Усовершенствование генетических конструкций для повышения эффективности антивич терапии

Усовершенствование генетических конструкций для повышения эффективности антивич терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к медицинской и молекулярной генетике, а именно к генетическим конструкциям, экспрессирующим РНК-последовательности и/или гены, кодирующие белки, обладающие антивирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека, и могут быть использованы в научных исследованиях.

Уровень техники

ВИЧ инфекция остается огромной проблемой для здравоохранения и общества в целом. Число ВИЧ инфицированных продолжает неуклонно расти. Современная высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) позволяет эффективно сдерживать прогрессирование заболевания и значительно повышает уровень жизни ВИЧ-инфицированного пациента. Однако ВААРТ является дорогостоящим пожизненным лечением и приводит к накоплению побочных эффектов, связанных с токсичностью используемых химических препаратов. Кроме того, проблемой ВААРТ является возникновение лекарственно устойчивых мутантных штаммов, что приводит к необходимости в постоянной разработке и использовании все большего количества новых химических препаратов.

Генная терапия ВИЧ подразумевает введение в клетки генов, подавляющих развитие инфекции. На данный момент на клеточных культурах опробовано множество генетических конструкций, в той или иной мере усиливающих устойчивость клеток к ВИЧ. Усовершенствование клинических методов изоляции и трансплантации клеток позволяет рассматривать генотерапию как перспективное направление антиВИЧ терапии.

Патент RU 2426788 («Генетические конструкции для антиВИЧ терапии», 20.08.2011; МПК C12N 15/86) раскрывает генетические конструкции на основе модифицированного лентивирусного вектора, содержащие последовательность, кодирующую модифицированный белок TRIM5α (tripartite motif 5 а) человека, где модификация включает изменение аминокислотной последовательности TRIM5α в области SPRY домена, которое обеспечивает распознавание белком TRIM5α вирусного капсида ВИЧ. TRIM5α - белковый фактор врожденного иммунитета, обуславливающий устойчивость к ретровирусам. Различие между приматами в аминокислотном составе домена SPRY белка TRIM5 определяет различие в наборе ретровирусов, к которым устойчив данный вид. Гомолог TRIM5α у резус-макак обеспечивает устойчивость клеток этих животных к заражению ВИЧ. TRIM5α человека не способен распознавать ВИЧ, однако небольшое изменение аминокислотной последовательности позволяет модифицировать белок таким образом, что он приобретает противовирусную антиВИЧ активность.

Задачей изобретения согласно патенту RU 2426788 является расширение арсенала средств нового поколения, предназначенных для лечения ВИЧ-инфекции. Оно направлено на создание более эффективных антиВИЧ препаратов на основе РНК и белков, продуцируемых в клетках, с помощью введенных генетических конструкций, предложенных по изобретению. В RU 2426788 также продемонстрировано, что комбинирование двух и более антивирусных агентов, перечисленных ниже, в одной генетической конструкции обеспечивает синергетический эффект: каждый агент по отдельности в различной степени подавляет репродукцию ВИЧ (от 50% до 90%); одновременное использование нескольких противовирусных агентов замедляет образование мутантных штаммов, а комбинация противовирусных агентов с агентами, придающими резистентность клеткам к ВИЧ, позволяет получить близкую к 100% антивирусную активность препарата и предотвратить появление устойчивых мутантов. В качестве одного из агентов, придающих клетке устойчивость к ВИЧ, авторами были выбраны короткие интерферирующие РНК, направленные против гена хемокинового рецептора CCR5, задействованного в процессе проникновения ВИЧ в клетку. Техническим результатом является создание предложенных конструкций и реализация ими указанного назначения. Частные варианты выполнения изобретения включают генетические конструкции для антиВИЧ терапии на основе лентивирусного вектора, в том числе и самоинактивирующегося лентивирусного вектора, где лентивирусный вектор создан на основе одного или нескольких из лентивирусов: ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИО (вирус иммунодефицита обезьян, SIV), вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), лентивирус артрита-энцефалита коз (CAEV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV), вирус иммунодефицита кошек (FIV) и проч.

Заявка на патент США US2012076763 ("Combination anti-HIV vectors, targeting vectors, and methods of use"; 29.03.2012; МПК A61K 48/00, C12N 5/071, C12N 15/49, A61P 31/18, C12N 5/10, C12Q 1/70, C12N 15/63, C12N 7/01) раскрывает рекомбинантные лентивирусные векторы, включающие следующие элементы: лентивирусную основу, содержащую последовательности для интеграции в геном клетки-мишени; нуклеиновые кислоты, кодирующие интерферирующую РНК, направленную против гена рецептора человека CCR5; а также элемент контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей RNAi CCR5. Векторы также могут содержать полинуклеотиды, кодирующие последовательности TRIM5α и TAR-ловушки ВИЧ вместе с элементами регуляции экспрессии генов, и сочетаться с упаковочными плазмидами и сопряженными специфическими антителами против клеток-мишеней. В описании указанной заявки приводится полинуклеотид, кодирующий последовательность химерный TRIM5α, где последовательность 13 аминокислот резус-макаки вставлена в последовательность белка TRIM5α человека (SEQ ID NO 17, 994-1032). Полученный химерный TRIM5α эффективно ингибирует вирус ВИЧ-1 на стадии после проникновения вируса в клетку и перед его интеграцией. В заявке также приведены диагностические и терапевтические методы использования указанных конструкций.

В заявке на патент США US2012270773 ("TRIM5alpha mutants and uses thereof; 25.10.2012; МПК С07Н 21/04, A61K 31/7088, C12N 5/02, C12Q 1/70, C07K 16/18, C07K 14/435, A61K 38/00, C12N 15/63, C12N 5/10) описывается мутантный полипептид TRIM5α, придающий более высокую устойчивость лентивирусам по сравнению с диким типом TRIM5α человека. Указанный мутантный полипептид TRIM5α содержит мутацию в аминокислоте (замена или делеция), соответствующую аминокислоте 324, 328, 330, 333, 335, 336 или 337 дикого типа TRIM5α человека. В указанной заявке также описано выделение нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности, кодирующие вышеупомянутые полипептиды TRIM5α, или их гомологи. Заявка раскрывает композиции, содержащие мутантные полипептиды TRIM5α, кодирующие их нуклеиновые кислоты, векторы для переноса генов, а также способы определения (in vivo или in vitro) устойчивости клеток к лентивирусной инфекции, включающие определение в биологическом образце наличия или отсутствия мутантного TRIM5α и/или кодирующих их нуклеиновые кислоты. Показано, что клетки, содержащие мутантные полипептиды TRIM5α, имеют повышенную устойчивость к лентивирусной инфекции.

В работе Андерсона (J.S. Anderson, J. Javien, J.A. Nolta, and G. Bauer "Preintegration HIV-1 Inhibition by a Combination Lentiviral Vector Containing a Chimeric TRIM5α Protein, а CCR5 shRNA, and a TAR Decoy", Molecular Therapy, 2009, vol. 17(12), pp.2103-2114) описан комбинированный лентивирусный вектор, кодирующий три высокоэффективных антиВИЧ гена и функционирующий на отдельных этапах жизненного цикла вируса:

- CCR5 короткие шпилечные РНК (shRNA) (перед проникновением вируса),

- химерный TRIM5α человека/ резус-макаки (на стадии после проникновения вируса ВИЧ в клетку и перед его интеграцией),

- TAR-ловушки (после интеграции).

Основные усилия ученых при дизайне указанного антиВИЧ вектора были сосредоточены на блокировке продуктивного заражения ВИЧ-1 и ингибировании любого образования провируса, который будет поддерживать вирусный резервуар.

Э. Бативелли и коллеги (Е. Battivelli, J. Migraine, D. Lecossier et al. "Modulation of TRIM5α Activity in Human Cells by Alternatively Spliced TRIM5 Isoforms", J. Virol., 2011, vol. 85(15), pp.7828-7835) установили, что активность TRIM5α в конкретном типе клеток может зависеть от соотношения экспрессированных изоформ TRIM5. Кроме TRIM5α могут присутствовать транскрипты TRIM5ι, TRIM5γ, TRIM5δ и TRIM5κ. Они не ингибируют репликацию ВИЧ-1, но обладают доминантно-негативной активностью в отношении TRIM5α. Авторами показано, что экспрессия TRIM5i уменьшает противовирусную активность TRIM5α в человеческих клетках U373-X4, что указывает на то, что физиологические уровни экспрессии усеченных изоформ TRIM5 в клетках человека могут снижать активность TRIM5α.

Задачей настоящего изобретения является усовершенствование генетических конструкций, содержащих последовательность, кодирующую модифицированный белок TRIM5α человека, с целью повышения уровня экспрессии гена, и, следовательно, количества белка, что приведет к повышению противовирусной эффективности данных конструкций в отношении вируса иммунодефицита человека. Технический результат - создание усовершенствованных генетических конструкций и реализация ими указанного назначения. Предлагаемые в объекте исследования генетические конструкции, кодирующие модифицированный белок TRIM5α, отличаются от известных генетических конструкций тем, что в последовательности модифицированного гена TRIM5α размером 1488 п.н. (496 кодонов) были произведены синонимичные замены нуклеотидов по всей длине таким образом, что процентный состав суммы всех гуанинов (G) и цитозинов (С) по отношению к общему числу нуклеотидов (GC-состав) последовательности увеличился.

Согласно результатам исследования, антиВИЧ активность конструкции, включающей последовательность (SEQ ID N1), кодирующую модифицированный белок TRIM5α человека, почти в 40 раз выше по сравнению с активностью аналогичной конструкции, включающей последовательность (SEQ ID N2), кодирующую модифицированный белок TRIM5α человека, описанной в патенте RU 2426788. Кроме того, увеличилась жизнеспособность клеток в присутствии ВИЧ.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении "молекула нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" означают полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотиды, либо рибонуклеотиды, либо их аналоги. Полинуклеотиды могут иметь трехмерную структуру и могут осуществлять любую функцию. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются ген, генный фрагмент, экзоны, интроны, открытая рамка считывания, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, космиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, нуклеиновокислотные зонды и праймеры.

Полинуклеотид обычно состоит из специфической последовательности из четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т) (а в случае, если указанным полинуклеотидом является РНК, то вместо тимина присутствует урацил (U)). Таким образом, термин "полинуклеотидная последовательность" означает буквенное представление полинуклеотидной молекулы. Это буквенное представление может быть введено в базу данных компьютера, имеющего центральный процессор, и используется в биоинформатике, например в функциональной геномике и в поиске гомологии.

Термин "конструкция" означает любую молекулу, способную переносить последовательности нуклеиновой кислоты (например, невирусные векторы, частицы-носители, липосомы и вирусные векторы) в клетки-мишени. Термин "плазмидная конструкция" означает внехромосомный генетический элемент, способный к саморепликации в клетке-хозяине. Обычно термины "вектор", "конструкция", "экспрессирующий вектор" и "вектор для переноса генов" означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную регулировать экспрессию нужного гена и переносить генные последовательности в клетки-мишени. Таким образом, этот термин включает в себя клонирующие и экспрессирующие носители, а также вирусные векторы.

Вектор может содержать либо ДНК, либо РНК. Например, для получения вектора может быть использован либо ДНК-, либо РНК-вирус. На основе геномной РНК-вируса может быть получена копия кДНК. И наоборот, фрагмент кДНК (или вирусной геномной ДНК) может быть транскрибирован in vitro с образованием РНК. Эти методики хорошо известны специалистам.

Термин "кодирующая последовательность" или последовательность, которая "кодирует" выбранный полипептид, означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo при ее нахождении под контролем соответствующих регуляторных последовательностей (или "регуляторных элементов"). Границы кодирующей последовательности определены старт-кодоном у 5'(амино)-конца и кодоном терминации трансляции у 3'(карбокси)-конца. Кодирующей последовательностью может быть, не ограничиваясь ими, кДНК, происходящая от вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные ДНК-последовательности, происходящие от вирусной или прокариотической ДНК, и даже синтезированные ДНК-последовательности. Последовательность терминации транскрипции может быть локализована со стороны 3'-конца по отношению к кодирующей последовательности. Транскрипция и трансляция кодирующих последовательностей обычно регулируются "регуляторными элементами", включая, но не ограничиваясь ими, промоторы транскрипции, энхансерные элементы транскрипции, последовательности Шайна-Дальгарно, сигналы терминации транскрипции, последовательности полиаденилирования (локализованные со стороны 3'-конца по отношению к кодону терминации трансляции), последовательности для оптимизации инициации трансляции (локализованные со стороны 5'-конца по отношению к кодирующей последовательности) и последовательности терминации трансляции. Термин "элемент регуляции экспрессии генов" означает нуклеотидную последовательность, содержащую, как минимум, промотор. Такой элемент может, кроме того, содержать другие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующих последовательностей, функционально присоединенных к промотору, или влияющие на такую экспрессию. Компоненты этих элементов необязательно должны быть смежными, то есть они могут быть разделены промежуточными последовательностями. Компоненты этих элементов могут влиять на экспрессию кодирующих последовательностей на уровне транскрипции, стабильности РНК, процессинга и/или трансляции РНК. Обычно такой элемент не содержит кодирующих последовательностей, с которыми они функционально связаны. В некоторых случаях, элемент регуляции экспрессии гена может содержать природный ген либо, в основном, состоять из такого гена, кроме кодирующей последовательности данного гена.

Векторы для генной терапии ВИЧ

Главным требованием генной терапии является устойчивая экспрессия терапевтических генов, не вызывающая негативных клинических эффектов. Крайне желательно иметь вектор (последовательность, обеспечивающую встраивание ДНК последовательностей в геном клетки человека) с высоким титром, который способен стабильно интегрировать в клетки-мишени (включая делящиеся и неделящиеся клетки) и который не является патогенным и не вызывает иммунной реакции.

Ретровирусные векторные системы

Одной из первых систем для генотерапии был ретровирусный вектор, сконструированный на основе вируса мышиного лейкоза Moloney (MoMLV). Этот вектор обладает способностью инфицировать делящиеся клетки. ДНК-провирус MoMLV способен интегрироваться в геном делящихся клеток и передаваться по наследству вместе с клеточным геномом. В целом, клинические испытания с помощью векторных систем на основе вируса MoMLV составляют более 23% от клинических испытаний всех систем генотерапии различных заболеваний человека.

Векторы на основе спумовируса (foamy virus)

В настоящее время для генной терапии разработаны векторы на основе спумавируса. Спумавирусы - не патогенные, интегрирующие ретровирусы обладающие свойствами отличающими их от лентивирусов и гамма-ретровирусов. Такие векторы позволяют упаковывать и переносить большие фрагменты ДНК и эффективно трансдуцируют гемопоэтические клетки. Кроме того преимуществом данного вектора для генной терапии ВИЧ инфекции является низкая гомология нуклеотидной последовательности с вирусом иммунодефицита человека и, благодаря которой, резко понижается риск мобилизации вектора, обеспечивая безопасность терапии. Способность эффективно переносить антиВИЧ трансгены, которые не могут быть перенесены с помощью векторов на основе ВИЧ-1, является ключевым преимуществом этого вектора. Показано, что на титр вектора на основе спумавируса не влияют кассеты трансгенов, которые значительно уменьшают титр лентивирусного вектора. Сайты интеграции данного вектора значительно отличаются от сайтов интеграции лентивирусов и гамма-ретровирусов, что может уменьшить риск возникновения лейкемии при использовании в генной терапии.

Невирусные системы доставки генов - вектор на основе транспозопов

Невирусные системы доставки генов (с помощью ДНК плазмид) являются наиболее простыми и безопасными, однако эффективность таких способов долгое время оставалась очень низкой. На данный момент существуют несколько экспрессионных векторов на основе транспозонов, некоторые из которых обладают эффективностью переноса ДНК, сравнимой с ретровирусными системами. Примером такого вектора может служить транспозонная система Спящей красавицы (Sleeping Beauty). Эта система состоит из искусственного транспозона и соответствующей транспозазы, фермента, который обладает функцией разрезания и встраивания фрагментов ДНК. Процесс переноса гена состоит из двух ступеней: на первой транспозаза распознает короткие инвертированные или прямые повторы в составе транспозона, а на второй вырезает и встраивает транспозон в геномную ДНК, в области ТА-повторов. В системе транспозонов Спящей красавицы могут быть использованы две независимые плазмиды, кодирующие транспозон и транспозазу или оба компонента могут быть объединены на одной плазмиде. Усовершенствование фермента транспозазы привело к увеличению эффективности доставки генов с помощью этой системы. Показана возможность переноса генов в различные клетки млекопитающих, включая эмбриональные клетки мышей. Использование векторов транспозон/транспозаза представляет собой альтернативный способ доставки трансгена для генной терапии ВИЧ.

Лентивирусные векторы

На сегодняшний день лентивирусные векторы на основе ВИЧ-1 наиболее часто используются в генной терапии и молекулярно-биологических исследованиях, так как строение генома этого вируса детально изучено, что значительно облегчает проведение генноинженерных манипуляций. Однако также сконструированы векторы на основе других лентивирусов: ВИЧ-2, ВИО, BIV, CAEV, EIAV, FIV, вирус болезни Джембрана (JDV). Такие векторы потенциально могут обладать определенными преимуществами, такими как повышенная безопасность, так как они не могут инфицировать человека, а значит понижается вероятность возникновения репликационно-компетентных вирусных частиц. Кроме того многие антиВИЧ агенты действующие против вируса на этапе упаковки значительно снижают титр вирусных частиц при использовании векторов на основе ВИЧ-1, но не влияют на титр вирусных частиц на основе других лентивирусов.

Вирусы подсемейства лентивирусов обладают уникальной способностью стабильно переносить генетический материал в неделящиеся клетки. В отличие от MuLV и других γ-ретровирусов лентивирусные векторы обычно встраиваются после точки начала транскрипции, и, таким образом, не могут активировать онкогены. Широкомасштабный скрининг сайтов интеграции лентивирусов показал отсутствие злокачественных перерождений клеток. Разработка новых векторов на основе лентивирусов (в частности, ВИЧ) открывает широкие возможности в генной терапии ВИЧ. К РНК-вирусам подсемейства Lentivirus относят вирусы иммунодефицита человека типов 1 и 2 (т.е. ВИЧ-1 или ВИЧ-2, при этом ВИЧ-1 раньше называли с лимфаденопатией вирусом 3 (HTLV-III) и вирусы, ассоциированные с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) (ARV)), или другие вирусы, близкие ВИЧ-1 или ВИЧ-2, которые были идентифицированы и ассоциированы со СПИДом или СПИД-подобным заболеванием. Кроме того, к РНК-вирусам подсемейства Lentivirus относят вирус Висны/Маэди (например, инфицирующий овец), вирус иммунодефицита кошек (FIV), бычий лентивирус, вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) и вирус артрита-энцефалита коз (CAEV).

Требования к вирусному вектору включают наличие промоторных элементов, размер генома, позволяющий упаковывать инородный генетический материал, и отсутствие вирулентных детерминант. Для уменьшения патогенности при производстве рекомбинантных вирусных векторов поступление структурных генов (кодирующих белки, образующие оболочку вируса, нуклеокапсид, и т.д.) обеспечивается in trans путем интеграции в геном упаковочных клеток, либо на плазмиде, вводимой в клетки совместно с вектором.

Репликация, интеграция и упаковка вирусных частиц требует наличия РНК (ДНК) областей, которые не кодируют белков. Большинство из таких цис-элементов необходимо включать в лентивирусный вектор (табл.1).

Таблица 1.
Цис-элементы вектора
Название элемента	Функция в векторе
LTR (long terminal repeat)	Содержит последовательности, необходимые для обратной транскрипции и интеграции
PBS (primer binding site)	Необходим для инициации синтеза минус цепи ДНК
Ψ	Необходим для упаковки векторной РНК
RRE (rev responsive element)	Взаимодействует с Rev белком, необходим для процессинга и транспорта РНК-вектора

PPT (polypurine tract)	Необходим для затравки синтеза плюс цепи
cPPT (central polypurine tract - flap)	Обеспечивает эффективную обратную транскрипцию и ядерный транспорт векторной ДНК

Структурные гены, которые поставляются in trans, включают три группы белков gag, pol и env (табл.2). Эти гены входят в состав нескольких отдельных упаковочных плазмид. Удаление таких генов из состава вектора не дает ему возможность самостоятельно реплицироваться и производить вирусные частицы, тем самым увеличивая безопасность применения таких векторов.

Таблица 2.
Транс-элементы вектора
Название элемента	Функция
gag/pol	Кодирует структурные белки капсида и нуклеокапсида и ферменты, необходимые для обратной транскрипции и интеграции.
env	Определяет связывание и вход в клетку вирусной частицы.
rev	Необходим для экспрессии несплайсированных и частично сплайсированных мРНК ВИЧ в клетке. Увеличивает титр вирусных частиц, содержащих вектор при упаковке в клеточной линии in vitro. Дает преимущество при наличии RRE элемента в векторе.

Векторы по настоящему изобретению также могут представлять собой самоинактивирующиеся лентивирусные векторы, которые придают конструкциям свойство самоинактивироваться и обеспечивают дополнительную безопасность при проведении терапии. При конструировании самоинактивирующихся векторов в 3'-LTR векторной ДНК (провирус) вносят делецию, затрагивающую энхансерно-промоторную область (она находится в U3-районе LTR), т.е. конструируют 3'LTR с делецией в области U3. После заражения клетки мишени из-за особенностей обратной транскрипции образуется провирус, у которого оба LTR лишены промоторно-энхансерной области. Таким образом, после интеграции в геном клетки-мишени самоинактивирующийся вектор не способен к репликации, поэтому вероятность возникновения репликационно-компетентного вируса (RCV) в культуре трансдуцированных клеток ничтожно мала. Кроме того исключается возможность инсерционного мутагенеза, так как отсутствие сильных энхансерно-промоторных участков на 3' конце вектора (которые находятся в делегированном участке LTR) предотвращает активацию собственных генов клетки, в том числе онкогенов.

Для получения векторных транскриптов в упаковочных клетках вместо вирусного промотора-энхансера в U5-pauone LTR используется RSV/5'-LTR гибридный промотор. Это позволяет не вводить дополнительно плазмиду, кодирующую вирусный белок tat, и делает систему еще более безопасной.

Согласно настоящему изобретению в предложенных генетических конструкциях могут быть использованы любые известные векторы с последовательностью, обеспечивающей встраивание ДНК последовательностей в геном клетки человека, с высоким титром, которые способны стабильно интегрировать в клетки-мишени (включая делящиеся и неделящиеся клетки) и которые не является патогенным и не вызывают иммунной реакции.

Доставка генов в заданные локусы генома с помощью эндонуклеаз

В настоящее время созданы искусственные эндонуклеазы, способные специфически распознавать и связываться с протяженными участками ДНК. Такие эндонуклеазы могут вносить разрыв в уникальный участок генома, что приводит к активации процессов репарации хромосомы, которые могут идти либо по пути негомологичного соединения концов ДНК, либо по пути гомологичной рекомбинации. Негомологичное соединение концов в большинстве случаев сопровождается делецией нуклеотидов или встраиванием дополнительных нуклеотидов, что приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению функции соответствующего гена. Гомологичная рекомбинация может иметь место, если в ядре присутствует донорская двухцепочечная ДНК, имеющая гомологию с последовательностями, находящимися в непосредственной близости от места разрыва. В результате происходит встраивание донорской последовательности в область разрыва. Таким образом, эндонуклеазы, вносящие разрыв в уникальный участок генома, могут быть использованы для внесения мутаций в определенные гены, исправлению мутаций в генах за счет гомологичной рекомбинации или доставки целевых генов в заданные области генома. Преимуществом такой доставки целевых генов является известная локализация встраиваемой последовательности, что очень важно для понимания дальнейшей регуляции целевого гена и позволяет избежать генотоксичности, вероятность которой существует при случайном встраивании ДНК последовательности в геном.

До недавнего времени использовали два класса нуклеаз - мегануклеазы и нуклеазы с цинковыми пальцами. Существенным ограничением для использования данного метода доставки являлась трудоемкость создания этих нуклеаз, вносящих разрыв в выбранный участок генома. Открытие белков, подобных транскрипционным активаторам (TALE), которые были выделены из бактерии Xanthomonas, легло в основу создания нового класса нуклеаз TALE-нуклеаз или TALEN. Такие нуклеазы имеют модульную структуру. Они состоят из повторяющихся доменов в 33-35 аминокислот, причем две аминокислоты в середине повтора являются вариабельными и определяют нуклеотид, с которым связывается домен. Последовательное соединение доменов, однозначно определяет ДНК последовательность, с которой связывается нуклеаза. Таким образом, использование описанных нуклеаз позволяет осуществлять доставку генетических конструкций в заданный участок генома.

Промоторы

Последовательности, кодирующие генетические антивирусные агенты, могут быть включены в векторную частицу под контролем соответствующих промоторов, известных для специалиста в данной области.

Термин "промотор" означает нуклеотидную последовательность, которая контролирует инициацию и скорость транскрипции полинуклеотида. Промотор содержит элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции, для инициации специфической транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты. Выражения «функционально расположенный», «функционально связанный», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» означают, что промотор находится в корректном функциональном расположении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии такой последовательности.

Промотор РНК-полимеразы II человека

Транскрипция всех кодирующих последовательностей эукариот находится под контролем промотора РНК-полимеразы II и приводит к образованию полностью зрелой мРНК, имеющей кэп на 5' конце и полиА на 3' конце последовательности мРНК. Промотор, в общем, содержит последовательность, которая определяет положение начала синтеза РНК. Лучшим известным примером такой последовательности является ТАТА-бокс, но в некоторых промоторах, лишенных ТАТА-бокса, таких как, например, промотор гена терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы млекопитающего и промотор поздних генов SV40, другой элемент, прилегающий к участку старта, способствует точному определению места инициации. Дополнительные промоторные элементы регулируют частоту инициации транскрипции. Обычно они локализованы в области на 30-110 н.п. выше участка старта, хотя некоторые промоторы, как было показано, содержат также функциональные элементы ниже участка старта. Для помещения кодирующей последовательности «под контроль промотора» располагают 5'-конец участка инициации транскрипции в транскрипционной рамке считывания «ниже» (т.е. в 3'-направлении) выбранного промотора.

Действие промотора может быть усилено «энхансером». Под энхансером подразумевают специфическую цис-действующую последовательность нуклеотидов, многократно усиливающую транскрипцию генов РНК-полимеразой II; например, энхансер вируса SV40 (размер - 72 пары нуклеотидов) может усиливать транскрипцию бета-глобинового гена в 200 раз, даже находясь на значительном удалении от него и в любой ориентации по отношению к промотору. Способность ряда энхансеров взаимодействовать со специфическими белками в дифференцированных клетках обеспечивает тканеспецифичный характер экспрессии соответствующих генов.

Естественно, важно использовать промотор и/или энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК в органелле, клеточном типе, ткани, органе или организме, выбранном для экспрессии. Специалистам в области молекулярной биологии, в основном, известно применение промоторов, энхансеров и комбинаций клеточных типов для экспрессии белка (см., например, Sambrook et al., 1989, включенный сюда в качестве ссылки). Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифичными, индуцируемыми и/или могут использоваться в условиях, подходящих для направления высокоуровневой экспрессии введенного сегмента ДНК. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным.

Конститутивные промоторы

К конститутивным промоторам, т.е. промоторам работающим во всех типах клеток не зависимо от условий, относятся промоторы генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes). К генам «домашнего хозяйства» относятся гены, обеспечивающие жизнедеятельность эукариотической клетки и функционирующие повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п. Неограничивающими примерами таких промоторов являются промотор гена фактора элонгации EF1α, гена фосфоглицераткипазы (PGK), гена β-актина, убиквитиновый промотор UbC, гистоновый промотор Н2 В (ТН2 В) и др.

Многие вирусные промоторы выполняют конститутивную функцию в эукариотических клетках. Эти промоторы включают:

- ранние и поздние промоторы SV40 (см. Bemoist and Chambon, Nature, 290:304 (1981));

- длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молонея и других ретровирусов (см. R.Weisset et al., eds., Molecular Biology of Tumor Viruses, 2^nd ed., RNA Tumor Viruses. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1985);

- промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) (см. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, vol.78, p.1441);

- самый ранний промотор цитомегаловируса (IE1) (см. Karasuyama et al., J. Ехр. Med., 1989, vol. 169 р.13;

- промотор вируса саркомы Рауса (RSV) (см. Yamamoto et al., Cell, 1980, vol.22, P.787);

- главный поздний промотор аденовируса (см. Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol.82, p.3567) и многие другие.

Поэтому любые вышеуказанные конститутивные промоторы можно использовать для контроля транскрипции генной вставки.

Тканеспецифичиые промоторы

Тканеспецифичными называются промоторы, которые инициируют транскрипцию гена только в клетках определенной ткани. Тканеспецифический характер экспрессии генов обеспечивается различными механизмами взаимодействия белковых факторов транскрипции с регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот. Отличительные черты тканеспецифических промоторов или элементов, а также анализы для характеристики их активности хорошо известны специалистам в данной области. Неограничивающие примеры генов под контролем таких промоторов охватывают человеческий ген LIMK2 (Nomoto et al., 1999), ген соматостатинового рецептора 2 (Kraus et al., 1998), ген связывающего ретиноевую кислоту белка придатков яичка мыши (Lareyre et al., 1999), человеческий CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), мышиный альфа-2-(XI)-коллаген (Tsumaki, et al., 1998), ген дофаминового рецептора D1A (Lee, et al., 1997), инсулиноподобный фактор роста II (Wu et al., 1997) и молекулу-1 адгезии тромбоцитов-эндотелиальных клеток человека (Almendro et al., 1996).

Ниже перечислены неограничивающие примеры тканеспецифичных элементов/промоторов РНК-полимеразы II, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения для регуляции экспрессии РНК: промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, гена Т-клеточного рецептора, гена β-интерферона, гена IL2. гена рецептора IL2, генов МНС класса II, гена а-фетопротеина, гена γ-глобина, гена β-глобина, генов кодирующих α- и β-субъединицы гемоглобина человека, гена альбумина, гена коллагеназы, гена металлотионеина (MTII), гена эластазы I, гена c-HA-ras, гена инсулина, и др.

Регулируемые промоторы

Регулируемые или индуцибельные промоторы позволяют включать и/или выключать транскрипцию гена. Активность таких промоторов зависит от введения дополнительных факторов, в норме отсутствующих в экспрессирующих клетках. Существует несколько систем обратимого регулирования экспрессии, которые позволяют включать и выключать работу гена. Наиболее используемой и изученной является тетрациклин зависимая система переключения, которая состоит из трех основных частей: молекулы тетрациклина Tet или его аналога, молекулы белка тетрациклинового репрессора TetR или активатора tTA и участка промотора (т.н. тетрациклинового оператора tetO) связывающего репрессор или активатор. Существуют два варианта: а) в системе Tet-On используется репрессор TetR, связывающийся с оператором и блокирующий транскрипцию; добавление тетрациклина приводит к удалению репрессора и включение экспрессии гена б) в системе Tet-OFF, используется активатор tTA, способствующий экспрессии в отсутствие тетрациклина и выключающий работу гена при добавлении тетрациклина. Аналог тетрациклина доксициклин лучше проникает через клеточную мембрану и обладает большим сродством с репрессором и активатором, поэтому чаще используется в качестве переключателя. Другими примерами регулируемых промоторов могут служить LacZ регулируемая система или экдизон регулируемая система. Единственным примером необратимой индукции (или репрессии) является система, базирующаяся на Cre-Lox рекомбинации бактериофага Р1. Использование Cre-Lox рекомбинации позволяет необратимо включить или выключить экспрессию интересующей последовательности в генной конструкции после введения ее в клетку.

Промоторы полимеразы III человека

Для экспрессии коротких РНК-последовательностей (в нашем случае рибозим, TAR, shRNA) удобно использовать промоторы для РНК-полимеразы III. Промоторы для РНК-полимеразы III делятся на три типа, основываясь на композиции промоторных элементов и их положения относительно старта транскрипции (PAULE MR, WHITE RJ. Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids Res 2000; 28(6): 1283-98). Промоторы 3-го типа для РНК-полимеразы III наиболее подходят для транскрипции коротких РНК-последовательностей, поскольку в природе они используются клеткой для наработки малых ядерных РНК-молекул. В отличие от промоторов 1-го и 2-го типа, промоторы третьего типа полностью расположены выше транскрипционного старта и содержат 3 специфических промоторных элемента, необходимые для их функционирования: 1. ТАТА-последовательность в позиции -20 п.о., 2. PSE последовательность проксимального элемента в позиции -50 п.н., 3. DSE последовательность дистального элемента в позиции -240 п.н. (где +1 - первый транскрибируемый нуклеотид). Оба элемента DSE и PSE содержат энхансер и последовательность связывающую транскрипционный фактор, которые абсолютно необходимы и делеция которых полностью элиминирует транскрипцию. Расстояние между этими элементами строго определено и критично для достижения максимальной скорости транскрипции. Характерной особенностью данных промоторов является четко определенный сайт инициации транскрипции и простой сигнал терминации состоящий из 4-х