотелия новообразованных тонкостенных сосудов и регулирует неоангиогенез. Белок bcl-2 экспрессируется на мембранах клеток опухолей, регулирует процессы апоптоза. Белок EGFR - трансмембранный гликопротеин, запускает внутриклеточный сигнальные каскады, приводящие к повышению пролиферации и росту клеток, ангиогенезу, метастазированию. Белок bcl-6 регулирует степень пролиферации и роста клеток опухоли.

Выбранный нами набор белков позволил оценить биологические потенции мягкотканных сарком, позволяющие дать оценку их прогрессии, рецидивирования, неоангиогенеза.

В таблице 1 представлены результаты ретроспективного исследования иммуногистохимических маркеров EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 в срезах тканей опухолей у 20 пациентов с рецидивирующей саркомой мягких тканей в анамнезе (1 группа) и у 20 пациентов с благоприятным исходом (без рецидивов) (2 группа). При сравнении результатов исследования между двумя группами пациентов обнаружено, что у пациентов с рецидивирующей саркомой мягких тканей наблюдалась гиперэкспрессия EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 белков, а у пациентов с саркомой мягких тканей без рецидивов наблюдалась слабая экспрессия белков EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2.

Маркер ИГХ	1 группа пациентов, количество (%) экспрессирующих клеток, n=20 p<0,05	2 группа пациентов, количество (%) экспрессирующих клеток, n=20 p<0,05
EGFR	70%	10%
CD 34	100%	7%
Bcl 6	73%	20%
Bcl 2	65%	10%

Подобных иммуногистохимических исследований при изучении прогнозирования сарком мягких тканей в доступной нам научно-медицинской и патентной литературе не встречалось.

Сравнительный анализ известных способов прогнозирования течения заболевания и предлагаемого нами способа позволяет выявить его новизну и отличия от известных.

Новизна способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей заключается в использовании дополнительных маркеров, отвечающих за пролиферацию и рост клеток (EGFR, bcl 6), апоптоз (bcl 2) и за ангиогенез (CD 34) с целью повышения точности прогноза рецидивирования заболевания после оперативного удаления опухоли.

Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.

1. После удаления опухоли мягких тканей готовили из стандартного блока с опухолью 2 парафиновых среза толщиной 3-5 микрон по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов. Четыре среза использовали для проведения иммуногистохимической реакции с маркерами EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2. Последовательность этапов проведения реакции с каждым из маркеров совпадала.

2. Иммуногистохимическое исследование по оценке экспрессии EGFR, CD 34, Вс12, Вс16 проводили по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводили обработку срезов в цитратном буфере [pH 6,0] в течение 30 минут при 95°C на водяной бане.

3. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°C. В качестве первичных антител при оценке экспрессии EGFR, CD 34, Вс12, Вс16 использовали мышиные моноклональные антитела к данным маркерам (разведение EGFR - 1:70, CD 34-1:150, bcl 6 - RTU, bcl-2 - 1:100, фирма производитель DAKO Corp).

4. Для визуализации реакции антиген-антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+[DAKO Corp].

5. Затем срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

6. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение ×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

При наличии клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 оценивали прогноз для пациента как неблагоприятный (развитие рецидивов в короткие сроки), а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогноз расценивался как благоприятный (без рецидивов).

Приводим клинический пример использования способа

Пример 1

Больной А, 49 лет. История болезни №23425/ц.

Образование мягких тканей правого бедра заметил в августе 2007 года. Самостоятельно обратился в РНИОИ.

Отлечен комплексным методом лечения.

21.11.2007 года выполнена операция - удаление опухоли мягких тканей правого бедра.

Гистологическое заключение №982276-282/07 - злокачественная фиброзная гистиоцитома, гигантоклеточный вариант, обширные очаги некроза, степень дифференцировки G2 (умереннодифференцированная).

Данные иммуногистохимического исследования парафинового среза опухоли: выявлено EGFR - позитивных клеток 70%, CD 34 - позитивных клеток 100%, bcl 6 - позитивных клеток 73%, bcl 2 - позитивных клеток 65%. Больного отнесли в группу высокого риска развития метастазов и сократили интервалы между визитами к врачу.

С 20.12.2007 г. по 30.12.2007 г. прошел лучевое лечение в СОД 50 Гр на послеоперационный рубец и пути лимфооттока.

С 17.01.2008 г. по 22.01.2008 г. прошел 2 курса адъювантной химиотерапии:

Доксорубицин 100 мг, Циклофосфан 1600 мг, Цисплатин 100 мг.

В марте 2009 года обнаружено образование в послеоперационном рубце. Диагностирован рецидив опухоли.

30.03.2009 г. выполнена операция: широкое иссечение рецидива опухоли мягких тканей правого бедра.

Пример 2

Больная Б, 74 года. История болезни №2251/ф.

В сентябре 2004 г. заметила опухоль в левой пахово-подвздошной области, обратилась к врачу по месту жительства, направлена в РНИОИ.

Отлечена комплексным методом лечения.

02.03.2005 года выполнена операция: удаление саркомы мягких тканей левой паховой области.

Гистологическое заключение №95234-235/05 - злокачественная фиброзная гистиоцитома, гигантоклеточный вариант, обширные очаги некроза, степень дифференцировки G3.

По данным иммуногистохимического исследования парафинового среза опухоли выявлено EGFR - позитивных клеток 10%, CD 34 - позитивных клеток 7%, bcl 6 - позитивных клеток 24%, bcl 2 - позитивных клеток 10%, что расценено нами как благоприятный прогноз.

Прошла курс в СОД 40 Гр после операции на послеоперационный рубец и пути лимфооттока.

С 7.05.2005 г. по 15.05.2005 г. - прошла 3 курса адъювантной химиотерапии по схеме:

Винкристин 2 мг, доксорубицин 100 мг, циклофосфан 1200 мг

Больная планово проходила диспансерное наблюдение в РНИОИ, данных за рецидив в послеоперационном рубце, метастазирование нет.

Последняя явка 14.12.2012 г. - состояние больной удовлетворительное, жалоб не предъявляет. Послеоперационный рубец без признаков рецидивирования.

Таким способом был рассчитан прогноз 20 больным.

Разработанный способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей является промышленно применимым. С помощью этих прогностических факторов можно прогнозировать исход заболевания и планировать лечебные мероприятия.

Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей, включающий иммуногистохимическое исследование ткани удаленной опухоли, отличающийся тем, что определяют наличие клеток, экспрессирующих белки EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, при выявлении клеток с гиперэкспрессией белков EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, при выявлении клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют благоприятный исход.