Способ предупреждения развития и уменьшения выраженности алкогольной мотивации

Способ предупреждения развития и уменьшения выраженности алкогольной мотивации

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может быть использовано для угнетения алкогольной мотивации в комплексном лечении хронического алкоголизма, а также в экспериментальной фармакологии для разработки средств направленной коррекции алкогольной зависимости и соматических осложнений алкоголизма у человека.

Алкоголизм является не только социальной, но и сложной медико-биологической проблемой. Развитие алкоголизма и его органных осложнений имеет гетерохимическую природу и связано с нарушением функций опиоидной, дофаминергической и др. систем, а также алко-гольметаболизирующих процессов. В то же время нейрохимические механизмы формирования начальной стадии алкоголизма - алкогольной зависимости, и в первую очередь, становления мотивации к многократному повторному приему этанола - остаются недостаточно выясненными. При этом следует подчеркнуть, что в большинстве исследований основное внимание уделяется выяснению и разработке способов направленной коррекции (см., например, Spanagel R. Alcoholism: A Systems Approach from Molecular Physiology to Addictive Behavior // Physiol. Rev. 2009. V.89. P.649-705) нарушений, обусловленных прямым и косвенным длительным воздействием алкоголя за счет его физико-химических и фармакодинамических влияний на различные нейромедиаторные и нейропептидные системы, обеспечивающих нарушения взаимоотношений мозговых систем подкрепления, отвергания и реагирования организма на стресс.Можно констатировать, что многие применяемые в настоящее время схемы лечения хронического алкоголизма (см., например, там же), являются часто эмпирическими и малоэффективными.

Известно, что ренин-ангиотензиновая система (РАС) играет ведущую роль в регуляции адаптационно-трофических процессов, участвуя в поддержания жизненно-важных физиологических констант организма (артериальное давление, электролитный состав крови, осмотическое давление и др.). Ее отдельные компоненты также вовлечены в опосредование мотивационных и эмоционально-окрашенных состояний, предопределяющие инициацию и субъективную оценку реализации целостных поведенческих актов (см., в частности, Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).

Поскольку алкоголь потребляется, как правило, в виде жидкости, в составе водных растворов, злоупотребление в его приеме сочетается со стойкими нарушениями в механизмах поддержания водно-солевого баланса, а также перестройкой гомеостатических механизмов контроля кардиоваскулярных функций, сопровождающейся дисрегуляцией артериального давления и гемодинамики (Судаков К.В., Котов А.В., Келешева Л.Ф., Мещеряков А.Ф., Азаров А.В. Нейрофизиологические основы формирования алкогольной мотивации в эксперименте // Вопросы наркологии. 1990. №3. С.7-14).

Имеются убедительные сведения, что потребление алкоголя может модулироваться активностью РАС (там же). Однако анализ имеющихся литературных данных показал, что экспериментальные факты о взаимосвязи активности РАС и потребления алкоголя являются несистематизированными, разнородными и противоречивыми. Они касаются, как правило, либо различных особенностей изменения активности РАС в условиях однократного или токсического действия этанола (Cain M.L., Hester R.L., Izevbigie Е.В. Ethanol abrogates Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell growth // Med. Sci. Monit. 2006. V.12. N5. P.BR162-168), либо влияния модуляции активности РАС на метаболические изменения, развивающиеся при длительном, принудительном потреблении алкоголя (Kazim Н., Vazquez М., Ansari R.A., Malafa М.Р., Lalla J. Chronic alcohol-induced oxidative endothelial injury relates to angiotensin II levels in the rat // Mol. Cell. Biochem. 2007. DOI 10.1007/s11010-007-9583-6). Данные о систематических и целенаправленных исследованиях механизмов специфического участия РАС в процессах становления алкогольной мотивации в научной литературе не обнаружены.

Известно также, что хроническая алкоголизация сопровождается не только нарушениями регуляции базисных физиологических реакций, но и деструктивными процессами в тканях организма. Изменение содержания продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов, изменение активности протеаз, факторов свертывания крови и др. являются маркерами повреждения тканей при патологических состояниях, в том числе и при алкоголизме. К таким же маркерам относят и содержание в крови факторов антиоксидантной защиты (SH-группы белков, нитраты/нитриты, активность каталазы и др.) (Deng Xin-Sheng, Deitrich R.A. Ethanol Metabolism and Effects: Nitric Oxide and its Interaction // Current Clinical Pharmacology, 2007, 2, 145-153). Считают, что с этим связано токсическое действие алкоголя и его метаболитов на органы и ткани организма, а также развитие неспецифического иммунодефицита и аутоиммунных процессов, по отношению к антигенам мозга, печени, сердца и др. органов (Crews F.T., Nixon K. Mechanisms of Neurodegeneration and Regeneration in Alcoholism // Alcohol & Alcoholism V.44, No.2, pp.115-127, 2009), развивающихся в результате неспецифической модификации белков этими реактогенными соединениями. При этом аутоантитела такого рода рассматривают лишь в качестве маркеров хронического действия этанола. Обнаружено также, что при алкоголизации у животных и человека развивается неспецифическое иммунодефицитное состояние по иммуноцитологическим показателям (там же).

Следует отметить, что повышение уровня свободнорадикальных соединений является также признаком активации РАС, причем эти соединения являются одним из ключевых звеньев в механизмах сигнальной трансдукции, запускающихся при взаимодействии основного пептида PAC - ангиотензина-II (A-II) со специфическими рецепторами (Prasad K. Oxyradicals as a mechanism of angiotensin-induced hypertension // Intern. J. Angiology. 2004. V.13. P.13-59). Напротив, система оксида азота (NO) подавляет образование свободнорадикальных соединений и модулирует деятельность иммунной системы, играя роль физиологического антагониста этих процессов (там же).

Однако, в области изучения алкоголизма и при оценке эффектов этанола в экспериментальных исследованиях, учет динамики таких факторов проводится лишь в единичных случаях. В этой связи задачей, решаемой при создании заявленного способа, является проведение комплексных исследований динамики показателей, отражающих образование свободнорадикальных соединений и состояние систем антиоксидантной защиты, в корреляции с поведенческими и иммунологическими данными на разных стадиях становления и реализации алкогольной зависимости особи - человека и на животных в модельных экспериментах. Результат, который может быть получен при решении такой задачи, состоит в изменении уровня регуляторных пептидов (РП) для модуляции активности РАС в организме.

Для достижения поставленного результата, предлагается способ предупреждения развития и/или уменьшения выраженности алкогольной мотивации, заключающийся в иммунизации особи путем введения ей конъюгата ангиотензина с бычьим сывороточным альбумином (БСА), при этом в качестве ангиотензина предпочтительно использовать ангиотензин-I (A-I).

Способ иллюстрируется рис.1, на котором представлена схема среднесуточного потребления воды и этанола в условиях свободного выбора у крыс, подвергнутых активной иммунизации БПК ангиотензина-I до и после алкоголизации (в процентах к суммарному объему потребляемой жидкости).

Возможность достижения поставленного результата, по мнению авторов, обусловлена следующим.

Известно, что ангиотензиноген (Анг) под воздействием ренина преобразуется в ангиотензин-I (A-I), который характеризуется слабовыраженным сродством к специфическим ангиотензиновым рецепторам и не проявляет отчетливой физиологической активности. A-I под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) превращается в основной эффекторный пептид PAC - А-II, который, в свою очередь, под действием различных амино- и карбоксипептидаз подвергается дальнейшему процессингу с образованием более коротких пептидов: ангиотензина-III (А-III), ангиотензина-IV (A-IV) и ангиотензин-II_1-7 (A-II_1-7). Наиболее изучены физиологическая активность и мембранные рецепторы A-II (ATI или АТ2). A-III сходен по физиологическому действию с A-II, взаимодействует с этими же рецепторами. В отличие от него, пептиды A-IV и A-II_1-7 имеют собственные специфические рецепторы и физиологическую активность (Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).

Экспериментальный опыт иммунизации интактных животных конъюгатами некоторых РП (Анг, A-I, А-II, А-III, бета-эндорфин и др.) свидетельствует о возможности достижения эффекта долгосрочного и существенного увеличения содержания указанных эндогенных РП в организме на фоне отчетливого специфического иммунного ответа, а также характерных для данных пептидов проявлений их физиологического действия (по поведенческим и биохимическим показателям). Ранее показано, что процедура иммунизации конъюгатом белка-предшественника всех ангиотензинов - Анг до и после окончании алкоголизации приводит к разнонаправленным эффектам в произвольном потреблении этанола у опытных животных, соответственно подавляя или активируя проявления искусственно выработанной алкогольной зависимости. Эти эффекты сопряжены с фазными изменениям в образовании свободнорадикальных соединений и в процессах антиоксидантной защиты. Выявлены также однонаправленные сдвигов показателей гуморального и клеточного иммунитета в динамике активной иммунизации животных конъюгатом Анг, осуществляемой до и после алкоголизации крыс (Котов А.В., Толпыго С.М., Певцова Е.И. с соавторами Ангиотензиноген в механизмах становления и реализации алкогольной зависимости // Нейрохимия. 2006. Т.23, №2. С.143-155). Увеличение содержания Анг приводит к генерализованной активации РАС и увеличению образования всех ангиотензинов - продуктов его процессинга. Напротив, A-I обладает наименее выраженной физиологической активностью, по сравнению с другими пептидами РАС. Известно, что в A-I при действии АПФ, превращается в А-II, а под действием структурного гомолога АПФ-АПФ2 превращается в А-II_1-7, который является функциональным антагонистом А-II. Данный альтернативный путь расщепления A-I является преобладающим в условиях значительного увеличения его концентрации (Kurdi М., De Mello W., Booz G.W. Working outside the system: an update on the unconventional behavior of the renin-angiotensin system components // International J. Biol. Chem. Cell Biol. 2005. V.37. 1357-1367). Это позволяет сделать вывод, что в условиях иммунизации животных БПК A-I и вызванного таким способом длительного повышения уровня A-I в организме можно выявить его собственную, вероятно, компенсаторную роль в нейрохимических механизмах искусственно выработанной алкогольной зависимости у животных.

Пример. Влияние конъюгата ангиотензина-I (A-I) с бычьим сывороточным альбумином (БСА) на процессы формирования и реализации алкогольной мотивации у крыс с искусственно выработанной алкогольной зависимостью.

В первой серии эксперименты были выполнены на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). Крысы были предварительно иммунизированы конъюгатом A-I с БСА, а затем через 2 недели после иммунизации, также как контрольные животные, были подвергнуты принудительной хронической алкоголизации путем замены воды на 20% раствор этилового спирта в течение 3 месяцев и помещены в условия свободного выбора между водой и 20% раствором этанола.

Во второй серии опыты проводили на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). В этой серии животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА после предшествующей хронической алкоголизации в течение 3 месяцев через 2 недели содержания в условиях свободного выбора между водой и 20% раствором этанола. В условиях свободного выбора у всех крыс оценивали суточное количество воды и алкоголя, произвольно потребляемого каждым животным в течение 4 месяцев.

Животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, п/к, пятикратно с интервалом 14 дней, в дозе 300 мкг/кг A-I, химически связанного с БСА. Контрольным крысам по такой же схеме инъецировали физиологический раствор.

Конъюгат A-I с БСА синтезировали с использованием карбодиимидного метода. При использовании бифункционального связывающего соединения (1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил)-карбодиимид) химически соединяли молекулы пептида A-I (фирмы «Ameri-can Peptide Company Inc.», USA) с молекулами БСА (фирмы «Sigma», USA), образуя тем самым конъюгаты ангиотензина-I с белком. Степень связывания пептида с белком-носителем определяли с применением хроматографического анализа по изменению аминокислотного состава кислотных гидролизатов конъюгата и белка-носителя, обработанных связующим соединением. Наряду с этим оценивали включение в состав конъюгата меченого по I¹²⁵ пептида. Полученный данным способом конъюгат содержал 10-12 молекул пептида на 1 молекулу белка.

У всех животных на 10-12 день после 2-й и 5-й иммунизации, а также через 1 и 3 месяца после начала алкоголизации отбирали пробы крови для определения титров антител к A-I, биохимических показателей и иммуноклеточного статуса. Определения уровня антител к A-I проводили в сыворотке крови крыс с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием микропланшет Costar (фирмы Corning Inc, США), сенсибилизированных Анг или БСА, и последующего связывания исследуемой антисыворотки конъюгатами иммуноглобулинов G против Ig G крысы с пероксидазой хрена. Конечное определение проводили с субстратной смесью, содержащей орто-фенилендиамин и перекись водорода, при сканировании на автоматическом микрофотометре «Multiscan ЕХ» (фирма Lab system, Швейцария) при длине волны 492 нм.

В ходе проведения экспериментов учитывали токсическое действие алкоголя на центральную нервную систему и внутренние органы по ряду биохимических показателей в сыворотке крови крыс. При этом оценивали свободнорадикальное перекисное окисление липидов (ПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА), ферментативную (каталаза) и неферментативную (сульфгидрильные группы - SH-группы) антиокислительную активность, а также содержание триглицеридов. Одновременно определяли активность органоспецифических ферментов, как маркеров повреждения тканей, - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ).

Уровень МДА в плазме крови определяли по методу Gorog P. et al., SH-групп - по методу Wayner D.D. М. et al., активность каталазы по методу Королюк М.А. с соавт. Активность АЛТ, ACT, γ-ГТ и содержание триглицеридов оценивали с использованием стандартных диагностических наборов фирмы Diasys (Германия).

Исследовались следующие показатели иммуноклеточного статуса: общее количество лейкоцитов, процентное и абсолютное количество лимфоцитов, T-лимфоцитов и их субпопуляций - T-хелперов/индукторов и Т-эффекторов/супрессоров, DN-клеток или Т-лимфоцитов с двойной отрицательной меткой, не несущих ни Т-хелперных, ни Т-супрессорных маркеров, В-лимфоцитов, NK-клеток (или естественных киллерных клеток) и клеток фагоцитарной системы: микрофагов - нейтрофилов и эозинофилов, и макрофагов - моноцитов, а также иммунорегуляторный индекс (отношение Т-хелперы/Т-супрессоры). В клетках крови: в фагоцитах, Т-лимфоцитах и тромбоцитах - проводили окрашивание на гистохимический маркер NO-синтазы - НАДФН-диафоразу. Определяли также уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови.

В результате исследования установлено, что активная иммунизация крыс конъюгатом А-I до и после их принудительной алкоголизации оказывает подавляющее действие на проявления алкогольной зависимости. Животные демонстрируют длительные (в течение 4-5 месяцев) однонаправленные эффекты в произвольном потреблении этанола в условиях свободного выбора между водой и раствором этанола, проявлявшиеся в виде уменьшения потребления алкоголя и увеличения приема воды по сравнению с контролем (Рис.1). Суммарный объем потребляемой жидкости при этом достоверно не изменялся. Данное воздействие не вызывало и значимых изменений артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС).

У всех животных после активной иммунизации конъюгатом A-I с БСА регистрировали большие значения титров специфических антител к A-I, причем уровень антител у крыс с предварительно сформированной алкогольной мотивацией был выше, чем у животных, иммунизированных конъюгатом A-I до алкоголизации. Следует отметить, что у неиммунизированных крыс, подвергнутых хронической алкоголизации, в отличие от интактных, не алкоголизированных животных, также были выявлены антитела к A-I, но с относительно небольшими величинами титров (Табл.1).

Установлено, что иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА до их принудительной алкоголизации сопровождается сдвигами иммуноклеточного статуса, характерными для нормального хода развития иммунологических реакций на конъюгат белок-гаптен и предупреждает такие сдвиги иммуноклеточного статуса, как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, нейтрофилию и эозинофилию в ходе последующей длительной алкоголизации (Табл.2А).

Также установлено, что в ходе хронического потребления этанола наблюдаются вторичное иммунодефицитное состояние, охватывающее многие популяции иммунокомпетентных клеток. Последующая иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА уменьшает выраженность нарушений иммуноклеточного статуса, развившихся в ходе их длительной принудительной алкоголизации (Табл.2Б).

При иммунизации крыс конъюгатом A-I с БСА до алкоголизации выявлен также сдвиг баланса активности разных форм NO-синтазы в пользу iNOS фагоцитов, участвующей в элиминации апоптотических Т-лимфоцитов и в уменьшении риска развития аутоиммунных осложнений (Табл.3A). При иммунизации конъюгатом A-I после хронической принудительной алкоголизации отмечено уменьшение изменений иммуноклеточного статуса, таких как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, В-лимфоцитов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, выявляемых у контрольных крыс при длительном потреблении этанола. При этом показано смещение баланса NO-содержащих продуктов NOS-катализа в пользу оксида азота (Табл.3Б).

Результаты исследований указывают на избирательное вовлечение иммунных механизмов с участием пептидных компонентов ренин-ангиотензиновой системы (РАС) в процессы формирования и реализации алкогольной зависимости у животных.

На фоне иммунизации конъюгатом A-I с БСА не наблюдали достоверных изменений активности АЛТ, ACT и ГТГ. В ходе иммунизации отмечено умеренное возрастание активности каталазы по сравнению с фоновым периодом и с контролем. При этом содержание SH-групп достоверно снижается по сравнению с фоном и соответствующим контролем, что отражает некоторое истощение запасов антиокислительных факторов. Последующая (после иммунизации) алкоголизация в течение 3 месяцев не приводила к изменению активности органоспецифических ферментов и содержания триглицеридов, уменьшала активность каталазы, увеличивала содержания SH-групп, и несколько снижала содержание МДА, что свидетельствует об усилении процессов, как ПОЛ, так и антиоксидантной защиты. Указанное, по-видимому, обусловлено развивающейся при предварительной иммунизации A-I с БСА активацией компенсаторных биохимических процессов, и обеспечивает уменьшение повреждающего действия этанола в ходе последующей принудительной алкоголизации (Табл.4А).

Предварительная алкоголизация животных инициировала значимое повышение активности АЛТ и ГГТ, содержания триглицеридов, МДА, снижение содержания SH-групп и активности каталазы, что является характерным для алкогольной интоксикации и указывает на поражение тканей печени и сердца и нарушения липидного обмена на фоне активации ПОЛ и истощения антиоксидантной защиты. Последующая активная иммунизация конъюгатом A-I с БСА усиливала изменения ПОЛ (по уровню МДА), ослабляла изменения активности ферментов-маркеров повреждения тканей (АЛТ и ГТТ), препятствовала истощению факторов антиоксидантной защиты, главным за счет повышения активности каталазы (Табл.4Б).

Таблица 1.
Средние значения титров антител к ангиотензину-I у крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА до и после алкоголизации (M±SD)
Условия иммунизации	Период эксперимента	Опыт	Контроль
до воздействия	1:180±80	1:190±60
до алкоголизации (группа I)	после 2-й иммунизации	1:6400±3500***	1:250±80
после 4-й иммунизации	1:14550±5790***	1:290±80
после 1 мес. алкоголизации	1:8730±3230***	1:470±120*
после 3 мес. алкоголизации	1:4360±1610***	1:740±210**
после алкоголизации (группа II)	после 1 мес. алкоголизации	1:390±90	1:370±80
после 3 мес. алкоголизации	1:530±100*	1:670±150*
после 2-й иммунизации	1:14930±6870***	1:690±140*
после 4-й иммунизации	1:18670±7450***	1:760±200**
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 по сравнению с исходными значениями до воздействия.

Таблица 2А.
Иммуноцитологические показатели (M±SD) у крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)
Иммунологический показатель	Единица измерения	До воздействия	После 3 мес. алкоголизации
опыт	контроль	опыт	контроль
лейкоциты	тыс./мкл	15,76±1,09	14,67±1,35	13,12±0,77	13,01±1,23
лимфоциты суммарные	%	79,71±2,26	80,44±2,47	62,09±3,39*	64,75±2,96***
тыс./мкл	12,01±0,98	11,62±0,82	8,01±0,41*	8,44±0,93*/**
T-лимфоциты	%	81,00±2,65	81,22±2,35	83,73±2,09	85,17±1,75*
тыс./мкл	10,10±0,81	9,35±0,52	6,73±0,40*	7,22±0,85*
T-хелперы	%	41,0±3,44	42,83±3,53	39,10±3,67	35,75±3,77
тыс./мкл	6,60±0,86	5,46±0,93	3,17±0,85*	3,87±0,78*
Т-супрессоры	%	27,5±1,45	27,0±2,67	24,0±1,27	31,75±3,90∧
тыс./мкл	3,70±0,44	2,51±0,86	1,51±0,17*	2,70±0,77 л
Tx/Tc	усл. ед.	1,37±0,67	1,47±0,88	1,21±0,51	1,21±0,25
DN-клетки	%	16,07±0,54	18,33±0,57	8,55±1,27*	15,56±2,30∧
тыс./мкл	2,58±0,86	2,67±0,71	0,54±0,33*	1,31±0,89∧
В-лимфоциты	%	5,71±0,71	6,89±1,38	3,91±0,77	2,50±0,50*/**
тыс./мкл	0,71±0,10	0,83±0,20	0,31±0,06*	0,19±0,03**
NK-клетки	%	5,14±0,85	4,56±0,91	5,73±1,24	3,75±0,73
тыс./мкл	0,67±0,14	0,58±0,15	0,46±0,10	0,30±0,05
нейтрофилы	%	13,57±2,09	12,78±1,48	28,09±3,30	25,08±3,02**
тыс./мкл	2,12±0,35	1,99±0,45	3,81±0,6	3,28±0,45**
эозинофилы	%	0,43±0,20	1,0±0,33	3,73±0,93*	3,33±0,92**
тыс./мкл	0,07±0,03	0,15±0,05	0,52±0,15	0,42±0,11*/**
моноциты	%	6,29±1,53	5,78±1,35	6,09±1,03	6,83±0,97
тыс./мкл	0,99±0,27	0,89±0,23	0,79±0,13	0,87±0,12
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних);
∧ - р<0.05, ∧∧ - р<0.01, ∧∧∧ - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями).

Таблица 2Б.
Иммунопатологические показатели (M±SD) у крыс в процессе принудительной алкоголизации и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа)
Иммунологический показатель	Единица измерения	До воздействия	После 3 мес. алкоголизации	После 5-ой иммунизации
опыт	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль
лейкоциты	тыс./мкл	17,3±0,91	16,66±1,77	11,52±0,8**	11,16±1,02**	10,57±0,7	10,74±0,78
лимфоциты суммарные	%	75,86±1,29	75,29±3,50	70,83±2,72	67,09±4,58	57,92±3,24*	62,90±3,90
тыс./мкл	13,11±0,67	12,34±1,14	8,08±0,54**	7,19±0,66**	6,14±0,53**	6,70±0,60
Т-лимфоциты	%	76,43±3,22	83,14±2,77	84,58±1,87	82,91±2,15	82,58±1,67	82,30±1,80
тыс./мкл	10,05±0,76	10,18±0,80	6,86±0,52**	5,89±0,48***	5,06±0,42*/**	5,56±0,55
Т-хелперы	%	39,0±9,37	38,4±5,29	29,5±4,98	23,0±3,29	38,38±2,89*	39,0±9,45*
тыс./мкл	3,97±0,92	4,27±0,88	2,38±0,49*	2,40±0,58*	2,49±0,20	2,60±0,61
Т-супрессоры	%	23,25±3,12	23,50±3,18	20,3±2,88	29,0±4,94	29,45±2,50	20,6±3,95
тыс./мкл	3,21±0,25	2,88±0,35	1,34±0,37*	1,94±0,49	1,87±0,25	1,30±0,39
Тх/Тс	усл. ед.	1,19±0,29	1,81±0,38	1,40±0,75	1,0±0,23	1,43±0,17	1,91±0,85
DN-клетки	%	20,0±3,25	19,5±3,84	32,0±5,78*	27,0±0,23*	13,87±3,42*	24,0±2,8∧
тыс./мкл	3,00±0,97	3,56±0,92	3,01±0,92	2,72±0,94	0,96±0,29**	2,05±0,29∧
B-лимфоциты	%	6,86±1,29	4,57±0,75	2,50±0,41**	3,18±0,79	2,93±0,54	1,70±0,21∧
тыс./мкл	0,91±0,18	0,56±0,11	0,21±0,04**	0,25±0,07**	0,20±0,05	0,11±0,01
NK-клетки	%	5,57±1,32	5,43±1,79	6,0±1,42	4,91±1,25	5,83±0,91	6,20±0,69
тыс./мкл	0,73±0,18	0,71±0,26	0,46±0,10	0,38±0,11	0,35±0,06	0,40±0,04
нейтрофилы	%	13,29±1,50	15,86±3,54	19,67±1,97**	20,64±3,63	29,25±2,03**	25,9±3,22
тыс./мкл	2,28±0,24	2,88±0,76	2,31±0,29	2,47±0,72	3,06±0,26**	2,85±0,46
эозинофилы	%	1,14±0,70	0,29±0,18	2,25±0,69	2,82±0,48***	6,08±0,99**	3,0±0,44
тыс./мкл	0,21±0,13	0,14±0,03	0,26±0,07	0,3±0,04*	0,64±0,11**	0,31±0,06∧∧
моноциты	%	9,71±0,77	7,57±1,57	7,33±1,31	9,45±1,69	6,75±1,23	8,3±1,5
тыс./мкл	1,7±0,18	1,29±0,27	0,89±0,2**/***	1,16±0,29	0,73±0,14	0,88±0,16
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних);
∧ - р<0.05, ∧∧ - р<0.01, ∧∧∧ - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями).

Таблица 3A.
Система оксида азота (M±SD) у крыс после иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)
Показатель	Ед. измерения	Период эксперимента	Опыт	Контроль
активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазы	в фагоцитах	цитохимический индекс	до воздействия	0,05±0,01	0,09±0,03
после 3 месяцев алкоголизации	0,28±0,03###	0,22±0,02#
в Т-лимфоцитах	до воздействия	0,25±0,04	0,23±0,03
после 3 месяцев алкоголизации	0,50±0,06	0,54±0,04
в тромбоцитах	до воздействия	0,06±0,01	0,04±0,01
после 3 месяцев алкоголизации	0,12±0,02	0,14±0,03
уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме	мкМ/л	до воздействия	16,58±1,53	19,33±1,74
после 3 месяцев алкоголизаиии	25,25±2,55	33,06±4,02
# - р<0.05, # - р<0.01, ### - р<0.001 - значимость различий по сравнению с предыдущим периодом в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних).
Таблица 3Б.
Система оксида азота (M±SD) у крыс в процессе алкоголизции и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа)
Показатель	Ед. измерения	Период эксперимента	Опыт	Контроль
активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазы	в фагоцитах в Т-лимфоцитах в тромбоцитах	цитохимический индекс	до воздействия	0,09±0,03	0,04±0,01
5-кратная иммунизация после алкоголизации	0,14±0,02	0,13±0,02
до воздействия	0,30±0,04	0,24±0,03
5-кратная иммунизация после алкоголизации	0,44±0,04	0,38±0,03*
до воздействия	0,07±0,02	0,0±0,01
5-кратная иммунизация после алкоголизации	0,22±0,03	0,18±0,02*
уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме	мкМ/л	до воздействия	9,22±0,83	12,06±2,21
5-кратная иммунизация после алкоголизации	29,69±4,66	28,44±3,46
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 -значимость различий по сравнению с исходным уровнем показателя в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).

Таблица 4A.
Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)
Период эксперимента	Группы	SH-группы, мкмоль/л	МДА, мкмоль/л	Триглицериды, ммоль/л	Каталаза, м кат/л	АЛТ, ед./л	ACT, ед./л	γ-ГТ, ед./л
до воздействия	опыт	134,8±13,2	30,6±1,9	0,99±0,25	97,7±10,2	113,6±4,94	207,4±17,8	2,66±0,83
контроль	130,0±9,9	32,9±2,1	0,84±0,076	117,7±6,3	134,3±7,6	202,3±12,3	2,05±0,6
после 2-ой иммунизации	опыт	108,9±9,4	32,6±1,3	0,91±0,0079	118,4±4,2∧∧	139,1±6,18**	218,5±14,6	1,48±0,87
контроль	133,5±8,3	34,5±1,8	1,22±0,094**	96,8±5,5	136,8±5,75	222,8±7,9	1,49±0,49
после 5-ой иммунизации	опыт	101,0±8,6*/∧∧∧	34,0±2,5	1,20±0,11	94,5±5,5	109,8±5,87	189,7±5,77	2,94±0,76
контроль	132,6±8,0	35,4±1,9	1,45±0,13	94,6±8,8*	107,8±7,9	181,2±8,7	1,86±0,4
после 1 месяца алкоголизации	опыт	141,3±9,7	25,7±1,1*	1,18±0,17	109,0±5,3	97,4±6,03	161,0±10,3*	4,48±1,58
контроль	169,4±13,9*	27,6±1,1*	1,51±0,2*	86,7±10,2*	100,0±5,0**	153,2±6,96**	2,6±0,56
после 3 месяцев алкоголизации	опыт	187,1±10,4**/∧	27,2±0,9	1,0±0,15	78,5±5,1	118,6±4,68	149,5±7,27**	3,0±1,06
контроль	155,6±10,6	28,0±1,1*	0,93±0,17	78,7±10,4*	115,7±5,08	169,0±8,14**	5,38±1,93
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).
∧ - р<0.05, ∧∧ - р<0.01, ∧∧∧ - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями).

Таблица 4Б
Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА после алкоголизации (II группа)
Период эксперимента	Группы	SH-группы, мкмоль/л	МДА, мкмоль/л	Триглицериды, ммоль/л	Каталаза, м кат/л	АЛТ, ед./л	ACT, ед./л	γ-ГТ, ед./л
до воздействия	опыт	171,5±2,0	15,0±0,7	1,25±0,09	98,4±7,9	135,6±4,6	191,7±10,3	2,23±0,8
контроль	160,1±14,5	16,0±0,7	0,99±0,12	100,3±4,9	122,9±5,52	204,3±11,6	1,56±0,48
после 1 месяца алкоголизации	опыт	129,3±1,1*/∧∧	33,9±1,7***	1,31±0,22	89,9±5,3	119,4±3,4**	174,7±13,3	6,9±1,22**
контроль	159,7±8,5	34,6±1,7***	1,41±0,21	97,3±7,7	130,5±6,14	194,9±5,3	3,41±0,75
после 3 месяцев алкоголизации	опыт	141,3±9,3	28,6±1,4***	1,88±0,23	114,0±3,5∧∧∧	105±6,4***	166,4±8,58	4,90±1,3
контроль	157,9±11,8	25,0±1,5***	1,37±0,22	66,1±7,3***	106,1±5,35*	175,4±9,4	1,74±0,5
после 2-ой иммунизации	опыт	89,4±5,7***/∧	28,2±1,1***	1,30±0,14	85,5±8,1	115,9±7,5	184,8±15,6	4,81±1,4
контроль	114,1±5,9**	31,3±1,3***	1,43±0,22	67,4±8,1***	119,1±10,0	173,2±7,85	1,8+0,57
после 5-ой иммунизации	опыт	138,5±10,4*/∧	36,7±1,4***	1,27±0,12	72,8±4,4*/∧	95,7±6,4***	166,9±13,3	7,0+1,6
контроль	175,5±9,4	36,4±1,4***	1,18±0,19	89,0±2,3*	89,1±6,78***	184,3±15,1	12,5±4,2
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).
∧ - р<0.05, ∧∧ - р<0.01, ∧∧∧ - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями).

Способ предупреждения развития и/или подавления алкогольной мотивации, заключающийся в иммунизации особи путем введения ей конъюгата ангиотензина I с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в дозе 300 мкг/кг.