Новая лизофосфолипид-ацилтрансфераза

Новая лизофосфолипид-ацилтрансфераза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым лизофосфолипид-ацилтрансферазам.

Уровень техники

Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот

Жирные кислоты являются главными компонентами липидов, таких как фосфолипиды и триацилглицерины. Жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенных связей, обобщенно называются полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA), и они, как известно, включают арахидоновую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту и т.д. Сообщается о различных физиологических активностях этих жирных кислот (непатентный документ 1).

Предполагается, что такие полиненасыщенные жирные кислоты найдут применение в различных областях, но некоторые из них не могут быть синтезированы in vivo у животных. Это привело к развитию способов получения полиненасыщенных жирных кислот культивированием различных микроорганизмов. Также были предприняты попытки производства полиненасыщенных жирных кислот в растениях. Известно, что в подобных случаях полиненасыщенные жирные кислоты накапливаются в качестве компонентов запасных липидов, таких как триацилглицерины, например, в микробных клетках или семенах растений.

Среди полиненасыщенных жирных кислот привлекла внимание арахидоновая кислота в качестве промежуточного метаболита в синтезе простагландинов, лейкотриенов и подобного, и было предпринято множество попыток для ее использования в качестве вещества для функциональных продуктов питания и медикаментов. Кроме того, арахидоновая кислота содержится в грудном молоке, таким образом, она важна для роста младенцев, особенно для развития длины плода и мозга, и, таким образом, она также привлекает внимание с точки зрения питания как необходимый компонент для роста младенцев, наряду с DHA (докозагексаеновая кислота).

Арахидоновая кислота биосинтезируется по пути, показанном на фиг.1. В частности, арахидоновая кислота продуцируется через несколько стадий элонгации цепи и десатурации из пальмитиновой кислоты, генерированной синтезом жирных кислот de novo. В этом пути элонгаза и Δ9 десатураза воздействуют на ацил-CoA. С другой стороны известно, что Δ12 десатураза, Δ6 десатураза и Δ5 десатураза воздействуют на ацильные группы фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин (непатентный документ 2). Таким образом, требуется ацильный перенос между ацил-CoA и фосфолипидами в биосинтезе PUFA, таких как арахидоновая кислота. Не ограничиваясь биосинтезом PUFA, замена только жирных кислот после биосинтеза фосфолипидов известна как “ремоделирование” фосфолипидов, и лизофосфолипид-ацилтрансферазы (здесь и далее в данном описании называемые “LPLAT”) известны, как принимающие участие в этой реакции (непатентный документ 3).

Биосинтез триацилглицеринов

Среди запасных липидов триацилглицерины синтезируются in vivo следующим образом. Глицерин-3-фосфат ацилируется глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазой (здесь и далее в данном описании иногда называемой “GPAT”) по гидроксильной группе в положении 1 (α-положение) с образованием лизофосфатидной кислоты (здесь и далее в данном описании иногда называемой “LPA”). LPA представляет собой лизофосфолипид, содержащий только одну ацильную группу, и он ацилируется ацилтрансферазой лизофосфатидной кислоты (здесь и далее в данном описании иногда называемой “LPAAT”) с образованием фосфатидной кислоты (здесь и далее в данном описании иногда называемой “PA”). PA дефосфорилируется фосфатазой фосфатидной кислоты с образованием диацилглицерина, который, в свою очередь, ацилируется диацилглицерин-ацилтрансферазой (здесь и далее в данном описании иногда называемой “DGAT”) с образованием триацилглицерина. Известно, что ацил-CoA: холестерин-ацилтрансфераза (здесь и далее в данном описании иногда называемая “ACAT”) и лизофосфатидилхолин-ацилтрансфераза (здесь и далее в данном описании иногда называемая “LPCAT”) и подобные опосредованно вовлечены в биосинтез триацилглицеринов.

Биосинтез фосфолипидов

PA, продуцированные из LPA, путем воздействия LPAAT, как описано выше, служат в качестве предшественника в биосинтезе различных фосфолипидов. Например, важные фосфолипиды, такие как фосфатидилэтаноламин (PE), фосфатидилхолин (PC), фосфатидилсерин (PS), фосфатидилинозитол (PI) и фосфатидилглицерин (PG) биосинтезируются из PA. Таким образом, PA является не только промежуточным продуктом в липидном синтезе, но также является внутриклеточным и межклеточным липидным медиатором, обладающим очень широким диапазоном биологических и фармакологических эффектов, таких как клеточная пролиферация, агрегация тромбоцитов, сокращение гладкой мускулатуры, повышение раковой инвазии и т.д.

Лизофосфолипид-ацилтрансферазы

Как описано выше, предполагается, что LPLAT вовлечены в биосинтез PUFA. LPLAT, совместно называемые ферментами, обладающими активностью введения ацильной группы в лизофосфолипиды, и включают ферменты, имеющие различные названия, основанные на специфичности к субстрату, т.е. молекулярным видам лизофосфолипидов, используемым в качестве субстрата. Одним из примеров являются LPAAT, которые принимают участие в синтезе триацилглицеринов и фосфолипидов при использовании LPA в качестве субстрата. Другие лизофосфолипиды, на которые воздействуют LPLAT, включают лизофосфатидилхолин (LPC), лизофосфатидилсерин (LPS), лизофосфатидилэтаноламин (LPE), лизофосфатидилинозитол (LPI) и т.д. Таким образом, ферментами называют LPAAT, LPCAT, лизофосфатидилсерин-ацилтрансферазу (LPSAT), лизофосфатидилинозитол-ацилтрансферазу (LPIAT) и подобные, на основании молекулярных видов, на которые они воздействуют. Каждый фермент может специфично воздействовать на один лизофосфолипид или конкретные сложные лизофосфолипиды. Например, LPLAT, называемые LPAAT, включают такие, которые воздействуют не только на LPA, но также на LPC, LPE и т.д.

Основанная на профиле последовательностей классификация лизофосфолипид-ацилтрансфераз

LPLAT классифицируются как глицерофосфолипид-ацилтрансферазы. Глицерофосфолипид-ацилтрансферазы делятся на три группы, исходя из сравнения аминокислотных последовательностей, т.е. семейство LPAAT, семейство MBOAT (мембранно-связанная O-ацилтрансфераза) и семейство DGAT2 (непатентный документ 5). Ферменты, принадлежащие к семейству LPAAT, обычно характеризуются мембранно-связанным доменом и последовательно сохраненным мотивом (LPAAT мотив). Ферменты, принадлежащие к членам семейства LPAAT, включают LPAAT, GPAT и т.д. Ферменты, включенные в семейство MBOAT, обычно характеризуются мембранно-связанным доменом. Известно, что семейство MBOAT включает DGAT, ACAT и подобное в дополнение к LPLAT. Полагают, что некоторые ферменты у животных или подобных, принадлежащие к семейству MBOAT, являются ответственными за реакцию ремоделирования, ответственную за синтез мембранных фосфолипидов.

Сообщается о LPLAT у широкого спектра организмов от одноклеточных организмов, таких как бактерии и дрожжи, до более высокоорганизованных организмов, таких как млекопитающие. В дрожжах (Saccharomyces cerevisiae), принадлежащих к грибам, SLC1 (YDL052C) и SLC4 (YOR175C) (в данном описании иногда называемые “ALE1” или “LPT1”), известны как гены мембранно-связанных LPLAT (непатентный документ 5). Известно, что у животных существуют составные гомологи LPLAT, включая ответственные за реакцию воздействия на LPA в системе триглицеридного синтеза de novo PA и ответственные за фосфолипидное ремоделирование (непатентный документ 6).

В липид-продуцирующем грибе Mortierell alpin (здесь и далее в данном описании иногда называемая “M. alpina”), были получены четыре LPLAT, при этом все они принадлежат к семейству LPAAT (патентные документы 1-3). Тем не менее, нет сведений о том, что какие-либо LPLAT, принадлежащие к семейству MBOAT, были получены из M. alpina.

Список цитированной литературы

Патентные документы

Патентный документ 1: Международная публикация № WO2004/087902

Патентный документ 2: Опубликованная патентная заявка США № US2006/0094090

Патентный документ 3: Международная публикация № WO2008/146745

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Lipids, 39, 1147 (2004)

Непатентный документ 2: J.B.C., 278(37), 35115-35126, (2003)

Непатентный документ 3: J.B.C., 276(29), 26745-26752, (2001)

Непатентный документ 4: Proc. Natl. Acad. Sci., 105(8), 2830-2835, (2008)

Непатентный документ 5: J.B.C., 282(42), 30845-30855, (2007)

Непатентный документ 6: J.B.C., 284(1), 1-5, (2009)

Непатентный документ 7: Trends Biochem. Sci., 25, 111-112, (2000)

Непатентный документ 8: Journal of lipid research 2009 R80035 JLR200v1

Сущность изобретения

Технические задачи

Как описано выше, фосфолипидное ремоделирование незаменимо в биосинтезе PUFA, таких как арахидоновая кислота, и LPLAT могут быть вовлечены в эту реакцию. Однако до настоящего времени было известно, что гомологи LPAAT обладают недостатком, в котором количественное соотношение PUFA в общем количестве жирных кислот не может быть достаточно высоким, даже если они были перенесены и экспрессированы в организме-хозяине. Следовательно, необходимо идентифицировать новую нуклеиновую кислоту и белок, которые могут достаточно увеличить количественное соотношение PUFA в общем количестве жирных кислот в хозяине при переносе и экспрессии хозяину. Так же существует необходимость идентифицировать нуклеиновую кислоту и белок, способные продуцировать жиры с высоким содержанием полезных в промышленном отношении жирных кислот, и разработать способ, посредством которого полезные жирные кислоты могут быть произведены или содержание полезных жирных кислот может быть повышено посредством их использования.

Решение задач

Задачей настоящего изобретения является обеспечение белков и нуклеиновых кислот, способных продуцировать полезные жиры посредством их экспрессии в клетке-хозяине для влияния на липидный метаболизм хозяина или для повышения содержания требуемых жирных кислот.

Биосинтез PUFA, таких как арахидоновая кислота, фосфолипидное ремоделирование является необходимым. Липид-продуцирующий гриб M. alpina может накапливать большое количество полезных PUFA, таких как арахидоновая кислота, однако не была получена какая-либо ацилтрансфераза из M. Alpina, принадлежащая к семейству MBOAT, вовлеченному в ремоделирование липидов у животных или тому подобное. Авторы обнаружили это и тщательно исследовали для достижения указанной выше задачи, в результате, авторы получили кДНК, кодирующую фермент, принадлежащий к семейству MBOAT из M. alpina. Дополнительно, авторы предприняли попытку продукции композиции жирной кислоты трансформированием полученной в результате кДНК в высоко пролиферативную клетку-хозяина, такую как дрожжи, для обнаружения того, что клетка-хозяин может продуцировать различные композиции жирных кислот, особенно композицию жирной кислоты, обладающую высоким содержанием арахидоновой кислоты, по сравнению с композицией жирной кислоты, продуцированной хозяевами, трансформированными векторами, содержащими нуклеиновые кислоты, кодирующие известные LPAAT, полученные из M. alpina. Таким образом, авторам удалось клонировать гены новых LPLAT, отличных от известных LPAAT, и завершить настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает следующие аспекты.

(1) Нуклеиновую кислоту по любому из нижеследующих пунктов (a)-(e):

(a) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы;

(b) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы;

(c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, обладающую 80% или более идентичностью с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и кодирующую белок, обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы;

(d) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 80% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы; и

(e) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы.

(2) Нуклеиновую кислоту по пункту (1), которая соответствует любому из нижеследующих пунктов (a)-(e):

(a) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из варианта аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, где аминокислоты 1-50 удалены, замещены или добавлены, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы;

(b) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы;

(c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, обладающую 90% или более идентичностью с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и кодирующую белок, обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы;

(d) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 90% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы; и

(e) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы.

(3) Нуклеиновую кислоту по любому из нижеследующих пунктов (a)-(e):

(a) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором;

(b) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором;

(c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, обладающую 80% или более идентичностью с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и кодирующая белок, обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором;

(d) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 80% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором; и

(e) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором.

(4) Нуклеиновую кислоту по пункту (3), которая соответствует любому из нижеследующих пунктов (a)-(e):

(a) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением аминокислот 1-50 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором;

(b) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором;

(c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, обладающую 90% или более идентичностью с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и кодирующую белок, обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором;

(d) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 90% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором; и

(e) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором.

(5) Нуклеиновую кислоту по любому из пунктов (1)-(4), где кодируемый белок принадлежит семейству мембранно-связанных O-ацилтрансфераз.

(6) Нуклеиновую кислоту по любому из нижеследующих пунктов (a)-(d):

(a) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 или 6, или ее частичную последовательность;

(b) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, или ее частичную последовательность;

(c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4 или 9, или ее частичную последовательность; и

(d) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5 или 10, или ее частичную последовательность.

(7) Белок по любому из нижеследующих пунктов (a) или (b):

(a) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в варианте аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 80% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы.

(8) Белок по пункту (7), который соответствует нижеследующему пункту (a) или (b) ниже:

(a) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением аминокислот 1-50 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 90% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью лизофосфолипид-ацилтрансферазы.

(9) Белок по нижеследующему пункту (a) или (b):

(a) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 80% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором.

(10) Белок по пункту (9), который соответствует нижеследующему пункту (a) или (b):

(a) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением аминокислот 1-50 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 90% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и обладающий активностью увеличения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором.

(11) Белок по любому из пунктов (7)-(10), который принадлежит семейству мембранно-связанных O-ацилтрансфераз.

(12) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7.

(13) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пунктов (1)-(6).

(14) Клетку, трансформированную рекомбинантным вектором по пункту (13).

(15) Композицию жирных кислот, полученную культивированием трансформированной клетки по пункту (14), где количественное соотношение арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в указанной композиции жирных кислот выше, чем количественное соотношение арахидоновой кислоты в композиции жирных кислот, полученной культивированием нетрансформированного хозяина.

(16) Способ получения композиции жирных кислот, включающий сбор композиции жирных кислот по пункту (15) из культур трансформированной клетки по пункту (14).

(17) Пищевой продукт, содержащий композицию жирной кислоты по пункту (15).

(18) Способ применения рекомбинантного вектора по пункту (13) для повышения количественного соотношения арахидоновой кислоты в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, трансформированном вектором, по сравнению с количественным соотношением в композиционном соотношении жирных кислот в хозяине, который не был трансформирован вектором.

(19) Нуклеиновую кислоту по любому из нижеследующих пунктов (a)-(e):

(a) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и участвующая в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL;

(b) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, участвующий в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL;

(c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, обладающую 80% или более идентичностью с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1 или 6, и кодирующая белок, участвующий в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL;

(d) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 80% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и участвующий в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL; и

(e) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или 7, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, участвующий в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL.

(20) Белок по нижеследующему пункту (a) или (b) ниже:

(a) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или 7, и участвующий в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL; или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью 80% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2 или 7, и участвующий в преобразовании из 18:3(n-6)-PL в 18:3(n-6)-CoA и/или преобразовании из DGLA-CoA в DGLA-PL.

Преимущественные эффекты изобретения

LPLAT настоящего изобретения позволяют усовершенствование возможности производства жирных кислот, таких как арахидоновая кислота и/или запасные липиды, и, следовательно, предпочтительны в качестве средств для улучшения производительности полиненасыщенных жирных кислот в микроорганизмах и растениях. Таким образом, они могут обеспечить липиды, обладающие требуемыми характеристиками или свойствами, так что они могут быть эффективно применены для использования в пищевых продуктах, косметических средствах, лекарственных препаратах, мылах и т.д.

Краткое описание фигур

Фиг.1 является схематической диаграммой, демонстрирующей биосинтетический путь арахидоновой кислоты. Аббревиатуры на фиг.1 имеют следующие значения: PL - фосфолипид; CoA - кофермент A; DS - десатураза (фермент десатураза жирных кислот); GLELO - элонгаза жирных кислот; 18:0 - стеарильная группа; 18:1 - олеоильная группа; 18:2 - лильноильная группа; 18:3(n-6) - γ- лильнолеильная группа; DGLA - дигомо-γ-лильнолеильная группа; ARA - арахидоильная группа.

Фиг.2 демонстрирует полную длину последовательности кДНК (SEQ ID NO:4) LPLAT5 из M. alpina штамма 1S-4 и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2), полученную из нее.

Фиг.3 демонстрирует полную длину последовательности кДНК (SEQ ID NO:9) LPLAT6 из M. alpina штамма 1S-4 и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:7), полученную из нее.

На фиг.4 продемонстрировано сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO:5) и ORF последовательностью. (SEQ ID NO:1) LPLAT5 из M. alpina штамма 1S-4.

Фиг.4B демонстрирует сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO:5) и ORF последовательностью (SEQ ID NO:1) LPLAT5 из M. alpina штамма 1S-4.

Фиг.4C демонстрирует сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO:5) и ORF последовательностью (SEQ ID NO:1) LPLAT5 из M. alpina штамма 1S-4.

Фиг.5 демонстрирует сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO:10) и ORF последовательностью (SEQ ID NO:6) LPLAT6 из M. alpina штамма 1S-4.

Фиг.5B демонстрирует сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO:10) и ORF последовательностью (SEQ ID NO:6) LPLAT6 из M. alpina штамма 1S-4.

Фиг.5C демонстрирует сравнение между геномной последовательностью (SEQ ID NO:10) и ORF последовательностью (SEQ ID NO:6) LPLAT6 из M. alpina штамма 1S-4.

Фиг.6 является графиком, демонстрирующим состав композиции полиненасыщенных жирных кислоты в клетках при подавлении экспрессии LPLAT6 или Δ5 десатуразы жирных кислот в M. alpina. На фиг.6, аббревиатуры имеют следующие значения: GLA - γ-линоленовая кислота; DGLA - дигомо-γ-линоленовая кислота; ARA - арахидоновая кислота.

Фиг.7 является графиком, демонстрирующим состав композиции полиненасыщенных жирных кислот в триацилглицериновой фракции, когда подавлена экспрессия LPLAT6 или Δ5 десатуразы жирных кислот M. alpina. На фиг.7, аббревиатуры имеют следующие значения: GLA - γ-линоленовая кислота; DGLA - дигомо-γ-линоленовая кислота; ARA - арахидоновая кислота.

Фиг.8 является графиком, демонстрирующим состав композиции полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидной фракции, когда подавлена экспрессия LPLAT6 или Δ5 десатуразы жирных кислот в M. alpina. На фиг.8, аббревиатуры имеют следующие значения: GLA - γ-линоленовая кислота; DGLA - дигомо-γ-линоленовая кислота; ARA - арахидоновая кислота.

Описание вариантов осуществления

Настоящее изобретение относится к новым лизофосфолипид-ацилтрансферазам (“LPLAT”) рода Mortierell, характеризующихся переносом ацильной группы между ацил-CoA и фосфолипидами в биосинтетическом продуцировании арахидоновой кислоты. Белки настоящего изобретения могут воздействовать на лизофосфолипиды. Донором ацильной группы, как правило, является, ацил-CoA, но не ограничивается этим.

Варианты осуществления настоящего изобретения более конкретно описаны ниже.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие лизофосфолипид-ацилтрансферазы настоящего изобретения

Лизофосфолипид-ацилтрансферазы (LPLAT), кодируемые нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения, в качестве конкретных примеров включают LPLAT 5 и 6. В отличие от композиции жирных кислот, продуцируемых хозяевами, экспрессирующими известные LPAAT из M. alpina, LPLAT5 и 6 могут продуцировать композиции жирных кислот, характеризующиеся высоким количественным соотношением арахидоновой кислоты, как пояснено в приведенных ниже примерах. Следовательно, LPLAT настоящего изобретения преимущественно продуцируют арахидоновую кислоту с очень высокой эффективностью по сравнению с известными LPAAT из M. alpina.

Взаимосвязь кДНК, CDS, ORF нуклеиновых кислот, кодирующих LPLAT5 и LPLAT6 настоящего изобретения, и аминокислотных последовательностей объединена в приведенной ниже таблице 1.

Таблица 1
	LPLAT5	LPLAT6
	SEQ ID NO:	Соответствующая область в SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:	Соответствующая область в SEQ ID NO:9
ORF	SEQ ID NO:1	161-1690	SEQ ID NO:6	38-1756
Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO:2	*****	SEQ ID NO:7	*****
CDS	SEQ ID NO:3	161-1693	SEQ ID NO:8	38-1759
кДНК	SEQ ID NO:4	*****	SEQ ID NO:9	*****

Таким образом, последовательности, относящиеся к LPLAT5 настоящего изобретения, включают SEQ ID NO:1, представляющую последовательность ORF области LPLAT5; SEQ ID NO:2, представляющую аминокислотную последовательность LPLAT5; SEQ ID NO:3, представляющую последовательность CDS области LPLAT5; SEQ ID NO:4, представляющую нуклеотидную последовательность кДНК; и SEQ ID NO:5, представляющую геномную последовательность. Более конкретно, нуклеотиды 161-1693 SEQ ID NO:4, представляющие последовательность кДНК LPLAT5, соответствуют CDS (SEQ ID NO:3), и нуклеотиды 161-1690 соответствуют ORF (SEQ ID NO:1). Последовательность кДНК LPLAT5 и полученная из нее аминокислотная последовательность показаны на фиг.2. Геномная последовательность (SEQ ID NO:5) LPLAT5 содержит две интронных и экзонную области, соответствующие нуклеотидам 1-314, 461-587 и 668-1759 SEQ ID NO:5.

Подобным образом, последовательности, относящиеся к LPLAT6 настоящего изобретения, включают SEQ ID NO:6, представляющую последовательность ORF области LPLAT6; SEQ ID NO:7, представляющую аминокислотную последовательность LPLAT6; SEQ ID NO:8, представляющую последовательность CDS области LPLAT6; SEQ ID NO:9, представляющую нуклеотидную последовательность кДНК; и SEQ ID NO:10, представляющую геномную последовательность. Более конкретно, нуклеотиды 38-1759 SEQ ID NO:9, представляющие последовательность кДНК LPLAT6, соответствуют CDS (SEQ ID NO:8), и нуклеотиды 38-1756 соответствуют ORF (SEQ ID NO:6). Последовательность кДНК LPLAT6 и полученная из нее аминокислотная последовательность приведены на фиг.3. Геномная последовательность (SEQ ID NO:10) LPLAT6 содержит одну интронную и экзонную области, соответствующие нуклеотидам 1-1095 и 1318-1944 SEQ ID NO:10.

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают одноцепочечные и двухцепочечные ДНК, а также их комплементы Р