Фармацевтическая композиция для лечения и предупреждения рака

Фармацевтическая композиция для лечения и предупреждения рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому фармацевтическому применению анти-CD179b антитела или его фрагмента в качестве средства для лечения и/или профилактики рака.

Предшествующий уровень техники

Из всех смертельных заболеваний самой главной причиной, приводящей к летальному исходу, является рак, и в настоящее время способы лечения рака включают, главным образом, хирургическую операцию в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Хотя за последние годы были разработаны новые хирургические методы лечения рака и появились новые противораковые средства, однако в настоящее время какого-либо заметного улучшения результатов лечения рака, за исключением некоторых его видов, пока не наблюдается. В последнее время благодаря развитию молекулярной биологии и иммунологии рака были идентифицированы раковые антигены, распознаваемые антителами, и цитотоксические Т-клетки, которые специфически реагируют с раковыми клетками, а также были идентифицированы гены, кодирующие раковые антигены, а поэтому появилась надежда разработать такие терапевтические методы, которые обеспечивали бы специфическое нацеливание лекарственных средств на раковые антигены (не-патентный документ 1).

При разработке терапевтических методов лечения рака, для снижения побочных эффектов было бы желательно, чтобы пептид, полипептид или белок, распознаваемые как антигены, почти не присутствовали в нормальных клетках, а, в частности, желательно, чтобы они присутствовали только в раковых клетках. В 1991 году, в Бельгии в Институте Людвига, Boon и др. выделили антиген меланомы MAGE1 человека, распознаваемый CD8-позитивными Т-клетками, методом клонирования по уровню продуктов экспрессии кДНК, осуществляемого с использованием аутологичной раковой клеточной линии и Т-клеток, реагирующих с раковыми клетками (не-патентный документ 2). Позже в литературе был описан метод SEREX (серологической идентификации антигенов путем клонирования посредством рекомбинантной экспрессии), в котором опухолевые антигены, распознаваемые антителами, продуцируемыми в живом организме пациента с раком в ответ на опухолевые антигены самого пациента, были идентифицированы методом клонирования посредством экспрессии генов (не-патентный документ 3; патентный документ 1), и с применением этого метода было выделено несколько раковых антигенов, которые почти не экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в раковых клетках (не-патентные документы 4-9). Кроме того, с использованием части этих антигенов в качестве мишеней были проведены клинические тесты по клеточной терапии с применением иммуноцитов, специфически реагирующих с этими раковыми антигенами, а также тесты по специфической противораковой иммунотерапии, такой как терапия с использованием вакцин, содержащих раковые антигены.

С другой стороны, в последние годы во всем мире появилось большое количество различных антител, используемых в качестве лекарственных средств для лечения рака, где указанные лекарственные средства нацелены на антигенные белки, присутствующие на раковых клетках. Поскольку с использованием таких лекарственных антител в качестве средств для противораковой терапии может быть достигнут определенный фармакологический эффект, то эти антитела заслуживают особого внимания, однако большинство антигенных белков, являющихся мишенями, также экспрессируются и в нормальных клетках, а поэтому в результате введения такого антитела повреждаются не только раковые клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие такие антигены, что приводит к возникновению побочных эффектов, создающих серьезные проблемы. Таким образом, предполагается, что идентификация раковых антигенов, специфически экспрессирующихся на поверхности раковых клеток, и применение антител, нацеленных на эти антигены, в качестве лекарственных средств, позволит осуществлять лечение указанными лекарственными антителами с минимальными побочными эффектами.

Известно, что CD179b представляет собой часть суррогатной легкой цепи иммуноглобулина и экспрессируется на поверхностях мембран клеток, которые являются предшественниками В-клеток (пре-В-клеток и про-В-клеток). После дифференцировки В-клеток CD179b исчезает и не экспрессируется в зрелых В-клетках. Однако известно, что CD179b экспрессируется в клетках лейкоза (пре-В-клеточного лейкоза), продуцируемых при малигнизации пре-В-клеток (не-патентные документы 10 и 11). Кроме того, известно, что CD179b также экспрессируется в клетках лимфомы (пре-В-клеточной лимфомы), продуцируемых при малигнизации пре-В-клеток, и может быть использован в качестве диагностического маркера пре-В-клеточной лимфомы (не-патентный документ 12). Однако в литературе отсутствуют какие-либо сообщения о специфической экспрессии этого антигена в клетках лейкоза, не являющихся клетками пре-В-клеточного лейкоза, в клетках лимфомы, не являющихся клетками пре-В-клеточной лимфомы, в клетках рака молочной железы и т.п. Кроме того, отсутствуют какие-либо предположения о возможности применения анти-CD179b антител для лечения и/или профилактики рака.

Документы-прототипы

Патентные документы

Патентный документ 1: US 5698396 B

Не-патентные документы

Не-патентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, «Cancer and Chemotherapy», 1997, Vol. 24, pp.551-519

Не-патентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991)

Не-патентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995)

Не-патентный документ 4: Int.J.Cancer, 72:965-971 (1997)

Не-патентный документ 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998)

Не-патентный документ 6: Int.J. Cancer, 29:652-658 (1998)

Не-патентный документ 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999)

Не-патентный документ 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996)

Не-патентный документ 9: Hum. Mol. Genet. 6:33-39 (1997)

Не-патентный документ 10: Adv. Immunol., 63:1-41 (1996)

Не-патентный документ 11: Blood, 92:4317-4324 (1998)

Не-патентный документ 12: Modern Pathology, 17:423-429 (2004).

Описание сущности изобретения

Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения

Настоящее изобретение позволяет идентифицировать белки раковых антигенов, специфически экспрессирующиеся на поверхностях раковых клеток, и относится к применению антител, нацеленных на эти белки, в качестве средств для лечения и/или профилактики рака.

Средства для решения указанных проблем

Авторами настоящего изобретения были проведены интенсивные исследования методом SEREX с использованием сыворотки, взятой у собак-пациентов, от которых была создана библиотека кДНК тканей собачьего рака молочной железы, и в результате этих исследований была получена кДНК, кодирующая белок, который связывается с антителами, присутствующими в сыворотке организма животного с раковой опухолью, и на основе гена человека, гомологичного полученному гену, был продуцирован CD179b человека, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что CD179b почти не экспрессируется в нормальных тканях, но специфически экспрессируется в клетках рака молочной железы, лейкоза и лимфомы. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антитела против такого CD179b способны уничтожать раковые клетки, экспрессирующие CD179b, и этот факт был положен в основу настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение имеет нижеследующие отличительные признаки.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, используемой для лечения и/или профилактики рака и содержащей в качестве эффективного компонента антитело или его фрагмент, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, или аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60% идентична указанной аминокислотной последовательности или ее фрагменту, содержащему не менее чем 7 смежных аминокислот.

В этом варианте вышеупомянутым раковым заболеванием является раковая опухоль, экспрессирующая ген CD179b.

В другом варианте вышеупомянутым раковым заболеванием является рак молочной железы, лейкоз или лимфома.

В другом варианте указанным антителом является моноклональное антитело или поликлональное антитело.

В другом варианте указанным антителом является антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

В другом варианте указанным антителом является антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b.

В другом варианте указанным антителом является антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b.

Настоящее изобретение также относится к таким антителам, как:

(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:103, 104 и 102, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:106, 107 и 108, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b,

(ii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, где указанное антитело обладает иммунореактивностью по отношению к белку CD179b,

(iii) антитела вышеуказанных пунктов (i) и (ii), обладающие цитотоксической активностью,

(iv) антитела вышеуказанных пунктов (i) и (ii), каждое из которых представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифическое антитело.

Настоящее изобретение также относится к нижеследующим полипептидам или ДНК, таким как:

(v) ДНК, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:105, или полипептид, кодируемый указанной ДНК,

(vi) ДНК, кодирующая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, или полипептид, кодируемый указанной ДНК,

(vii) ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:110,

(viii) ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:111,

(ix) полипептид гипервариабельной области (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 103, 104 и 102, или ДНК, кодирующая указанный полипептид,

(х) полипептид гипервариабельной области (CDR) легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 106, 107 и 108, или ДНК, кодирующая указанный полипептид.

Эффект настоящего изобретения

Анти-CD179b антитело, которое используется в настоящем изобретении, разрушает раковые клетки. Поэтому анти-CD179b антитело может быть использовано для лечения и/или профилактики рака.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая профили экспрессии гена, кодирующего белок CD179b в нормальных тканях и в опухолевых клеточных линиях. На панели, обозначенной арабской цифрой 1, представлен профиль экспрессии гена, кодирующего белок CD179b, а на панели, обозначенной арабской цифрой 2, представлен характер экспрессии гена GAPDH.

На фигуре 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая противоопухолевое действие антитела против CD179b (моноклонального анти-CD179b антитела #8) у «голых» мышей, которым была трансплантирована раковая клеточная линия Namalwa человека, экспрессирующая CD179b. Арабской цифрой 3 представлен размер опухоли у мышей, которым было введено моноклональное анти-CD179b антитело #8, а арабской цифрой 4 представлен размер опухоли у мышей, которым был введен PBS(-).

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:3 в Списке последовательностей, приведенном в настоящем изобретении, является аминокислотная последовательность CD179b, выделенная методом SEREX с использованием сыворотки, которая была взята у собак-пациентов и на основе которой была создана библиотека кДНК тканей собачьего рака молочной железы, где указанная кДНК была использована в качестве гомолога гена человека (гомологичного фактора) полипептида, специфически связывающегося с антителами, присутствующими в сыворотке, взятой у собак с раковой опухолью (см. пример 1). Антителом против CD179b, используемым в настоящем изобретении, может быть антитело любого типа, при условии, что оно обладает противоопухолевой активностью, и примерами таких антител являются моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела (scFv) и фрагменты антител, такие как Fab и F(ab')₂. Эти антитела и их фрагменты могут быть получены методами, известными специалистам. В настоящем изобретении антитело предпочтительно специфически связывается с белком CD179b, а в тех случаях, когда индивидуумом является человек, то указанным антителом предпочтительно является антитело человека или гуманизированное антитело, используемое в целях предотвращения или ингибирования реакции отторжения.

Используемый здесь термин «специфически связывается с белком CD179b» означает, что антитело специфически связывается с белком CD179b и, по существу, не связывается с другими белками.

В настоящем изобретении используемое антитело против CD179b может быть коммерчески доступным. Примерами известных антител против CD179b человека являются клоны, такие как GA170, H-60, HP6054, A-19, C-16, SLC1, SLC2, SLC3, SLC4 и HSL11, которые представляют собой коммерчески доступные клоны.

Противоопухолевая активность антитела, которое может быть использовано в настоящем изобретении, может быть проанализирована in vitro путем проведения исследования на цитотоксичность этого антитела по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим данный полипептид, с использованием иммуноцитов или комплемента, как описано ниже.

Кроме того, объектом настоящего изобретения, направленного на проведение лечения и/или профилактики рака, является млекопитающее, такое как человек, животное-компаньон, домашнее животное или животное, участвующее в спортивных состязаниях, а предпочтительным объектом является человек.

Используемые в настоящем описании термины «рак» и «опухоль» означают злокачественное новообразование и являются синонимами.

Получение антигенов, препаратов антител и фармацевтических композиций, рассматриваемых в настоящем изобретении, описано ниже.

Получение антигенов для получения препаратов антител

Виды организмов, белки или фрагменты которых используются в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела против CD179b, применяемого в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, животные, такие как человек, собака, корова, мышь и крыса. Однако вид животного предпочтительно выбирают исходя из соображений совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток, обычно, с белком, происходящим от млекопитающего, а особенно предпочтительно человека. Так, например, в случаях, когда CD179b представляет собой CD179b человека, белок CD179b человека или его пептидный фрагмент, могут быть использованы клетки, экспрессирующие CD179b человека или т.п.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CD179b человека и его гомологов могут быть получены, например, в банке GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма, такого как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (87:2264-2268), 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997). CD179b также обозначается как λ5, IGLL1, Vpreb2, LOC608248 или т.п., однако в описании настоящего изобретения репрезентативным является обозначение «CD179b». Так, например, CD179b человека зарегистрирован под номерами NM_152855 и NM_020070, Vpreb2 мыши зарегистрирован под номером NM_016983, а LOC608248 собаки зарегистрирован под номером XM_845215.

В настоящем изобретении в случаях, если в качестве стандарта используется нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность CD179b человека, то нуклеиновой кислотой или белком является мишень, последовательность которой на 50%-100%, предпочтительно на 60%-100%, более предпочтительно на 80%-100%, еще более предпочтительно на 90%-100%, а наиболее предпочтительно на 95%-100%, например на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентична последовательности SEQ ID NO:1 или 3. В описании настоящего изобретения термин «% идентичности последовательностей» означает процент (%) идентичных аминокислот (или оснований) от общего числа аминокислот (или оснований) при выравнивании двух последовательностей друг с другом так, чтобы между ними достигалось максимальное сходство с введением или без введения пробела(ов).

Длина фрагмента белка CD179b не должна быть меньше длины аминокислотной последовательности эпитопа (антигенной детерминанты), которая является самым коротким элементом, распознаваемым антителом, и его длина должна быть меньше общей длины белка. Длина эпитопа обычно составляет от 7 до 12 смежных аминокислот.

Вышеописанный белок CD179b человека и полипептиды, содержащие его пептидные фрагменты, могут быть синтезированы методом химического синтеза, таким как Fmoc-метод (метод с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-метод (метод с использованием трет-бутилоксикарбонила). Кроме того, они могут быть синтезированы стандартными методами, проводимыми с помощью коммерчески доступных пептидных синтезаторов различных типов. Кроме того, представляющий интерес полипептид может быть сконструирован известными методами генной инженерии, путем получения полинуклеотида, кодирующего вышеуказанный полипептид, и включения указанного полинуклеотида в вектор экспрессии, который затем встраивают в клетку-хозяина с последующим продуцированием полипептида в указанной клетке-хозяине.

Полинуклеотид, кодирующий вышеуказанный полипептид, может быть легко получен известным методом генной инженерии или стандартным методом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Так, например, ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, может быть получена с помощью ПЦР, проводимой с использованием библиотеки хромосомных ДНК человека или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы, и пары праймеров, сконструированных так, чтобы затем с помощью этих праймеров можно было амплифицировать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. ПЦР может быть проведена в соответствующих реакционных условиях, и примерами таких условий являются, но не ограничиваются ими, проведение 30 циклов реакции при 94°С в течение 30 секунд (денатурация), при 55°С в течение 30 секунд-1 минуты (отжиг) и при 72°С в течение 2 минут (удлинение), и последующее проведение реакции при 72°С в течение 7 минут. Затем нужная ДНК может быть выделена путем создания соответствующего(их) зонда(ов) или праймера(ов) исходя из данных о нуклеотидной и аминокислотной последовательностях SEQ ID NO:1 и 3, представленных соответственно в Списке последовательностей, прилагаемом к настоящему описанию, и с использованием зонда(ов) или праймера(ов) для скрининга библиотеки кДНК человека или т.п.

Библиотеку кДНК предпочтительно получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок SEQ ID NO:3. Примерами таких клеток и тканей являются костный мозг, клетки лейкоза, раковые клетки молочной железы и клетки лимфомы. Вышеописанные операции, такие как получение зонда(ов) или праймера(ов), конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам и могут быть осуществлены методами, описанными, например, в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning: Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989). Из полученной таким образом ДНК может быть создана ДНК, кодирующая белок CD179b человека или его пептидный фрагмент.

Описанными выше клетками-хозяевами могут быть любые клетки, при условии, что они будут экспрессировать вышеуказанный полипептид, и примерами прокариотических клеток являются, но не ограничиваются ими, клетки E.coli, а примерами эукариотических клеток являются, но не ограничиваются ими, культивированные клетки млекопитающих, такие как клетки почек обезьяны COS1, клетки яичника китайского хомячка СНО, клеточная линия почек плода человека НЕК293 и клеточная линия кожи мышиного эмбриона NIH3T3; дрожжевые клетки, такие как клетки дрожжей, размножающихся почкованием, и дрожжей, размножающимся делением; клетки тутового шелкопряда и клетки лягушачьих яиц Xenopus.

В случае использования прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев вектор экспрессии, применяемый в прокариотических клетках, имеет ориджин репликации, промотор, сайт связывания с рибосомой, сайт множественного клонирования, терминатор, ген резистентности к лекарственному средству, неаллельный комплементарный ген и/или т.п. Примерами вектора экспрессии для E.coli являются система pUC, pBluescriptII, экспрессионная система рЕТ и экспрессионная система pGEX. Благодаря введению ДНК, кодирующей вышеуказанный полипептид, в такой вектор экспрессии и трансформации этим вектором прокариотических клеток-хозяев с последующим культивированием полученных трансформантов может быть осуществлена экспрессия полипептида, кодируемого указанной ДНК, в прокариотических клетках-хозяевах. В этом способе указанный полипептид может быть также экспрессирован в виде гибрида с другим белком (например, с белком, флуоресцирующим в зеленом диапазоне спектра (GFP) или с глутатион-S-трансферазой (GST)).

Если используются эукариотические клетки-хозяева, то в качестве вектора экспрессии применяется вектор экспрессии для эукариотических клеток, имеющий промотор, сайт сплайсинга, сайт присоединения pole(A) и/или т.п. Примерами таких векторов экспрессии являются pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3, pMSG и pYES2. Полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах способом, аналогичным способу, описанному выше, путем включения ДНК, кодирующей вышеописанный полипептид, в указанный вектор экспрессии, и трансформации этим вектором эукариотических клеток-хозяев с последующим культивированием полученных трансформантов. Если в качестве вектора экспрессии используются pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или т.п., то вышеописанный полипептид может экспрессироваться в виде слитого белка, к которому присоединена метка, такая как His-метка (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-метка, myc-метка, НА-метка или GFP.

Для введения вектора экспрессии в клетки-хозяева могут быть применены хорошо известные методы, такие как электропорация, метод с использованием фосфата кальция, метод с использованием липосом, метод с использованием DEAE-декстрана и микроинжекция.

Выделение и очистка представляющего интерес полипептида из клеток-хозяев могут быть осуществлены путем проведения комбинаций хорошо известных методов разделения. Примерами таких известных методов разделения являются, но не ограничиваются ими, обработка денатурирующим агентом, таким как мочевина, или поверхностно-активным веществом; ультразвуковая обработка; ферментативный гидролиз; высаливание или фракционированное осаждение растворителем; диализ; центрифугирование; ультрафильтрация; гель-фильтрация; электрофорез в ДСН-ПААГ; изоэлектрическое фокусирование; ионообменная хроматография; гидрофобная хроматография; аффинная хроматография; и обращенно-фазовая хроматография.

Структура антител

Антитело обычно представляет собой гетерополимерный гликопротеин, имеющий по меньшей мере две тяжелых цепи и две легких цепи. Антитело, за исключением IgM, представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин размером примерно 150 кДа, состоящий из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Обычно, каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, однако у иммуноглобулинов различных изотипов число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьируется. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеют внутрицепьевые дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь на одном своем конце имеет вариабельный домен (VH-область), а за ним расположено несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL-область) и одну константную область с противоположного конца. Константная область каждой легкой цепи расположена на одной линии с первой константной областью тяжелой цепи, а каждый вариабельный домен легкой цепи расположен на одной линии с вариабельным доменом тяжелой цепи. Каждый вариабельный домен антитела имеет конкретные области, характеризующиеся особой вариабельностью и называемые комплементарность-определяющими (гипервариабельными) областями (CDR), и именно, эти области сообщают антителу специфичность связывания. Части в каждой вариабельной области, которые являются относительно консервативными, называются каркасными областями (FR). Каждый полный вариабельный домен тяжелой и легкой цепи имеет четыре FR, связанные тремя CDR. В каждой тяжелой цепи три CDR обозначаются CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и расположены по порядку от N-конца, а в каждой легкой цепи они обозначаются CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно. Для специфичности связывания антитела с антигеном самое важное значение имеет CDRH3. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вместе посредством FR-областей таким образом, что CDR вместе с CDR другой цепи располагаются близко друг к другу, в результате чего эти CDR образуют антигенсвязывающий сайт. Хотя константная область не играет непосредственной роли в связывании антитела с антигеном, однако она обладает различными эффекторными функциями, такими как участие в антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC), и в фагоцитозе посредством связывания с рецептором Fcγ, и влияет на время полужизни/скорость клиренса под действием неонатального Fc-рецептора (FcRn), а также на комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) под действием компонента C1q каскада пути активации комплемента.

Получение антитела

Термин «анти-CD179b антитело согласно изобретению» означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полноразмерным белком CD179b или его фрагментом. Используемый здесь термин «иммунологическая реактивность» означает свойство, благодаря которому антитело и антиген CD179b связываются друг с другом, и такое связывание запускает функцию разрушения (то есть гибели, ингибирования или регрессии) опухолей. В настоящем изобретении может быть использовано антитело любого типа, при условии, что оно будет связываться с белком CD179b и будет приводить к разрушению опухолей, таких как клетки лейкоза и лимфомы.

Примерами такого антитела являются моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, например Fab и F(ab')₂. Кроме того, указанное антитело принадлежит к условному классу иммуноглобулиновых молекул, таких как IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или к условному подклассу иммуноглобулиновых молекул, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Указанное антитело может быть также модифицировано путем гликозилирования, ацетилирования, формилирования, амидирования, фосфорилирования, ПЭГилирования (ПЭГ) и/или т.п.

Примеры получения различных антител описаны ниже.

В том случае, если необходимо получить моноклональное антитело, то клеточную линию лейкоза, например Namalwa, экспрессирующую CD179b, вводят мышам для их иммунизации, а затем у этих мышей извлекают селезенку. После этого клетки разделяют и подвергают слиянию с мышиными миеломными клетками, а затем, из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клон, продуцирующий антитело, обладающее действием, направленным на ингибирование роста раковых клеток. Антитело может быть получено путем выделения гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, обладающее действием, направленным на ингибирование роста раковых клеток, с последующим культивированием указанной гибридомы и очисткой антитела из супернатанта культуры хорошо известным методом аффинной очистки.

Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть также получена, например, способом, описанным ниже.

Сначала в соответствии с известным методом животное иммунизируют сенсибилизирующим антигеном. В основном указанный метод осуществляют путем внутрибрюшинной или подкожной инъекции сенсибилизирующего антигена млекопитающему. Более конкретно, сенсибилизирующий антиген разводят PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором) или физиологическим раствором до соответствующего объема, а затем полученную суспензию смешивают, если это необходимо, с соответствующим количеством обычного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда. После этого осуществляют эмульгирование и полученную эмульсию несколько раз вводят млекопитающему через каждые 4-21 день. Кроме того, при иммунизации сенсибилизирующим антигеном может быть также использован подходящий носитель.

После проведения такой иммунизации млекопитающего и подтверждения увеличения уровня нужного антитела в сыворотке у млекопитающего осуществляют забор иммуноцитов и эти иммуноциты подвергают слиянию. Предпочтительными примерами иммуноцитов являются, в частности, клетки селезенки.

В качестве других родительских клеток, подвергаемых слиянию с иммуноцитами, используются миеломные клетки млекопитающих. Примерами предпочтительно используемых миеломных клеток являются различные известные клеточные линии, такие как P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7), NS-1 (Kohler G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415), SP2/0 (Shulman M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980)35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние иммуноцитов и миеломных клеток может быть осуществлено известным методом, например методом, описанным Kohler & Milstein (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток осуществляют, например, в присутствии агента, стимулирующего слияние клеток, в обычной питательной среде. Примерами агентов, стимулирующих слияние клеток, являются полиэтиленгликоль (ПЭГ) и вирус Сендай (HVJ), а для повышения эффективности такого слияния, если это необходимо, может быть также добавлено вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между используемыми иммуноцитами и миеломными клетками может быть установлено произвольно. Так, например, иммуноциты предпочтительно использовать в 1-10 раз большем количестве, чем миеломные клетки. Примерами сред, которые могут быть использованы для слияния клеток, являются среда RPMI1640, которая может оказаться предпочтительной для роста миеломной клеточной линии; среда МЕМ и другие среды, обычно используемые для культивирования клеток такого типа. Кроме того, вместе с этим может быть проведена замена сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (FCS).

В процессе слияния клеток предварительно определенное количество иммуноцитов и миеломных клеток тщательно смешивают в среде, и добавляют предварительно нагретый, примерно до 37°С, раствор ПЭГ (например, со средней молекулярной массой примерно от 1000 до 6000) обычно до концентрации 30-60% (масс./об.), а затем полученную смесь перемешивают для получения представляющей интерес гибридомы. Затем, после проведения повторной операции последовательного добавления соответствующей среды и удаления супернатанта путем центрифугирования, агенты для слияния клеток и т.п., которые не являются предпочтительными для роста гибридом, удаляют.

Полученные таким образом гибридомы отбирают путем культивирования в нормальной селективной среде, такой как среда НАТ (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культуру в вышеуказанной среде НАТ сохраняют в течение периода времени (обычно в течение периода времени от нескольких дней до нескольких недель), достаточного для гибели клеток, не являющихся представляющими интерес гибридомами (неслитых клеток). Затем проводят скрининг и клонирование одной гибридомы, продуцирующей представляющее интерес антитело, обычным методом лимитирующего разведения.

Помимо метода, в котором вышеуказанную гибридому получают путем иммунизации указанным антителом животного, не являющегося человеком, может быть также применен метод, в котором лимфоциты человека, такие как лимфоциты человека, инфицированные вирусом ЭБ, сенсибилизируют in vitro белком, белок-экспрессирующими клетками или их лизатом, а затем сенсибилизированные лимфоциты подвергают слиянию с миеломными клетками человека, обладающими способностью непрерывно делиться, например U266 (регистрационный номер TIB196), с получением гибридомы, продуцирующей антитело человека, обладающее нужной активностью (например, активностью ингибирования роста клеток).

Полученная таким образом гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть субкультивирована в обычной среде и может храниться в жидком азоте в течение длительного периода времени.

То есть, гибридома может быть получена способом, в котором нужный антиген или клетки, экспрессирующие нужный антиген, используют в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации стандартным методом иммунизации, с получением иммуноцитов, которые затем подвергают слиянию с известными родительскими клетками стандартным методом деления клеток, с последующим проведением скрининга клеток, продуцирующих моноклональное антитело (гибридом), в соответствии со стандартным методом скрининга.

Другим примером антитела, которое может быть использовано в настоящем изобретении, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело может быть получено, например, методом, описанным ниже.

Природный белок CD179b или рекомбинантный белок CD179b, экспрессируемый как слитый белок с GST в микроорганизме, таком как E.coli, или их пептидный фрагмент используют для иммунизации мелких животных, таких как мыши, а также мыши или кролики, продуцирующие антитело человека, и у этих мелких животных берут сыворотку. Поликлональное антитело получают посредством очистки сыворотки, например путем преципитации сульфатом аммония, на колонках с белком А и G-белком с помощью ионообменной хроматографии с использованием DEAE или на аффинной колонке, связанной с белком CD179b или с синтетическим пептидом.

В настоящем описании известными примерами мышей, продуцирующих антитело человека, являются мыши КМ (Kirin Pharma/Medarex) и XenoMouse (Amgen). Если такая мышь является иммунизованной белком CD179b или его фрагментом, то полноразмерное поликлональное антитело человека может быть выделено из крови. Кроме того, моноклональное антитело человека может быть получено путем выделения клеток селезенки у иммунизованных мышей и последующего их слияния с миеломными клетками.

Антиген может быть получен методом с использованием клеток животных (переведенная выложенная заявка РСТ на патент Японии № 2007-530068), методом с использованием бакуловируса (например, W098/46777) или т.п. В случае низкой иммуногенности антигена иммунизация может быть осуществлена после процедуры связывания антигена с макромолекулой, обладающей иммуногенностью, такой как альбумин.

Кроме того, может быть также использовано антитело, кодируемое рекомбинантным геном, где указанное антитело было получено путем клонирования гена антитела, выделенного из гибридомы, и его включения в соответствующий вектор, который затем вводят хозяину для последующего продуцирования у данного хозяина антитела в соответствии с методами рекомбинантных ДНК (см., например, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Более конкретно, кДНК вариабельной области (V-области) антитела синтезируют из мРНК гибридомы с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела, эту ДНК присоединяют к ДНК, кодирующей константную о