Гликополисиалирование белков, не являющихся белками свертывания крови

Гликополисиалирование белков, не являющихся белками свертывания крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к материалам и способам для конъюгации растворимых в воде полимеров, в частности, полисиаловой кислоты, с содержащими углеводы соединениями, в частности гликопротеинами, отличными от белков свертывания крови, и к полученным конъюгатам.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конъюгация полипептидных лекарственных средств, например, путем пегилирования или полисиалирования, защищает их от деградации в кровотоке и, таким образом, улучшает их фармакодинамические и фармакокинетические профили (Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21; S. Jain, D. Hreczuk-Hirst, P. Laing and G. Gregoriadis, Drug Delivery Systems and Sciences, 4 (No 1): 3-9, 2004.). Процесс пегилирования присоединяет повторяющиеся звенья этиленгликоля (полиэтиленгликоль (PEG)) к полипептидному лекарственному средству. Молекулы PEG имеют большой гидродинамический объем (в 5-10 раз превышающий размер глобулярных белков), являются высокорастворимыми в воде и гидратированными, нетоксичными, неиммуногенными и быстро выводятся из организма. Пегилирование молекул может приводить к увеличенной устойчивости лекарственных средств к ферментативной деградации, увеличению времени полужизни in vivo, снижению частоты дозирования, снижению иммуногенности, увеличению физической и термической стабильности, увеличению растворимости, увеличению стабильности в жидкости и снижению агрегации. Первые пегилированные лекарственные средства были одобрены FDA в ранние 1990. С тех пор FDA одобрило несколько пегилированных лекарственных средств для перорального, инъекционного и местного введения.

Сиаловые кислоты (также называемые N-ацетилнейраминовыми кислотами) и полисиаловые кислоты широко распространены в тканях животных и в меньшей степени в других видах в диапазоне от растений и грибов до дрожжей и бактерий, главным образом, в гликопротеинах и ганглиозидах.

Сокращение "PSA", используемое в настоящем документе, относится к термину "полисиаловая кислота". Аналогично, термин "mPSA", используемый в настоящем документе, относится к термину "модифицированная полисиаловая кислота".

PSA состоят из полимеров (главным образом, гомополимеров) N-ацетилнейраминовой кислоты. Вторичная аминогруппа обычно несет ацетильную группу, но вместо этого она может нести гликолильную группу. Возможные заместители на гидроксильных группах включают ацетильную, лактильную, этильную, сульфатную и фосфатную группы.

N-ацетилнейраминовая кислота

Neu5Ac

Структура сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота)

PSA и mPSA, главным образом, включают линейные полимеры, состоящие в основном из частей N-ацетилнейраминовой кислоты, связанных 2,8- или 2,9-гликозидными связями или их комбинациями (например, чередование 2,8- и 2,9-связей). В особенно предпочтительных PSA и mPSA гликозидные связи представляют собой α-2,8. Является пригодным, когда такие PSA и mPSA происходят из коломиновых кислот, и их обозначают в настоящем документе как "CA" и "mCA". Типичные PSA и mPSA содержат по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20 частей N-ацетилнейраминовой кислоты. Таким образом, они могут содержать от 5 до 500 частей N-ацетилнейраминовой кислоты, предпочтительно от 10 до 300 частей N-ацетилнейраминовой кислоты. PSA и CA могут представлять собой полимеры, содержащие различные группы сахаров. Они могут представлять собой сополимеры. Предпочтительно PSA и CA свободны от частей сахаров, отличных от N-ацетилнейраминовой кислоты. PSA и CA предпочтительно содержат по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% частей N-ацетилнейраминовой кислоты.

Когда PSA и CA содержат части, отличные от N-ацетилнейраминовой кислоты (как, например, в mPSA и mCA), они предпочтительно расположены на одном или обоих концах полимерной цепи. Такие "другие" группы могут, например, представлять собой группы, образованные из концевых групп N-ацетилнейраминовой кислоты путем окисления или восстановления.

Например, в WO-A-0187922 описаны такие mPSA и mCA, в которых невосстанавливающее концевое звено N-ацетилнейраминовой кислоты превращено в альдегидную группу путем реакции с перйодатом натрия. Кроме того, в WO 2005/016974 описаны такие mPSA и mCA, в которых восстанавливающее концевое звено N-ацетилнейраминовой кислоты подвергнуто восстановлению для восстановительного размыкания кольца на восстанавливающем концевом звене N-ацетилнейраминовой кислоты, посредством чего образуются соседняя диольная группа, с последующим окислением для превращения соседней диольной группы в альдегидную группу.

Гликопротеины, обогащенные сиаловыми кислотами, связывают селектин у человека и других организмов. Они играют важную роль в инфекциях вирусом гриппа человека. Например, сиаловая кислота может скрывать антигены маннозы на поверхности клеток-хозяев или бактерий от связывающего маннозу лектина. Это предотвращает активацию комплемента. Сиаловые кислоты также скрывают предпоследний остаток галактозы, таким образом препятствуя быстрому выведению гликопротеина посредством рецептора галактозы на клетках паренхимы печени.

Структура коломиновой кислоты (гомополимер N-ацетилнейраминовой кислоты)

CA продуцируются, среди прочих, определенными штаммами Escherichia coli, обладающими антигеном K1. CA обладают множеством физиологических функций. Они являются важными в качестве сырья для лекарственных и косметических средств.

Сравнительные исследования in vivo с полисиалированной и немодифицированной аспарагиназой показали, что полисиалирование увеличивало время полужизни фермента (Fernandes and Gregoriadis, Biochimica Biophysica Acta 1341: 26-34, 1997).

Получение конъюгатов путем образования ковалентной связи между растворимым в воде полимером и терапевтическим белком можно проводить множеством химических способов. Одним подходом для присоединения PSA к терапевтическим белкам является конъюгация полимеров через углеводные части белка. Соседние гидроксильные (OH) группы углеводов в белках можно легко окислять перйодатом натрия (NaIO₄) с образованием активных альдегидных групп (Rothfus and Smith, J Biol Chem 1963; 238: 1402-10; van Lenten and Ashwell, J Biol Chem 1971; 246: 1889-94). Затем полимер можно присоединять к альдегидным группам углеводов с использованием реагентов, содержащих, например, активную гидразидную группу (Wilchek M and Bayer EA, Methods Enzymol 1987; 138:429-42). Более поздней технологией является применение реагентов, содержащих аминооксигруппы, которые реагируют с альдегидами с образованием оксимных связей (WO 96/40662, WO2008/025856).

Дополнительные примеры, описывающие конъюгацию PSA с терапевтическим белком, описаны в публикации US 2009/0076237, в которой описано окисление rFVIII и последующее связывание с PSA и другими растворимыми в воде полимерами (например, PEG, HES, декстран) с использованием химии гидразидов; в WO 2008/025856, в которой описано окисление различных факторов свертывания, например, rFIX, FVIII и FVIIa, и последующее связывание с полимером, например, PEG.

Недавно был описан усовершенствованный способ, включающий мягкое окисление перйодатом сиаловых кислот с образованием альдегидов с последующей реакцией с содержащим аминооксигруппу реагентом в присутствии каталитических количеств анилина (Dirksen A and Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; 19,2543-8; и Zeng Y et al., Nature Methods 2009; 6:207-9). Анилиновые катализаторы значительно ускоряют сшивание оксимов, позволяя применять очень низкие концентрации реагентов.

Несмотря на то что доступны способы конъюгации растворимых в воде полимеров с терапевтическими белками, остается потребность в разработке материалов и способов для конъюгации растворимых в воде полимеров с содержащими углеводы соединениями, отличными от белков свертывания крови, которые улучшают фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства при одновременной минимизации затрат, ассоциированных с различными реагентами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к материалам и способам для конъюгации растворимого в воде полимера с содержащим углевод соединением, отличным от белка свертывания крови, которое улучшает фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства белка при одновременной минимизации затрат, связанных с различными реагентами.

В одном варианте осуществления изобретения предусмотрен способ конъюгации растворимого в воде полимера с окисленной углеводной группой содержащего углевод соединения, отличного от белка свертывания крови, включающий контактирование окисленной углеводной группы с растворимым в воде полимером в условиях, которые обеспечивают конъюгацию, где указанный растворимый в воде полимер содержит аминооксигруппу, и между окисленной углеводной группой и аминооксигруппой на растворимом в воде полимере образуется оксимная связь, или где указанный растворимый в воде полимер содержит гидразидную группу, и между окисленной углеводной группой и гидразидной группой растворимого в воде полимера образуется гидразоновая связь. Соединение может представлять собой (1) гликопротеин, отличный от белка свертывания крови, (2) ганглиозид или (3) систему для доставки лекарственного средства, содержащую углеводную группу.

Углеводную часть можно окислять с использованием специфичного к сахарам окисляющего фермента (например, галактоза- или глюкозаоксидаза) или путем инкубации с буфером, содержащим окислитель, выбранный из перйодата натрия (NaIO₄), тетраацетата свинца (Pb(OAc)₄) и перрутената калия (KRuO₄).

Углеводную часть можно окислять по остатку сиаловой кислоты, маннозы, галактозы или глюкозы.

Растворимый в воде полимер, используемый в изобретении, может представлять собой, но не ограничиваться ими, полиэтиленгликоль (PEG), разветвленный PEG, производное PEG, PSA, mPSA, CA, mCA, гидроксиэтилцеллюлозу (HEC), декстрин, полиоксазолин, углевод, полисахариды, пуллулан, хитозан, гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматансульфат, крахмал, декстран, карбоксиметил-декстран, полиалкиленоксид (PAO), полиалкиленгликоль (PAG), полипропиленгликоль (PPG) полиоксазолин, полиакрилоилморфолин, поливиниловый спирт (PVA), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, полифосфазен, полиоксазолин, сополимер полиэтилен-ангидрид малеиновой кислоты, сополимер полистирол-ангидрид малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформальдегид) (PHF), фосфат 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония (MPC).

В конкретных вариантах осуществления изобретения, проиллюстрированных в примерах ниже, растворимый в воде полимер представляет собой PEG или разветвленный PEG.

В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения, проиллюстрированных в примерах ниже, растворимый в воде полимер представляет собой полисиаловую кислоту (PSA) или модифицированную PSA (mPSA). PSA или mPSA могут обладать диапазоном молекулярной массы от 350 Да до 120000 Да, от 500 Да до 100000 Да, от 1000 Да до 80000 Да, от 1500 Да до 60000 Да, от 2000 Да до 45000 Да или от 3000 Да до 35000 Да.

PSA или mPSA могут представлять собой коломиновую кислоту или модифицированную коломиновую кислоту.

В другом варианте осуществления изобретения PSA или mPSA содержат приблизительно 2-500 или 10-300 звеньев сиаловой кислоты. В другом варианте осуществления предусмотрен указанный выше способ, где окислитель представляет собой перйодат натрия (NaIO₄).

Способ по изобретению может включать окисление растворимого в воде полимера с образованием альдегидной группы на концевом звене сиаловой кислоты на растворимом в воде полимере и реакцию окисленного растворимого в воде полимера с аминооксилинкером.

В другом варианте осуществления изобретения предусмотрен указанный выше способ, где растворимый в воде полимер получают путем реакции активированного аминооксилинкера с окисленным растворимым в воде полимером, где линкер представляет собой гомобифункциональный или гетеробифункциональный линкер. Гомобифункциональный линкер может иметь общую формулу NH₂[OCH₂CH₂]_nONH₂, где n=1-50, предпочтительно 1-11, более предпочтительно 1-6. В частности, линкер может быть выбран из:

3-оксапентан-1,5-диоксиминового линкера формулы:

и

3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиаминового линкера формулы:

PSA или mPSA можно окислять путем инкубации с окислителем с образованием концевой альдегидной группы на невосстанавливающем конце PSA.

Способ может включать окисление растворимого в воде полимера с образованием альдегидной группы на концевом звене растворимого в воде полимера, например, на концевом звене сиаловой кислоты в PSA или mPSA, и реакцию окисленного растворимого в воде полимера с аминооксилинкером. В другом варианте осуществления предусмотрен указанный выше способ, где аминооксилинкер представляет собой 3-оксапентан-1,5-диоксиамин. В родственном варианте осуществления окислитель представляет собой NaIO₄.

В другом варианте осуществления изобретения предусмотрен указанный выше способ, где контактирование окисленной углеводной группы с активированным растворимым в воде полимером происходит в буфере, содержащем нуклеофильный катализатор, выбранный из группы, состоящей из анилина и производных анилина.

Гидразидная группа может быть образована на растворимом в воде полимере путем реакции окисленного растворимого в воде полимера с гидразидным линкером. Гидразидный линкер может соответственно представлять собой дигидразид адипиновой кислоты или гидразин.

В другом варианте осуществления изобретения предусмотрен указанный выше способ, кроме того, включающий стадию восстановления оксимной или гидразоновой связи в конъюгированном белке, например, путем инкубации конъюгированного белка в буфере, содержащем восстанавливающее соединение, выбранное из группы, состоящей из цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃) и аскорбиновой кислоты (витамин C). В родственном варианте осуществления восстанавливающее соединение представляет собой цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃).

В другом варианте осуществления изобретения предусмотрен конъюгированный гликопротеин, продуцированный любым из описанных выше способов. В другом варианте осуществления изобретения конъюгированный гликопротеин, отличный от белка свертывания крови, ганглиозид или система для доставки лекарственных средств содержит (a) указанный гликопротеин, ганглиозид или систему для доставки лекарственных средств; и (b) по меньшей мере один растворимый в воде аминооксиполимер, связанный с гликопротеином (a), где указанный растворимый в воде аминооксиполимер связан с гликопротеином, ганглиозидом или системой для доставки лекарственных средств через одну или несколько углеводных частей. В следующем варианте осуществления изобретения конъюгированный гликопротеин, отличный от белка свертывания крови, ганглиозид или система для доставки лекарственного средства содержит (a) указанный гликопротеин, ганглиозид или систему для доставки лекарственного средства; и (b) по меньшей мере один гидразидный растворимый в воде полимер, связанный с гликопротеином (a), где указанный гидразидный растворимый в воде полимер связан с ганглиозидом гликопротеина или системой для доставки лекарственного средства через одну или несколько углеводных частей.

ФИГУРЫ

На фиг.1 представлен синтез растворимых в воде диаминоксилинкеров: 3-окса-пентан-1,5-диоксиамина и 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина.

На фиг.2 представлено получение аминоокси-PSA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фармакологические и иммунологические свойства углеводсодержащих соединений, таких как гликопротеины, отличные от белков свертывания крови, можно улучшать путем химической модификации и конъюгации с растворимым в воде полимером, в частности, PEG или PSA или mPSA. Свойства полученных конъюгатов, как правило, строго зависят от структуры и размера полимера. Таким образом, обычно являются предпочтительными полимеры с определенным и узким распределением размеров. PSA и mPSA, используемые в конкретных примерах, можно очищать так, чтобы получать конечный препарат PSA с узким распределением размеров.

ГЛИКОПРОТЕИНЫ

Как описано в настоящем документе, главным образом, изобретением предусматриваются гликопротеины, отличные от белков свертывания крови, включая, но не ограничиваясь ими, цитокины такие как интерлейкины, альфа-, бета- и гамма-интерфероны, колониестимулирующие факторы, включая гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, фибробластные факторы роста, тромбоцитарные факторы роста, активирующий фосфолипазу белок (PUP), инсулин, растительные белки, такие как лектины и рицины, факторы некроза опухоли и родственные аллельные формы, растворимые формы рецепторов фактора некроза опухоли, рецепторы интерлейкинов и растворимые формы рецепторов интерлейкинов, факторы роста, тканевые факторы роста, трансформирующие факторы роста, такие как TGFα или TGFβ и эпидермальные факторы роста, гормоны, соматомедины, пигментарные гормоны, гипоталамические рилизинг-факторы, антидиуретические гормоны, пролактин, хорионический гонадотропин, фоликулостимулирующий гормон, тиреотропный гормон, тканевой активатор плазминогена и иммуноглобулины, такие как IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, моноклональные антитела, эритропоэтин (EPO), факторы крови, отличные от белков свертывания крови, галактозидазы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуин, их фрагменты и любые слитые белки, содержащие любой из упомянутых выше белков или их фрагментов вместе с терапевтическими гликопротеинами. В одном варианте осуществления гликопротеин представляет собой EPO. В следующем варианте осуществления гликопротеин представляет собой галактозидазу. В следующем варианте осуществления гликопротеин представляет собой ДНКазу. В следующем варианте осуществления гликопротеин представляет собой фетуин. Наконец, в следующем варианте осуществления гликопротеин представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.

Как используют в настоящем документе, "биологически активное производное" или "биологически активный вариант" включает любое производное или вариант молекулы, имеющие по существу те же функциональные и/или биологические свойства, что и указанная молекула, такие как свойства связывания, и/или ту же структурную основу, такую как пептидная основная цепь или основное полимерное звено.

"Аналог", "вариант" или "производное" представляет собой соединение, по существу сходное по структуре и имеющее ту же биологическую активность, хотя в определенных случаях в отличной степени, что и встречающаяся в природе молекула. Например, полипептидный вариант относится к полипептиду, обладающему по существу сходной структурой и имеющему ту же биологическую активность, что и эталонный полипептид. Варианты или аналоги отличаются составом их аминокислотных последовательностей по сравнению со встречающимся в природе полипептидом, из которого происходит аналог, на основании одной или нескольких мутаций, вовлекающих (i) делецию одного или нескольких аминокислотных остатков на одном или нескольких концах полипептида и/или в одной или нескольких внутренних областях встречающейся в природе полипептидной последовательности (например, фрагменты), (ii) инсерцию или добавление одной или нескольких аминокислот на одном или нескольких концах (как правило, "добавление" или "слияние") полипептида и/или в одной или нескольких внутренних областях (как правило, "инсерция") встречающейся в природе полипептидной последовательности, или (iii) замену одной или несколькими аминокислотами других аминокислот во встречающейся в природе полипептидной последовательности. В качестве примера, "производное" относится к полипептиду, обладающему той же или существенно сходной структурой по сравнению с полипептидом, который был модифицирован, например, химически.

Полипептиды вариантов или аналогов включают варианты с инсерцией, где к аминокислотной последовательности белка по изобретению добавлены один или несколько аминокислотных остатков. Инсерции могут быть расположены на любом или обоих концах белка и/или они могут быть расположены во внутренних областях аминокислотной последовательности белка. Варианты с инсерцией с дополнительными остатками на любом или обоих концах, включают, например, слитые белки и белки, включающие маркерные аминокислоты или другие аминокислотные метки. В одном аспекте молекула белка необязательно содержит N-концевой Met, особенно когда молекула экспрессируется рекомбинантно в бактериальной клетке, такой как E. coli.

В вариантах с делецией один или несколько аминокислотных остатков в белке или полипептиде, как описано в настоящем документе, удалены. Делеции могут быть проведены на одном или обоих концах белка или полипептида и/или с удалением одного или нескольких остатков в аминокислотной последовательности белка. Варианты с делецией, таким образом, включают фрагменты белковой или полипептидной последовательности.

В вариантах с заменой один или несколько аминокислотных остатков белка или полипептида удалены и заменены альтернативными остатками. В одном аспекте замены являются консервативными в природе и консервативные замены этого типа хорошо известны в данной области. Альтернативно изобретение охватывает замены, которые также являются неконсервативными. Иллюстративные консервативные замены описаны в Lehninger, [Biochemistry, 2^nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77] и представлены непосредственно ниже.

КОНСЕРВАТИВНЫЕ ЗАМЕНЫ
ХАРАКТЕРИСТИКА БОКОВОЙ ЦЕПИ	АМИНОКИСЛОТА
Неполярная (гидрофобная):
A. Алифатическая	A L I V P
B. Ароматическая	F W
С. Серосодержащая	M
D. Промежуточная	G
Незаряженная полярная:
A. Гидроксильная	S T Y
B. Амиды	N Q
С. Сульфгидрильная	C
D. Промежуточная	G
Положительно заряженная (основная)	K R H
Отрицательно заряженная (кислотная)	D E

Альтернативно, иллюстративные консервативные замены указаны непосредственно ниже.

КОНСЕРВАТИВНЫЕ ЗАМЕНЫ II
ИСХОДНЫЙ ОСТАТОК	ИЛЛЮСТРАТИВНАЯ ЗАМЕНА
Ala (A)	Val, Leu, Ile
Arg (R)	Lys, Gln, Asn
Asn (N)	Gln, His, Lys, Arg
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
His (H)	Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu (L)	Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K)	Arg, Gln, Asn
Met (M)	Leu, Phe, Ile
Phe (F)	Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P)	Gly
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala

ГАНГЛИОЗИДЫ

В вариантах осуществления изобретения ганглиозиды конъюгируют с растворимыми в воде полимерами, например, PEG или PSA или mPSA. Известно, что ганглиозиды обеспечивают клетки с отличающимися поверхностными маркерами, которые участвуют в распознавании клеток и межклеточной коммуникации. Они пригодны в качестве лекарственных средств.

Конъюгаты по изобретению могут содержать ганглиозид и растворимый в воде полимер, в котором ганглиозид содержит гликосфинголипид (церамид и олигосахарид) с одной или несколькими сиаловыми кислотами, присоединенными к цепи сахаров. Ганглиозиды можно классифицировать согласно тому, сколько звеньев сиаловых кислот присутствуют на молекуле. Примерами ганглиозидов являются GM1, GM2 и GM3 (моносиалоганглиозиды), GD1a, GD1b, GD2 и GD3 (дисиалоганглиозиды), GT1b (трисиалоганглиозид) и GQ1 (тетрасиалоганглиозид).

Для применения в настоящем изобретении предпочтительные ганглиозиды содержат церамид, связанный с глюкозой, которая связана с первой галактозой, которая связана с N-ацетилгалактозамином, который связан со второй галактозой. Эта вторая галактоза может быть связана с одной сиаловой кислотой. Первая галактоза может быть связана с одной, двумя, тремя или четырьмя сиаловыми кислотами. Сиаловые кислоты могут быть присоединены либо в качестве мономеров (по одной на каждой из молекул галактозы), либо в качестве олигосиаловых кислот (2-4 сиаловых кислоты) к первой галактозе.

При введении терапевтические ганглиозиды должны циркулировать в крови в течение длительных периодов. Чтобы действие ганглиозидов на ткани-мишени было более эффективным, их можно подвергать полисиалированию, например, способом по изобретению.

СИСТЕМЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

В следующих вариантах осуществления изобретения системы для доставки лекарственных средств конъюгируют с растворимым в воде полимером, например, PEG или PSA или mPSA. Как правило, система для доставки лекарственного средства (DDS) представляет собой молекулярную структуру или структуру в виде частиц, которая может контролировать судьбу и эффект лекарственных средств, связанных с этой структурой. DDS можно подразделить на два основных типа. Первый тип включает макромолекулы (MDDS), например, антитела, неогликопротеины, а также синтетические полимеры, такие как поли(гидроксипропилметакриламид), полилизин и полимеризованные алкилцианоакрилаты. Связывание лекарственных средств с различными типами макромолекулярных носителей, включая моноклональные антитела, для нацеливания лекарственного средства в желаемые области, описано, например, Gregoriadis в Nature 265, 407-411 (1977). Вторым типом являются DDS в форме частиц (PDDS), которые содержат, например, наносферы или микросферы, которые содержат биодеградируемые материалы, такие как альбумин, или полубиодеградируемые материалы, такие как декстран и алкилцианоакрилатные полимеры, или носители, образованные из неионных поверхностно-активных веществ, или липосомы - для подробного описания которых см., например, Gregoriadis в NIPS, 4, 146-151 (1989).

Лекарственные средства можно либо ковалентно связывать с, либо пассивно заключать в DDS. Например, PDDS, содержащие везикулы или липосомы из поверхностно-активного вещества, могут заключать в себе гидрофильные или гидрофобные фармацевтически активные соединения вследствие формирования соответствующей комбинации слоев поверхностно-активного вещества или липидных молекул. Фармацевтически активные соединения обычно ковалентно связывают с MDDS связью, которая может расщепляться или может не расщепляться в организме, например, до или после того, как активное соединение выполняет его функцию.

Многие из MDDS обладают присущей (например, антитела) или приобретенной (например, неогликопротеины) способностью быть распознанными клетками-мишенями или тканями-мишенями через рецепторы на их поверхности. Как правило, такие DDS захватываются специфично мишенью при инъекции. Однако специфичный захват ограничен объемом DDS, захватываемого другими, не имеющими отношения (к терапии) тканями. Причиной этому является то, что антитела и другие белки DDS (независимо от их специфичности к мишени) должны, подобно другим белкам, быть катаболизированы в конце их биологической жизни.

Синтетические полимеры, используемые в MDDS макромолекулярного типа представляют собой, например, поли(гидроксипропилметакриламид)полилизин и полимеризованные алкилцианоакрилаты. Они могут катаболизироваться в ретикулоэндотелиальной системе (RES) или другими тканями с помощью соответствующих лизосомальных ферментов. Может быть желательным снижение скорости катаболизма таких биодеградируемых DDS макромолекулярного типа различными способами, например, путем снижения захвата DDS RES или другими тканями, или путем снижения деградации лизосомальными ферментами после захватывания RES.

DDS в форме частиц (PDDS), как правило, удаляются из кровотока посредством RES. Вследствие их преимущественного удаления RES, PDDS часто используют для доставки лекарственных средств в эти ткани. Однако часто желательно, чтобы PDDS были направлены в ткани, отличные от тканей RES. Для достижения этой цели необходимо блокировать или замедлять перехват PDDS посредством RES.

DDS для применения в изобретения могут исходно не содержать гликоны. Возможно добавление или иное включение гликона в структуру DDS. Примерами таких случаев являются липосомы, включающие маннозилированный или галактозилированный липид. Эти гликолипосомы нацеливают активные средства в ткани, которые экспрессируют рецептор маннозы или галактозы, соответственно.

Когда DDS должны циркулировать в крови в течение длительных периодов, так чтобы, например, захват тканями был более эффективным (как в случае паренхимных клеток печени), их преимущественно полисиалируют способами по изобретению.

ВВЕДЕНИЕ

В одном варианте осуществления конъюгированное соединение по настоящему изобретению можно вводить путем инъекции, такой как внутривенная, внутримышечная или внутрибрюшинная инъекция. Композиции могут быть пригодны в качестве терапевтических, диагностических и/или сходных средств.

Для введения композиций, содержащих конъюгированное соединение по настоящему изобретению человеку или тестируемым животным, в одном аспекте композиции содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Термины "фармацевтически" или "фармакологически приемлемый" относятся к молекулярным структурам и композициям, которые являются стабильными, ингибируют деградацию белка, такую как агрегация и продукты расщепления и, кроме того, не вызывают аллергических или иных неблагоприятных реакций при введении с использованием путей, хорошо известных в данной области, как описано ниже. "Фармацевтически приемлемые носители" включают любые и все клинически пригодные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность и замедляющие всасывание средства и т.п., включая средства, описанные выше.

Как используют в настоящем документе, "эффективное количество" включает дозу, пригодную для лечения млекопитающего, имеющего клинически установленное нарушение.

Композиции можно вводить перорально, местно, трансдермально, парентерально, с помощью ингалируемого спрея, вагинально, ректально или путем внутричерепной инъекции. Термин "парентеральный", как используют в настоящем документе, включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, интрацистернальную инъекцию или способы инфузии. Также предусмотрено введение путем внутривенной, внутрикожной, внутримышечный, внутригрудной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретную область. Как правило, композиции по существу не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредоносными для реципиента.

Однократное или многократные введения композиции можно проводить с уровнями и расписанием введения доз, выбираемыми лечащим врачом. Для профилактики или лечения заболевания соответствующая дозировка будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, как описано выше, тяжести или течения заболевания, введения лекарственного средства в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, клинического анамнеза пациента и ответа на лекарственное средство, и мнения лечащего врача.

Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество конъюгированного соединения или белка, как определено в настоящем документе. Фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, соль, буфер или эксципиент. Фармацевтическую композицию можно применять для лечения клинически установленных нарушений. Фармацевтическая композиция по изобретению может представлять собой раствор или лиофилизированный продукт. Растворы фармацевтической композиции можно подвергать любому пригодному способу лиофилизации.

В качестве дополнительного аспекта изобретение относится к наборам, которые содержат композицию по изобретению, упакованную так, чтобы облегчить ее применение для введения индивидуумам. В одном варианте осуществления такой набор включает соединение или композицию, описанные в настоящем документе (например, композицию, содержащую конъюгированный белок), упакованные в контейнер, такой как закрытая бутыль или емкость, с ярлыком, прикрепленным к контейнеру или включенным в упаковку, на котором описано использование соединения или композиции в способе применения. В одном варианте осуществления набор содержит первый контейнер, имеющий композицию, содержащую конъюгированный белок, и второй контейнер, имеющий физиологически приемлемый раствор для разбавления композиции в первом контейнере. В одном аспекте соединение или композиция упакованы в виде единичной дозированной формы. Кроме того, набор может включать устройство, пригодное для введения композиции согласно конкретному пути введения. Предпочтительно, набор содержит ярлык, на котором описано применение композиции терапевтического белка или пептида.

В одном варианте осуществления производное сохраняет полную функциональную активность исходных терапевтических соединений и обеспечивает увеличенное время полужизни in vivo по сравнению с исходными терапевтическими соединениями. В другом варианте осуществления производное сохраняет по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 процентов (%) биологической активности относительно исходного соединения.

СИАЛОВАЯ КИСЛОТА И PSA

Как используют в настоящем документе "части сиаловых кислот" включают мономеры или полимеры ("полисахариды") сиаловых кислот, которые растворимы в водном растворе или суспензии и имеют небольшое отрицательное влияние, такое как побочные эффекты, или не имеют его, у млекопитающих при введении конъюгата PSA-белок в фармацевтически эффективном количестве. В одном аспекте PSA и mPSA характеризуются как имеющие 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 или 500 звеньев сиаловых кислот. В некоторых аспектах различные звенья сиаловых кислот объединены в цепь.

В одном варианте осуществления изобретения часть сиаловых кислот в PSA или mPSA является высоко гидрофильной, и в другом варианте осуществления все соединение является высоко гидрофильным. Гидрофильность обеспечивается, главным образом, выступающими карбоксильными группами звеньев сиаловых кислот, а также гидроксильными группами. Сахаридное звено может содержать другие функциональные группы, такие как амино, гидроксильную или сульфатную группу или их комбинации. Эти группы могут присутствовать на встречающихся в природе сахаридных соединениях или могут быть внесены в производные полисахаридные соединения. PSA и mPSA, используемые в способах и конъюгатах по изобретению, можно далее охарактеризовывать, как описано выше в разделе "Уровень техники изобретения".

Встречающийся в природе полимер PSA доступен в качестве полидисперсного препарата, демонстрирующего широкое распределение размеров (например, Sigma C-5762) и высокую полидисперсность (PD). Поскольку полисахариды обычно продуцируются в бактериях, несущих в себе присущий им риск совместно очищающихся эндотоксинов, очистка длинных цепей полимеров сиаловых кислот может привести к вероятности увеличенного содержания эндотоксинов. Короткие молекулы PSA с 1-4 звеньями сиаловых кислот также можно получать синтетически (Kang SH et al., Chem Commun. 2000; 227-8; Ress D and Linhardt RJ, Current Organic Synthesis. 2004; 1:31-46), таким образом минимизируя риск высоких уровней эндотоксинов. Однако также можно изготавливать препараты PSA с узким распределением размеров и низкой полидисперсностью, которые не содержат эндотоксинов. Полисахаридные соединения, особенно пригодные для изобретения, представляют собой, в одном аспекте, соединения, продуцируемые бактериями. Некоторые из этих встречающихся в природе полисахаридов известны в качестве гликолипидов. В одном варианте осуществления полисахаридные соединения по существу не содержат концевых галактозных звеньев.