Штамм вируса гриппа а/17/виктория/2011/89 (h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
Патент 2532844
Авторы
- Александрова Галина Ибрагимовна (RU)
- Баженова Екатерина Андреевна (RU)
- Дубровина Ирина Анатольевна (RU)
- Киселева Ирина Васильевна (RU)
- Ларионова Наталья Валентиновна (RU)
- Руденко Лариса Георгиевна (RU)
Правообладатели
Классы МПК
- C12N7 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)
- A61K39/145 - Orthomyxoviridae, например вирус гриппа
Штамм вируса гриппа а/17/виктория/2011/89 (h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии. Штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и остальные шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» под номером 2724. Изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости сезонным гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из указанного штамма. 1 ил., 6 табл.,
Реферат
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А, А/17/Виктория/2011/89 (H3N2).
Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 сероподтипа (H3N2) - прототип изобретения [Патент РФ № 2416640, дата приоритета 11.01.2010. Опубл. БИ №11, 2011, 27.06.2011] - утратил антигенную актуальность и, вследствие этого, не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Виктория/361/2011 (H3N2).
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности для взрослых и для детей на основе нового дрейфового варианта вируса гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2). Штаммы вирусов гриппа для живых вакцин, применяемые в настоящее время, получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - С.387-395.]. Донором аттенуации для гриппозных вакцин типа А является А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) -холодоадаптированный (са) температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. 151 с.].
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие антигенно значимые поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от циркулирующего эпидемического вируса, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), от безопасного донора аттенуации.
В результате предлагаемого изобретения получен вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), для чего использовали метод генетической реассортации эпидемического вируса А/Виктория/361/2011 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Изобретение осуществили посредством инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах и последующей селекции клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищали трехкратным клонированием методом предельных разведений под прессом антисыворотки к донору при пониженной (25°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистые клоны были проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям к вакцинному штамму.
Заявляемый вакцинный штамм характеризуется следующими свойствами. Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Виктория/361/2011 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.
Формула генома 6:2 вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины, т.е. гены, кодирующие поверхностные белки НА и NA, принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Виктория/361/2011 (H3N2), а гены, кодирующие внутренние
| Таблица 1 | ||||
| Праймеры для скрининга реассортантных вирусов гриппа сероподтипа A (H3N2) - кандидатов в живую вакцину на основе эпидемически актуального вируса и донора аттенуации | ||||
| Сегмент генома | Родительский вирус | Нуклеотидная позиция | Последовательность прямого праймера (5'→3') | Последовательность обратного праймера (5'→3') |
| ЭВa | 1477-2115 | GGTGTGGATGAATACTCCAGTA | CATATCCCTCATGCACADTTAGC | |
| РВ2 | донор attb | 1273-2118 | GGTGATCTGAATTTCGTTAATAGG | GCCCATTTTGCTGACTCTTAAC |
| РВ1 | ЭВ | 1755-2223 | GAAGCTGTGGGATCAAACCCAA | GTTAATGCTCTAATTAGGTAAC |
| донор att | 1206-2169 | TCTCCTAATAGATGGCACAGTC | AGTTTGGTCCTCCATCCGAAAT | |
| PA | ЭВ | 970-1851 | GGATGGAAAGAACCTTATATAGTC | GCCTGAACAATGAGGAGCAAC |
| донор att | 914-1712 | ACGAAGGAGAGGGAATACCAC | GTCCTGCAGTTCTGCCAGTAAT | |
| ид | ЭВ | 29-593 | CATGAAGACCATCATTGCTTTGAGCTAC | CCACCCATCTACCATTCC |
| tLr\ | донор att | 6-858 | AAGCAGGGGTTATACCATAGACAACCAAAA | CCTTCTGTTTTCATGATCCCTGAACTACCT |
| NP | ЭВ | 135-1122 | GAAGATGATTGATGGAATTGGGA | GATCCTTCATTACTCATGTCAAAG |
| донор att | 640-1331 | CGTGGGATCAATGATCGGAAC | GAAAGTTTCCCCCTTGGGAT | |
| NA | ЭВ | 34-568 | AAAGATAATAACRATTGGCTCTGTT | TATTTTAGTACAGCCAC |
| донор att | 902-1334 | TGGAAAGGCTCTAATAGGCCCGTTA | CCATCAGTCATTACTACTG | |
| M | ЭВ | 51-547 | CGTATGTTCTCTCTATCGTTCCA | CACATATAAGGCCAAATGCTGA |
| донор att | 53-887 | TACGTTCTCTCTATCGTCCCG | TTTTCAGACCGTGTTTAAAGAAG | |
| мс | ЭВ | 86-78 | ACAAGTTGTAGACCAAGAACTGA | AGCCATCTTATTTCTTCAAACTTC |
| 11 0 | донор att | 13-726 | GTGACAAAGACATAATGGATCCT | ATTTGCTCAAAACTATTCTCTGTTA |
| a - Эпидемически актуальные вирусы гриппа А сероподтипа (H3N2). b - Донор аттенуации А/Ленинград /134/17/57 (H2N2). |
белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Это установлено методом «да-нет» PCR. Метод основан на сравнении ДНК-копий участков РНК вирусов, амплифицированных с помощью селективно работающих праймеров (табл.1).
Подобраные праймеры специфично работают либо только с последовательностями генов донора аттенуации, либо только с последовательностями современных эпидемических вирусов [Киселева И.В., Voeten J.T.M., Teley L.C.P. и др. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - №4. - С.29-36].
На фиг.1, в качестве примера, представлен электрофорез в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида, амплифицированных ДНК фрагментов гена, кодирующего белок РА с праймерами специфичными (а) - для эпидемического вируса гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2), (б) - для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Обозначения: 1-я дорожка - маркер молекулярного веса; 2 и 5-я дорожки - РА ген донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), 3, 4 и 6-я дорожки - РА ген кандидата в вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), 7-я дорожка - РА ген эпидемического вируса гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2).
Результаты анализа всех генов в составе генома вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Состав генома реассортантного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) | |||
| Ген | Родительские вирусы | Реассортантный вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) | |
| Эпидемический вирус А/Виктория/361/2011 (H3N2) | Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) | ||
| РВ2 | ЭВ1 | Лен172 | Лен17 |
| РВ1 | ЭВ | Лен 17 | Лен17 |
| РА | ЭВ | Лен17 | Лен17 |
| НА | ЭВ | Лен17 | ЭВ |
| NP | ЭВ | Лен17 | Лен17 |
| NA | ЭВ | Лен17 | ЭВ |
| М | ЭВ | Лен17 | Лен17 |
| NS | ЭВ | Лен17 | Лен17 |
| 1 - Ген принадлежит эпидемическому вирусу гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2). 2 - Ген принадлежит донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2). |
В экспериментах in vitro определены фенотипические свойства полученного штамма. Вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) является температурочувствительным (ts маркер: <1 lg ЭИД50/мл при 40°С, где ЭИД50 - эмбриональная инфекционная доза, вызывающая гибель 50% РКЭ) и холодоадаптированным (са маркер: 6,7 lg ЭИД50/мл при 26°С).
Стабильность его фенотипических признаков подтверждена анализом способности к репродукции при оптимальной температуре (32°С) и при температурах за пределами температурного оптимума (25°С и 40°С) до и после его пятикратного пассирования в куриных эмбрионах (табл.3).
| Таблица 3 Фенотипические свойства вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) до и после его пассирования в куриных эмбрионах | ||||||
| Вирус | Титр, lg ЭИД50/0.2 мл | RCT25 | RCT40 | Фенотип | ||
| 32°С | 25°С | 40°С | ||||
| А/Ленинград/134/17/57 | 8.2 | 6.5 | 2.0 | 1.7 | 6.2 | ts, ca |
| А/Виктория/361/2011 | 7.5 | 1.3 | 7.0 | 6.2 | 0.5 | non-ts, non-ca |
| А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), до пассирования | 8.5 | 7.3 | <1.0 | 1.2 | >7.5 | ts, ca |
| А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), 5-й пассаж | 8.2 | 7.0 | <1.0 | 1.2 | >7.2 | ts, ca |
У созданного штамма установлена генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах «до» и «после» пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Секвенированием генов кандидата в вакцинный штамм продемонстрирована идентичность мутаций во всех внутренних генах донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) «до» и «после» его пятикратного пассирования, в том числе, в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл. 4).
| Таблица 4. Кодирующие мутации в геноме вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) по сравнению с донором аттенуации А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) и его диким предшественником, вирусом А/Ленинград/13 4/5 7 (H2N2) | ||||||
| Ген | Нуклеотид | Аминокислота | Мутации | |||
| Лен/wt1 | Лен 17 | А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) | ||||
| до пассирования | 5 пассаж | |||||
| РВ2 | 1459 | 478 | Val | Leu | Leu | Leu |
| РВ1 | 819 | 265 | Lys | Asn | Asn | Asn |
| 1795 | 591 | Val | He | He | He | |
| PA | 107 | 28 | Leu | Pro | Pro | Pro |
| 1045 | 341 | Val | Leu | Leu | Leu | |
| NP | NP ген донора аттенуации не содержит мутаций | |||||
| Ml | 68 | 15 | He | Val | Val | Val |
| NS2 | 798 | 100 | Met | He | He | He |
| 1 Наличие мутаций в геноме вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) определяли сравнением его аминокислотных последовательностей с последовательностями дикого предшественника донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а именно, с вирусом дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), с помощью секвенирования. | ||||||
| Обозначения: Лен 17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); Лен/wt вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации. |
У созданного штамма была проверена чувствительность к неспецифическим гамма-ингибиторам сыворотки крови, реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с нормальной (неиммунной) сывороткой крови лошади, прогретой 10 минут при 80°С. Продемонстрировано, что вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), равно как и его эпидемический родитель А/Виктория/361/2011 (H3N2), высоко устойчивы к гамма-ингибиторам сыворотки крови лошади.
Изучение острой токсичности вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) проводили в экспериментах на белых мышах обоего пола. Мышам вводили вирус внутрибрюшинно однократно в объеме 0.5 мл. Животным контрольной группы не вводили ничего. Безвредность вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) оценивали по выживаемости животных и прибавке в весе. Вирус вводили в дозе 71g ЭИД50/0.2мл. В результате испытаний установлена безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его внутрибрюшинном введении. Отмечена прибавка в весе животных при их 100%-ной выживаемости (табл. 5).
| Таблица 5. Результаты изучения безвредности вакцинного штамма в экспериментах на мышах | |||
| Пол | Введено | Выжило | Прибавка веса, г |
| Самцы | ВШ в/б | 10/10 | +1.2 |
| Самки | ВШ в/б | 10/10 | +1.4 |
| Самцы | контроль | 10/10 | +1.4 |
| Самки | контроль | 10/10 | +1.3 |
| Обозначения: ВШ - вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2);в/б - внутрибрюшинное введение. |
У нового штамма определяли аттенуацию и нейровирулентность для мышей. Изучение аттенуирующих свойств вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) проводили в экспериментах на белых мышах после их интраназального заражения, оценивая степень репродукции вируса в легких по сравнению с уровнем репродукции донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его дикого предшественника, вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2).
Отсутствие нейровирулентной активности у вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) изучали путем интраназального заражения мышей с последующим выделением вируса из ткани мозга. В качестве контроля был использован нейровирулентный штамм вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1). Вирусы вводили в дозе 7 lg ЭИД50/0.2мл.
Опыты показали, что вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) выделялся из легких и носовых ходов мышей в титрах, аналогичных донору аттенуации А/Ленинград/13 4/17/5 7 (H2N2). При этом вирусы дикого типа, такие как А/Ленинград/134/57 (H2N2) и A/WSN/33 (H1N1), использованные в тестировании созданного штамма, активнее репродуцировались в легких мышей по сравнению с холодоадаптированными вирусами (табл. 6), что подтверждает аттенуированный фенотип вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2). Установлено полное отсутствие проникновения вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) в мозг инфицированных животных после их интраназального заражения при активной репродукции в мозговой ткани нейровирулентного вируса A/WSN/33 (H1N1).
| Таблица 6 Изучение репродукции вакцинного штамма во внутренних органах мышей после интраназального заражения | |||
| Введенный мышам вирус | Выделение вируса из органов, lg ЭИД50/0.2 мл | ||
| Легкие | Носовые ходы | Мозг | |
| Лен 17 | 2.1 | 1.2 | Не выделен |
| Лен/wt | 5.5 | 3.6 | Не выделен |
| А/17/Виктория/2011/89 | 2.1 | 1.3 | Не выделен |
| A/WSN/33 | 6.3 | 4.8 | 5.3 |
| Плацебо | Не выделен | Не выделен | Не выделен |
| Обозначения: Лен17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);Лен/wt - вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации. |
Обозначения: Лен17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);
Лен/wt - вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации.
В ходе исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Виктория/361/2011 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Инфекционная активность вакцинного штамма при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8,8 lg ЭИД50/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Штамм аттенуирован и безвреден для лабораторных животных. Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Таким образом, вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) по биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП Р№ 003224/01-050210 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения и действующему приказу Министерства здравоохранения РФ от 07.08.1998 №156/79 «О подготовке новых вакцинных, производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцин и диагностических препаратов».
В прилагаемом паспорте на штамм указаны требуемые для вакцинного штамма характеристики.
Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Штамму присвоен № депонента ГКВ № 2724.
ПАСПОРТ ВАКЦИННОГО ШТАММА
1 Название штамма А/17/Виктория/2011/89
2 ИЭМ№ 8995.
3 Серия (Лот №) Серия №1.
4 Сероподтип H3N2.
5 Метод подготовки Классическая реассортация в куриных эмбрионах.
6 Родительские вирусы.
6.1 Эпидемический штамм: А/Виктория/361/2011 (H3N2); CDC ID# 2012702646.
6.2 Донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
7 Пассажи в куриных Е7/Е1 (совместное заражение, два селективных пассажа, эмбрионах в процессе четыре клонирования и одно накопление) реассортации
8 Состав генома Гены РВ2, FBI, PA,NP, M и NS от донора аттенуации, НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2).
9 Характеристика штамма до лиофильной сушки.
9.1 Оптимальные условия накопления 32°С, 48 часов.
9.2 Титр ГА 1:1024 с 1.0% куриными эритроцитами.
9.3 Титр вируса при оптимальной температуре 32°С 8.8 log10 ЭИД50/мл.
9.4 Взаимодействие с неспецифическими γ-ингибиторами сыворотки крови лошади и морской свинки: устойчив.
9.5 ts маркер: <1 lg ЭИД50/мл при 40°С (ts фенотип).
9.6 са маркер: 6.7 lg ЭИД50/мл при 26°С (са фенотип).
10 Характеристика штамма после лиофильной сушки
10.1 Дата лиофилизации: 16.04.2012 г.
10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл.
10.3 Титр вируса при 32°С: 8.0 lg ЭИД50/мл.
10.4 Титр ГА - 1:512 с 1.0% куриными эритроцитами.
11 Антигенная специфичность
11.1 Гемагглютинин: идентичен эпидемическому вирусу А/Виктория/3 61/2011 (H3N2), что подтверждено в РТГА с гипериммунной крысиной сывороткой.
11.2 Нейраминидаза: идентична эпидемическому вирусу А/Виктория/3 61/2011 (H3N2), подтверждено секвенированием.
12 Токсикологическое: Не токсичен после внутрибрюшинного заражения исследование in vivo (острая мышей токсичность)
13 Контроль стерильности Стерилен (30.04.2012).
Штамм вируса гриппа А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России под номером 2724, для получения живой гриппозной интраназальной эпидемической вакцины для взрослых и для детей.