Новые гены атф:цитратлиазы

Новые гены атф:цитратлиазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к новым генам для АТФ:цитратлиазы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Жирные кислоты являются важными компонентами липидов, таких как фосфолипиды и триацилглицерины. Жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенных связей, совокупно называют полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA) и известно, что они включают арахидоновую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. Различные физиологические активности сообщались для этих жирных кислот (непатентный документ 1). Ожидается, что эти полиненасыщенные жирные кислоты применяются в различных областях, но некоторые из них не могут синтезироваться в организме животного. Таким образом, были разработаны микробные способы для получения полиненасыщенных жирных кислот культивированием различных микроорганизмов. Были предприняты другие попытки получения полиненасыщенных жирных кислот в растениях. Известно, что в этих случаях полиненасыщенные жирные кислоты накапливаются, например, в виде компонентов липидов, таких как триацилглицерины, в клетках микроорганизмов или семенах растений.

Синтез таких новых жирных кислот у животных, в растениях и микроорганизмах опосредуется синтетазой жирных кислот с использованием в качестве исходных веществ ацетил-CoA и малонил-CoA, который генерируется из ацетил-CoA под действием ацетил-CoA-карбоксилазы (ACC). Известно, что эти реакции имеют место в цитоплазме животных или микроорганизмов и в хлоропластах растений.

Ацетил-CoA, который служит в качестве материала-источника этих жирных кислот и холестерина, синтезируемых de novo в цитоплазме, восполняется из цитрата под действием АТФ:цитратлиазы (E.C. 2.3.3.8 далее называемой в описании также ACL).

ACL является ферментом, катализирующим следующую реакцию.

Формула 1

Цитрат + АТФ + CoA ⇆ ацетил-CoA + оксалоацетат + АДФ + Pi

Этот фермент широко распространен в эукариотических организмах, включая животных, растения и грибы, и его внутриклеточная локализация обнаружена в цитоплазме (непатентный документ 2). О генах ACL сообщалось до сих пор в нескольких организмах. Например, что касается генов ACL животных, были клонированы эти гены, полученные из Homo sapiens и Rattus norvegicus (непатентный документ 3, непатентный документ 4). Что касается генов ACL растений, были клонированы ACLA-1, -2, -3 и ACLB-1, -2, полученные из Arabidopsis (экотипа Columbia) (непатентный документ 5). В случае мицелиальных грибов были клонированы гены ACLA и ACLB, полученные из Sordaria macrospora (непатентный документ 6).

Что касается Mortierella alpina (далее в описании называемой также “M. alpina”), которая является липидпродуцирующим грибом, сообщалось, что цитоплазматическая фракция имеет АТФ:цитратлиазную активность (непатентный документ 7).

До сих пор эти известные гены ACL использовали в попытке увеличения содержания общих жирных кислот в хозяевах, например, высокой экспрессией полученного из Sordaria macrospore гена ACL вместе с синтетазой жирных кислот (FAS) в клетках дрожжей (патентный документ 1) или высокой экспрессией полученного из Rattus norvegicus гена ACL в растениях (непатентный документ 8).

Патентный документ 1: публикация патента США № 2006/0051847

Непатентный документ 1: Lipids., 39, pp. 1147 (2004)

Непатентный документ 2: Adv Appl Microbiol., 51, pp. 1-51 (2002)

Непатентный документ 3: Eur J Bio Chem., 204, pp. 491-499 (1992)

Непатентный документ 4: J Bio chem., 265, pp. 1430-1435 (1990)

Непатентный документ 5: Plant Physiology., 130, pp. 740-756 (2002)

Непатентный документ 6: Curr. genet., 37, pp. 189-93 (2000)

Непатентный документ 7: Microbiology., 146, pp. 2325-2331 (2000)

Непатентный документ 8: Plant Physiology., 122, pp. 1231-1238 (2000)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ ЭТИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Однако гены ACL, о которых сообщалось ранее, не являются достаточными, например, потому, что невозможно проверить, оказывают ли сами эти гены действие при введении в клетки-хозяева или при экспрессии в клетках-хозяевах, или потому что ограничен диапазон хозяев, доступных для использования при экспрессии таких генов. По этой причине имеется потребность идентификации нового гена, который отличается от известных до сих пор генов и позволяет увеличивать содержание общих жирных кислот или липидов в хозяевах.

СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЭТИХ ПРОБЛЕМ

Целью данного изобретения является обеспечение белка или нуклеиновой кислоты, которые позволяют увеличивать содержание жирных кислот или липидов, экспрессируемых в клетках-хозяевах или вводимых в клетки-хозяева.

Для достижения вышеуказанной цели авторы данного изобретения приложили экстенсивные и интенсивные усилия. Сначала выполняли анализ EST на липидпродуцирующем грибе, Mortierella alpina, для экстракции последовательностей, имеющих высокую идентичность с известными генами ACL. Для получения полной открытой рамки считывания (ORF), кодирующей ACL, гены дополнительно клонировали скринингом кДНК-библиотеки или при помощи ПЦР. Эти гены экспрессировали в Saccharomyces cerevisiae, не имеющем гена ACL, с последующим измерением активности ACL для подтверждения ACL-активности вышеуказанных генов.

Кроме того, в результате попытки введения и высокой экспрессии этих генов в клетках-хозяевах (например, липидпродуцирующем грибе Mortierella alpina) для достижения посредством этого продуцирования высокого уровня общих жирных кислот, авторы данного изобретения сумели клонировать новый ген, родственный ACL, который позволяет увеличивать содержание общих жирных кислот по сравнению с хозяевами, экспрессирующими обычный уровень ACL. Это привело к завершению данного изобретения. А именно, данное изобретение представляет собой следующее:

(1) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в любом из подпунктов (а)-(е) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и имеющий АТФ:цитратлиазную активность;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и которая кодирует белок, имеющий АТФ:цитратлиазную активность;

(c) нуклеотидную последовательность, которая состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей идентичность 70% или более с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, которая кодирует белок, имеющий АТФ:цитратлиазную активность;

(d) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 70% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и которая кодирует белок, имеющий АТФ:цитратлиазную активность; или

(e) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12, и которая кодирует белок, имеющий АТФ:цитратлиазную активность.

(2) Нуклеиновая кислота по пункту (1) выше, которая содержит нуклеотидную последовательность, показанную в любом из подпунктов (а)-(с) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-10 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и имеющий АТФ:цитратлиазную активность;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в строгих условиях 2 × SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и которая кодирует белок, имеющий АТФ:цитратлиазную активность; или

(c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую идентичность 90% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и которая кодирует белок, имеющий АТФ:цитратлиазную активность.

(3) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в любом из подпунктов (а)-(с) ниже, или ее фрагмент:

(a) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; или

(c) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6.

(4) Белок, показанный в подпунктах (a) или (b) ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12 и который имеет АТФ:цитратлиазную активность; или

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность 70% или более с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и который имеет АТФ:цитратлиазную активность.

(5) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12.

(6) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, по любому из пунктов (1)-(3) выше.

(7) Трансформант, несущий нуклеиновую кислоту по любому из пунктов (1)-(3) выше.

(8) Трансформант, трансформированный рекомбинантным вектором по пункту (6) выше.

(9) Трансформант по пункту (8) выше, способность которого продуцировать жирные кислоты, улучшается введением вектора по пункту (6) выше.

(10) Трансформант по любому из пунктов (7)-(9) выше, где этот трансформант является липидпродуцирующим грибом.

(11) Трансформант по пункту (10) выше, где этим липидпродуцирующим грибом является Mortierella alpina.

(12) Способ получения жирной кислоты или липида, который предусматривает сбор жирной кислоты или липида из культивируемого продукта, полученного культивированием трансформанта по любому из пунктов (7)-(11) выше.

(13) Жирная кислота или липид, получаемые с использованием способа по пункту (12) выше.

(14) Пищевой продукт, содержащий жирную кислоту или липид по пункту (13) выше.

ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

ACL данного изобретения позволяет улучшать способность продуцирования жирных кислот и/или липидов и, следовательно, является предпочтительной в качестве средства для улучшения продуктивности полиненасыщенных жирных кислот в микроорганизмах и растениях. В результате ACL данного изобретения делает возможным обеспечение полезных липидов при меньшей стоимости, чем в общепринятых случаях, и является полезной в качестве применимого компонента в пищевых продуктах, косметике, фармацевтических веществах, мылах и т.д.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1-1. На фигуре 1 показана кДНК-последовательность MaACL1, согласно данному изобретению, вместе с ее расшифрованной аминокислотной последовательностью.

Фигура 1-2. На фигуре 1 показана кДНК-последовательность MaACL1, согласно данному изобретению, вместе с ее расшифрованной аминокислотной последовательностью.

Фигура 2-1. На фигуре 2 показана кДНК-последовательность MaACL2, согласно данному изобретению, вместе с ее расшифрованной аминокислотной последовательностью.

Фигура 2-2. На фигуре 2 показана кДНК-последовательность MaACL2, согласно данному изобретению, вместе с ее расшифрованной аминокислотной последовательностью.

Фигура 3-1. На фигуре 3 показано сравнение ДНК-последовательностей между CDS-областями MaACL1 и MaACL2.

Фигура 3-2. На фигуре 3 показано сравнение ДНК-последовательностей между CDS-областями MaACL1 и MaACL2.

Фигура 4. На фигуре 4 показано сравнение расшифрованных аминокислотных последовательностей между MaACL1 и MaACL2.

Фигура 5-1. На фигуре 5 показаны расшифрованные аминокислотные последовательности MaACL1p и MaACL2p в сравнении с известными аминокислотными последовательностями.

Фигура 5-2. На фигуре 5 показаны расшифрованные аминокислотные последовательности MaACL1p и MaACL2p в сравнении с известными аминокислотными последовательностями.

Фигура 6. Фигура 6 представляет собой график, показывающий зависимость MaACL1 от концентрации Mg²⁺.

Фигура 7. На фигуре 7 показан временной ход содержания внутриклеточного жира или масла в сравнении между трансформантами MaACL1 (MaACL1-1, -2) и не-трансформантами (Ctrl-1, -2) в культуре.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новым генам для АТФ:цитратлиазы, полученным из рода Mortierella, характеризующегося генерированием ацетил-CoA, оксалоацетата, АДФ и Pi из АТФ, цитрата и CoA.

В случае эукариотических организмов, имеющих внутриклеточные компартменты, отделенные органеллами, ацетил-CoA согласно данному изобретению генерируется прежде всего в митохондриях под действием пируватдегидрогеназы или β-окислением. Однако ацетил-CoA не может проникать через митохондриальную мембрану и подаваться в виде цитрата в цитоплазму. Ацетил-CoA, обеспечиваемый цитоплазме из этого цитрата под действием ACL, служит в качестве материала-источника для жирных кислот и холестерина, de novo синтезируемых в цитоплазме.

Нуклеиновые кислоты данного изобретения, кодирующие АТФ:цитратлиазу

АТФ:цитратлиаза (ACL) в данном изобретении включает MaACL1 и MaACL2. Соответствие между кДНК, CDS, ORF и аминокислотной последовательностью суммировано в таблице 1 ниже для каждой из нуклеиновых кислот, кодирующих MaACL1 и MaACL2.

Таблица 1
	MaACL1	MaACL2
SEQ ID NO	Соответствующая область в SEQ ID NO:5	SEQ ID NO	Соответствующая область в SEQ ID NO:6
кДНК	SEQ ID NO:5	*****	SEQ ID NO:6	*****
CDS	SEQ ID NO:7	Положения 178-3717	SEQ ID NO:8	Положения 21-3545
ORF	SEQ ID NO:9	Положения 178-3714	SEQ ID NO:10	Положения 21-3542
Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO:11	*****	SEQ ID NO:12	*****

Таким образом, последовательности, родственные MaACL1 данного изобретения, включают SEQ ID NO:11 (аминокислотную последовательность), SEQ ID NO:9 (последовательность, представляющую ORF-область MaACL1), SEQ ID NO:7 (последовательность, представляющую CDS-область MaACL1) и SEQ ID NO:5 (нуклеотидную последовательность кДНК для MaACL1). Среди них SEQ ID NO:7 соответствует нуклеотидам 178-3717 SEQ ID NO:5, тогда как SEQ ID NO:9 соответствует нуклеотидам 178-3714 SEQ ID NO:5 или нуклеотидам 1-3537 SEQ ID NO:7.

Подобным образом последовательности, родственные MaACL2, включают SEQ ID NO:12 (аминокислотную последовательность MaACL2), SEQ ID NO:10 (последовательность, представляющую ORF-область MaACL2), SEQ ID NO:8 (последовательность, представляющую CDS-область MaACL2) и SEQ ID NO:6 (нуклеотидную последовательность кДНК для MaACL2). Среди них SEQ ID NO:8 соответствует нуклеотидам 21-3545 SEQ ID NO:6, тогда как SEQ ID NO:10 соответствует нуклеотидам 21-3542 SEQ ID NO:6 или нуклеотидам 1-3522 SEQ ID NO:8.

Нуклеиновые кислоты данного изобретения включают одноцепочечные и двухцепочечные ДНК, а также их комплементарные РНК, которые могут быть либо природными, либо полученными искусственно. ДНК включают, но не ограничиваются ими, геномные ДНК, кДНК, соответствующие этим геномным ДНК, химически синтезированные ДНК, ПЦР-амплифицированные ДНК, а также их комбинации и гибриды ДНК-РНК.

Предпочтительные варианты нуклеиновых кислот данного изобретения включают (а) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12, и (c) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5 или 6.

Вышеуказанная нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12, и нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:5 или 6, представлены в таблице 1.

Для получения этих нуклеотидных последовательностей данные EST нуклеотидных последовательностей или геномные ДНК из организмов, имеющих АТФ:цитратлиазную активность (далее в описании называемую как ACL-активность), могут быть использованы для поиска нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, имеющий высокую идентичность с известными белками, обладающими ACL-активностью. Предпочтительными организмами, обладающими ACL-активностью, являются липидпродуцирующие грибы, включая, но не ограничиваясь этим, M. alpina.

Для EST-анализа сначала получают кДНК-библиотеку. Что касается способов получения кДНК-библиотеки, может быть сделана ссылка на “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)). Альтернативно, может быть использован коммерчески доступный набор для получения кДНК-библиотеки. Способами получения кДНК-библиотеки, подходящими для данного изобретения, являются, например, следующие, а именно, подходящий штамм M. alpina, липидпродуцирующего белка, инокулируют в подходящую среду и предварительно культивируют в течение подходящего периода времени. Условия культивирования, подходящие для этого предварительного культивирования, включают, например, состав среды: 1,8% глюкоза, 1% дрожжевой экстракт и рН 6,0, период культивирования 3 дня и температуру культивирования 28°C. Затем этот предварительно культивированный продукт подвергают основному культивированию в подходящих условиях. Состав среды, подходящий для основного культивирования, может быть, например, следующим: 1,8% глюкоза, 1% соевый порошок, 0,1% оливковое масло, 0,01% Адеканол, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% Na₂SO₄, 0,05% CaCl₂ ·2H₂O, 0,05% MgCl₂ ·6H₂O и pH 6,0. Условиями культивирования, подходящими для основного культивирования, могут быть, например, аэробная вращающаяся культура при 300 об/мин, 1 об/об/мин, 26°C в течение 8 дней. В процессе культивирования может быть добавлено подходящее количество глюкозы. В подходящие моменты времени в процессе основного культивирования берут пробы культивируемого продукта, из которых затем собирают клетки для получения общей РНК. Для получения общей РНК можно использовать любой известный способ, такой как способ с гидрохлоридом гуанидина/CsCl. Полученная общая РНК может быть обработана с использованием коммерчески доступного набора для очистки поли(A)⁺РНК. Дополнительно, кДНК-библиотека может быть получена с использованием коммерчески доступного набора. Затем любой клон из полученной таким образом кДНК-библиотеки определяют на его нуклеотидную последовательность с использованием праймеров, которые конструируют на векторе для возможности определения нуклеотидной последовательности вставки. В результате могут быть получены EST. Например, при использовании набора ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) для получения кДНК-библиотеки может быть выполнено направленное клонирование.

Идентичность нуклеотидных последовательностей между CDS MaACL1 и MaACL2 данного изобретения равна 79,1%. Подобным образом идентичность аминокислотных последовательностей между MaACL1 и MaACL2 равна 87,1%. Следует отметить, что при анализе с использованием BLASTP аминокислотные последовательности MaACL1 и MaACL2 данного изобретения имеют идентичность 61,6% и 61,9%, соответственно, с полученным из Ustilago maydis 521 предположительным белком (фигура 5) (UM01005.1, GB accession No. EAK82015, gi 46096782), имеющим самую низкую E-величину.

Данное изобретение включает также нуклеиновые кислоты, функционально эквивалентные нуклеиновой кислоте, содержащей приведенную выше нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9 или 10 (в описании далее называемую также “нуклеотидной последовательностью данного изобретения”), или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12 (в описании далее называемую также “аминокислотной последовательностью данного изобретения”). Фраза “функционально эквивалентный” означает, что белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью данного изобретения, или белок, состоящий из аминокислотной последовательности данного изобретения, имеет ACL-активность или, альтернативно, означает наличие не только ACL-активности, но также свойства активности фермента, равных таковым белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью данного изобретения, или белка, состоящего из аминокислотной последовательности данного изобретения. Свойства активности фермента включают все свойства, такие как изменения активности в ответ на изменения температуры, рН, концентрации соли или концентрации субстрата в условиях реакции фермента, величины Km, субстратную специфичность и т.д.

ACL данного изобретения катализирует реакцию, в которой ацетил-CoA, оксалоацетат, АДФ и Pi генерируются из АТФ, цитрата и CoA. “ACL-активность” фермента может быть измерена известным способом. Например, может быть сделана ссылка на следующий документ: Plant Physiol., 2002, 130, 740-56.

“ACL-активность” в настоящем изобретении может быть измерена, например, следующим образом. Получают цитоплазматическую фракцию из клеток дрожжей (не имеющих эндогенного гена ACL), которые трансформированы для экспрессии MaACL1 или MaACL2 данного изобретения, как описано, например, в Plant Physiol., 2002, 130, 740-56. К реакционному раствору, содержащему 20 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 10 мМ АТФ, 10 мМ цитрат, 0,2 мМ CoA, 6 единиц малатдегидрогеназы и 0,1 мМ NADH в 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), добавляют вышеуказанную цитоплазматическую фракцию, и реакцию проводят при 28°C в течение подходящего периода времени, а затем измеряют на изменения в A₃₄₀ (уменьшение уровней NADH) с использованием абсорбциометра для количественного определения тем самым ”ACL-активности”.

Используемая в настоящем описании фраза ”имеющий ACL-активность” означает имеющий активность 1,0 нмоль·мин^-1·мг^-1 или более, хотя без какого-либо ограничения, пока уменьшение уровней NADH может быть определено в описанном выше анализе.

Кроме того, было подтверждено, что ACL-активность MaACL1 данного изобретения (SEQ ID NO:11) зависит от концентрации Mg²⁺. Более конкретно активность достигала пика при концентрации Mg²⁺ 5-10 мМ, а затем уменьшалась с увеличениями концентрации Mg²⁺ (фигура 6). Было обнаружено, что MaACL1 также проявляет максимальную активность при отношении АТФ:цитрат:Mg²⁺ приблизительно 1:1:1.

Такие нуклеиновые кислоты, которые являются функционально эквивалентными нуклеиновым кислотам данного изобретения, включают нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в любой нуклеотидной последовательности подпунктов (а)-(е) ниже. Следует отметить, что при использовании для описания нуклеотидных последовательностей, перечисленных ниже, предполагается, что фраза “приведенная выше активность данного изобретения” означает “имеющая ACL-активность и/или свойства активности фермента, равные ACL-активности и/или свойствам активности фермента белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью данного изобретения, или белка, состоящего из аминокислотной последовательности данного изобретения”, определенной выше.

(a) Нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и имеющий активность данного изобретения.

Нуклеотидные последовательности, содержащиеся в нуклеиновых кислотах данного изобретения, включают нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и имеющий вышеуказанную активность данного изобретения.

Более конкретно, эта последовательность является нуклеотидной последовательностью, которая кодирует белок, состоящий из:

(i) аминокислотной последовательности с делецией одной или более (предпочтительно одной или нескольких (например, 1-350, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, более предпочтительно 1-5)) аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12;

(ii) аминокислотной последовательности с заменой другими аминокислотами одной или более (предпочтительно одной или нескольких (например, 1-350, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, более предпочтительно 1-5)) аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12;

(iii) аминокислотной последовательности с добавлением других одной или более (предпочтительно одной или нескольких (например, 1-350, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, более предпочтительно 1-5)) аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12; или

(iv) аминокислотной последовательности с любой комбинацией (i)-(iii), описанных выше,

и имеющий описанную выше активность данного изобретения.

Среди приведенных выше модификаций замена является предпочтительно консервативной, что означает замену определенного аминокислотного остатка другим остатком, имеющим сходные физические и химические характеристики. Эта замена может быть любой заменой, пока она по существу не изменяет структурные характеристики исходной последовательности. Например, возможна любая замена, пока эта замененная аминокислота не разрушает спираль, присутствующую в исходной последовательности, или не разрушает любой другой тип вторичной структуры, характеризующей исходную последовательность.

Консервативную замену обычно вводят путем синтеза в биологических системах или химического пептидного синтеза, предпочтительно химического пептидного синтеза. В этом случае заместители могут включать неприродные аминокислотные остатки, а также пептидомиметики и обращенные или инвертированные формы аминокислотных последовательностей, в которых незамещенные области являются обращенными или инвертированными.

Аминокислотные остатки классифицированы и перечислены ниже в группах взаимозаменяемых членов, но не ограничиваемых ими, следующим образом:

Группа A: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминобутановая кислота, метионин, O-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин и циклогексилаланин;

Группа B: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, изоаспарагиновая кислота, изоглутаминовая кислота, 2-аминоадипиновая кислота и 2-аминосубериновая кислота;

Группа C: аспарагин и глутамин;

Группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминобутановая кислота и 2,3-диаминопропионовая кислота;

Группа E: пролин, 3-гидроксипролин и 4-гидроксипролин;

Группа F: серин, треонин и гомосерин; и

Группа G: фенилаланин и тирозин.

Неконсервативная замена может включать замену члена одного из приведенных выше классов членом из другого класса. В этом случае, для цели сохранения биологических функций белков данного изобретения, предпочтительно учитывать индекс гидрофобности аминокислот (индекс гидрофобных аминокислот) (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)).

В случае неконсервативной замены, аминокислотные замены могут быть также выполнены на основе гидрофильности.

В этом описании и на фигурах данной заявки нуклеотиды, аминокислоты и их аббревиатуры соответствуют нуклеотидам, аминокислотам и их аббревиатурам, установленным Комиссией IUPAC-IUB по биохимической номенклатуре или обычно используемым в данной области, например, как описано в Immunology--A Synthesis (second edition, edited by E.S. Golub and D.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts (1991)). Кроме того, предполагается, что аминокислоты, которые могут иметь оптические изомеры, представляют их L-изомер, если нет другого указания.

Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) вышеуказанных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты, могут быть также членами, составляющими белки данного изобретения.

Следует отметить, что в обозначении белка, используемом в описании, левое направление является амино-концевым направлением, а правое направление является карбокси-концевым направлением в соответствии со стандартным применением и соглашением.

Подобным образом, если не указано другое, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей является 5'-концом и левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей называют 5'-направлением.

Квалифицированные специалисты в данной области будут способны сконструировать и получить подходящие мутанты описанных в данном документе белков, используя известные в данной области способы. Например, при нацеливании на область, которая является, по-видимому, менее важной для биологической активности белка данного изобретения, можно идентифицировать подходящую область в молекуле белка, структура которого может быть изменена без нарушения биологической активности белка данного изобретения. Можно также идентифицировать остатки или области в этой молекуле, которые являются консервативными между сходными белками. Кроме того, можно также вводить консервативные аминокислотные замены в область, которая является, по-видимому, важной для биологической активности или структуры белка данного изобретения, без нарушения биологической активности и без вредного действия на полипептидную структуру этого белка.

Например, MaACL1 и MaACL2 данного изобретения имеют идентичность аминокислотных последовательностей приблизительно 62% с предположительным полученным из базидиомицета U. maydis ACL-подобным белком (gi 46096782), а также имеют определенную идентичность с полученными у животных предположительными ACL- или ACL-подобными белковыми последовательностями, включающими последовательности мыши (gi_29293809), человека (gi_38569421), Drosophila (gi_28372804) и нематоды (gi_17551266) (фигура 5). В качестве примера возможных аминокислотных остатков, которые могут быть мутированы, остатки, отличные от консервативных остатков, среди всех 7 последовательностей, показанных на фигуре 5, могут быть определены как возможные аминокислотные остатки для образования мутаций, или альтернативно, остатки, отличные от консервативных остатков, среди по меньшей мере 4, 5 или 6 последовательностей из этих 7 последовательностей могут быть определены как возможные аминокислотные остатки образования мутаций.

Альтернативно, три подчеркнутые области, указанные, соответственно, сплошной, пунктирной и двойной линиями на фигуре 5, являются особенно важными участками для АТФ:цитратлиазы/сукцинил-CoA-лиазы (PROSITE PS01216, PS00399 и PS01217, соответственно, от N-концевой стороны). А именно, мутанты по данному изобретению не ограничиваются никаким образом, пока вышеуказанные участки являются консервативными. Таким образом, в качестве другого примера возможных аминокислотных остатков, которые могут быть мутированы, аминокислотные остатки, отличные от остатков этих трех подчеркнутых областей, показанных на фигуре 5, могут быть определены как возможные аминокислотные остатки для образования мутаций.

Кроме того, MaACL1 и MaACL2 данного изобретения имеют аминокислотную идентичность 87,1% друг с другом (фигура 4). В качестве еще одного примера возможных аминокислотных остатков, которые могут быть мутированы, остатки, которые не являются консервативными между MaACL1 и MaACL2, могут быть определены как возможные аминокислотные остатки, которые могут быть мутированы.

Квалифицированные специалисты в данной области смогут проводить так называемое исследование структуры-функции, при котором идентифицируют остатки, в белке данного изобретения и в его сходном пептиде, которые являются важными для биологической активности или структуры, и сравнивать аминокислотные остатки между этими двумя пептидами, предсказывая, тем самым, какие остатки в белке, сходном с белком данного изобретения, являются аминокислотными остатками, соответствующими аминокислотным остаткам, важным для биологической активности или структуры. Кроме того, химически сходные аминокислотные замены могут быть выбраны для предсказанных таким образом аминокислотных остатков, для отбора тем самым мутанта, который сохраняет биологическую активность белка данного изобретения. Подобным образом квалифицированные специалисты в данной области смогут также анализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность этого белкового мутанта. Полученные таким образом результаты данного анализа могут быть дополнительно использованы для предсказания сопоставления аминокислотных остатков относительно этой трехмерной структуры данного белка. Поскольку аминокислотные остатки, предсказанные как остатки, находящиеся на поверхности белка, могут участвовать в важных взаимодействиях с другими молекулами, квалифицированные специалисты в данной области смогут получить мутант, который не вызывает изменения в этих аминокислотных остатках, которые, как предсказано, находятся на поверхности данного белка, на основе результатов анализов, упомянутых выше. Кроме того, квалифицированные специалисты в данной области смогут также получить мутант, имеющий единственную аминокислотную замену для любого из аминокислотных остатков, составляющих белок данного изобретения. Эти мутанты могут быть подвергнуты скринингу любым известным анализом для сбора информации об индивидуальных мутантах, которая, в свою очередь, позволяет оценивать применимость индивидуальных аминокислотных остатков, составляющих белок данного изобретения, для проведения сравнения со следующим случаем, в котором мутант, имеющий замену конкретного аминокислотного остатка, проявляет более низкую биологическую активность, чем активность белка данного изобретения, в котором такой мутант не проявляет биологической активности, или в котором такой мутант проявляет неподходящую активность в ингибировании биологической активности белка данного изобретения. Кроме того, на основе информации, собранной из таких рутинных экспериментов, квалифицированные специалисты в данной области могут легко анализировать аминокислотные замены, нежелательные для мутантов белка данного изобретения, либо отдельно, либо в комбинации с другими мутациями.

Как описано выше, белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12, может быть получен в соответствии с такими способами, как сайт-направленный мутагенез, описанный в “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92 и Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6. Получение мутанта с такой мутацией, включающей делецию, замену или добавление, может быть выполнено, например, с использованием известных процедур, таких как способ Кункеля или способ Gapped duplex с использованием набора для введения мутации на основе сайт-направленного мутагенеза, такого как набор QuikChange™ для сайт-направленного мутагенеза (Stratagene), система GeneTailor™ для сайт-направленного мутагенеза (Invitrogen) или система для сайт-направленного мутагенеза TaKaRa (например, Mutan-K, Mutan-Super Express Km; Takara Bio Inc., Japan).

Способы для возможности получения делеции, замены или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях белков при сохранении их активности включают вышеупомянутый сайт-направленный мутагенез, а также другие способы, такие как способы обработки гена мутагеном, и способы, в которых ген селективно извлекают для удаления, замены или добавления выбранных нуклеотида или нуклеотидов, а затем лигируют.

Одной предпочтительной нуклеотидной последовательностью, содержащейся в нуклеиновых кислотах данного изобретения, является нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-10 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:11 или 12, и имеющий ACL-активность.

Не существует ограничений в отношении количества или сайтов аминокислотных мутаций или модификаций в белке данного изобретения, пока полученный мутант сохраняет ACL-активность или свойства активности фермента, равные активности белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью данного изобретения, или белка, состоящего из аминокислотной после