Вакцина для лечения и/или профилактики физического расстройства, связанного с ренин-активируемой ангиотензиновой системой и применение пептида для ее получения.

Вакцина для лечения и/или профилактики физического расстройства, связанного с ренин-активируемой ангиотензиновой системой и применение пептида для ее получения.

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к лекарству для применения в терапии, иммунологии, молекулярной биологии и вирусологии в основном для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с нарушением функции ренин-активируемой ангиотензиновой системы (РАС), преимущественно артериальной гипертензии и сердечнососудистых заболеваний, связанных с повышенным артериальным давлением (АД).

Ренин-ангиотензиновая система, называемая также ренин-ангиотензин-альдостероновой системой (РААС), представляет собой гормональную систему, которая регулирует физиологические процессы в организме. РАС активируется расщеплением пептида ангиотензиногена до декапептида ангиотензина I (Анг I) под действием фермента ренина. Ключевой продукт рениновой системы - октапептидный гормон ангиотензин II (Анг II), который образуется из ангиотензина I под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). РАС играет ключевую роль в регуляции объема циркулирующей крови и поддержании АД. Однако чрезмерная активность РАС вызывает артериальную гипертензию и поражение органов-мишеней.

В последние годы удалось выяснить, что РАС играет более значительную роль, чем ей приписывалось по классическим представлениям, в регуляции АД и водно-электролитного баланса. Наряду с регуляцией физиологических и патофизиологических процессов в сердечнососудистой системе и почках, РАС действует и на ряд других тканей, включая головной мозг, железы внутренней секреции, органы чувств, жировые и иммунные клетки. Таким образом, РАС играет важную роль в физиологических и патофизиологических процессах, протекающих также в этих тканях.

Поскольку РАС вовлечена в огромное количество физиологических и аптофизиологических процессов, лекарства направленные на РАС стали важным клиническим инструментом в лечении сердечнососудистых заболеваний и болезней почек, таких как артериальная гипертензия, сердечная недостаточность и диабетическая нефропатия. Кроме того, многочисленные исследования показали, что блокирование РАС влияет не только на сердечнососудистые заболевания, обусловленные высоким АД, но и уменьшают частоту и тяжесть клинических проявлений, связанных с воспалительными процессами и, в частности, атеросклерозом. Фундаментальные исследования и эксперименты, проведенные на животных, убедительно подтвердили роль ангиотензина II как провоспалительного медиатора, который непосредственно участвует в образовании атеросклеротических бляшек и ремоделировании сердца.

К тому же, РАС играет основную роль не только как провоспалительный фактор в патогенезе атеросклероза, но и в механизме развития аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз.

Более того, результаты исследований также показывают, что блокирование РАС снижает риск развития сахарного диабета и связанных с ним осложнений. Имеются также данные, свидетельствующие о роли ангиотензина II в развитии резистентности к инсулину и сахарного диабета. Компоненты РАС находятся в сложном взаимодействии с инсулином и могут привести к развитию и прогрессированию болезней обмена веществ.

РАС, воспалительные и аутоиммунные заболевания (атеросклероз и рассеянный склероз)

Атеросклероз - хроническое воспалительное заболевание, которое поражает клетки сосудистой стенки, иммунной системы и ряда органов. Несмотря на данные о важной роли лейкоцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток в атеросклеротическом воспалительном процессе, исследования последних лет показали также роль таких факторов, как активность цитокинов и хемокинов, модулирующих воспалительный процесс.Проведенные недавно исследования позволяют также по-новому взглянуть на провоспалительную активность гормонального пептида ангиотензина II. РАС играет важную роль в развитии воспалительного процесса, что связано с индукцией ангиотензином II секреции проатеросклеротических цитокинов и усугублением дисфункции эндотелиальных клеток. Ангиотензин II регулирует не только секрецию цитокинов, хемокинов и факторов роста в артериальной стенке, но участвует также в регуляции экспрессии факторов клеточной адгезии, таких как фактор межклеточной адгезии (VCAM-1), фактор адгезии сосудистых клеток (ICAM-1), Р-селектина. Наряду с этим было показано, что РАС может модулировать активацию системы комплемента как при атеросклерозе, так и при поражении почечной ткани. Этот каскад воспалительных реакций активирует воспалительный процесс в сосудах путем привлечения (рекрутинга) в интиму воспалительных клеток. Рекрутированные клетки могут продуцировать ангиотензин II, что включает ответ по механизму положительной обратной связи, который может поддерживать этот порочный круг индуцированного воспалительного процесса.

Недавно появился ряд работ, показавших, что сходство между хроническими воспалительными заболеваниями типа рассеянного склероза и наиболее распространенным хроническим заболеванием у человека - атеросклерозом распространяется значительно дальше общности корня («склероз») в названии этих болезней. В этих работах на примере рассеянного склероза и его биологической модели на животных - экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ) - показано также, что РАС играет важную роль в аутоиммунных процессах. Используя метод протеомики, авторы показали, что при рассеянном склерозе в поврежденных участках мозга активируется РАС. Блокирование продукции ангиотензина II с помощью ингибиторов АПФ или ингибирование сигнального пути ангиотензина II с помощью блокаторов его рецепторов подавляет аутореактивность лимфоцитов-хелперов ТН1 и ТН17 и способствует проявлению активности антиген-специфических CD4 FoxP3 регуляторных Т-лимфоцитов (T_reg-клетки). При введении животным ингибиторов АПФ количество CD4 FoxP3 Т-лимфоцитов значительно увеличивается и становится достаточным, чтобы вызвать обратное развитие паралитического ЭАЭ. Это дает основание авторам считать модулирование РАС привлекательной терапевтической стратегией в лечении аутоиммунных заболеваний человека.

РАС и сердечнососудистые заболевания - артериальная гипертензия Сердечнососудистые заболевания - ведущая причина смертности во всем мире. Согласно данным ВОЗ, в структуре смертности на долю сердечнососудистой патологии приходится примерно 30% случаев. Сердечнососудистые заболевания являются результатом поражения сердца и сосудов, и это поражение имеет различные проявления. К ним относятся инфаркт миокарда, инсульт, сердечная недостаточность и терминальную почечную недостаточность. Наиболее существенным фактором риска сердечнососудистой патологии является артериальная гипертензия. Более чем у четверти взрослого населения мира по данным на 2000 г. была выявлена артериальная гипертензия и, если не принять соответствующих мер, этот показатель будет непрерывно расти.

Под артериальной гипертензией обычно понимают повышенное АД, когда систолическое давление превышает 140 мм рт.ст., и/или диастолическое давление превышает 90 мм рт.ст. Согласно Методическим рекомендациям «Объединенного национального комитета по профилактике артериальной гипертензии и выявлению, обследованию и лечению больных с высоким АД», систолическое АД в пределах 120-139 мм рт.ст. и/или диастолическое давление в пределах 80-89 мм рт.ст. должно рассматриваться как предгипертензия, что требует проведения оздоровительных мероприятий для профилактики атеросклероза. Следовательно, снижение повышенного АД - важное направление профилактики сердечнососудистых заболеваний. Прежде всего, следует попытаться снизить АД путем изменения образа жизни и, в частности, отказа от неправильного питания, повышения физической активности и прекращение курения. Однако при эссенциальной гипертензии необходимо особое лечение. Ключевую роль в регуляции АД играет РАС, которая становится привлекательной мишенью для терапевтического воздействия. Таким образом, препараты, специфически действующие на отдельные компоненты РАС, стали важными клиническими инструментами для лечения артериальной гипертензии.

Активация РАС представляет собой каскад реакций, который начинается с расщепления ангиотензина под действием ренина. Ренин - это аспартилпротеаза, которая синтезируется и хранится в основном в гранулах околоклубочковых клеток почек и характеризуется высокой специфичностью по отношению к своему субстрату ангиотензиногену. Ангиотензиноген, главным образом, образуется в клетках печени, которые постоянно секретируют его в кровь. Он расщепляется ренином на N-конце с образованием декапептида ангиотензина I (Анг I; 1-10 пептид), который быстро превращается в биологически активный октапептид ангиотензин II (Анг II; 1-8 пептид). В отличие от Анг II, Анг I не обладает биологической активностью и существует исключительно как предшественник Анг II. Расщепление Анг I происходит в основном под действием АПФ, но не только. Эта связанная с мембранами металлопротеиназа экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток; наиболее высокая концентрация этого фермента отмечается на эндотелии сосудов легких. Помимо АПФ в образовании Анг II участвует также химаза. Ангиотензин II может также образоваться непосредственно из ангиотензиногена под действием ферментов тонина и катепсина. Кроме того, в крови можно обнаружить и другие функционально-активные пептиды, образующиеся из Анг I и Анг II под действием амино-, карбокси- или эндопептидаз. Это Анг (1-9), Анг (1-7), Анг III (пептид 2-8) и Анг IV (пептид 3-8). Карбоксипептидаза, известная как ангиотензин-превращающий фермент II (АПФ II), действует как на Анг I, так и на Анг II. АПФ II, действуя на Анг I, образует Анг 1-9, а на Анг II - Анг 1-7. Под действием АПФ Анг 1-9 может превратиться в Анг 1-7. В отличие от Анг II, который повышает АД и, по-видимому, является основным медиатором, участвующим в ремоделировании сосудов при артериальной гипертензии, Анг 1-7 вызывает расширение сосудов и тем самым может противодействовать потенциальному патогенному действию Анг II. Действие Анг 1-7 реализуется через его рецептор - белок mas, являющийся онкогеном.

Анг II и Анг 1-7 считаются основными эффекторными пептидами РАС, в то время как Анг III и Анг IV обладают несколько меньшей активностью (примерно 40% от активности Анг II). Действие Анг II опосредуется преимущественно двумя рецепторами, трансмембранная часть которых имеет семь доменов: тип 1 (at): подтипы 1a и 1б) и тип 2 (АТ2). Подтипы рецепторы AT₁ и АТ₂ связывают Анг II одинаково, но отличаются по своей локализации в клетке и по экспрессии в различных тканях. Эффект Анг II большей частью реализуется через рецепторы AT₁.

Во всем организме Анг II является сильнодействующим сосудосуживающим агентом. В почках он вызывает спазм клубочковых артериол, тем самым повышая системное АД и уменьшая кровоток. В корковом слое надпочечников он вызывает высвобождение альдостерона, под действием которого в почечных канальцах повышается реабсорбция натрия и воды из мочи. Анг II действует также на центральную нервную систему (ЦНС), повышая солевой аппетит, что вызывает у человека жажду. Кроме того, Анг II стимулирует высвобождение антидиуретического гормона (АДГ).

Классическая роль компонентов РАС состоит в том, чтобы действовать в качестве эндокринных факторов, поддерживающих АД и водно-электролитный баланс. Помимо этих компонентов РАС, циркулирующих в крови, в некоторых тканях существует также местный ангиотензин-генерирующий каскад. Так называемая тканевая РАС может действовать локально по паракринному и/или аутокринному механизму и это действие может проявляться независимо, полностью или частично, от активности циркулирующей РАС.

В настоящее время на рынке имеется несколько групп препаратов для лечения артериальной гипертензии, например диуретики, блокаторы кальциевых каналов, и целый ряд препаратов, специфически воздействующих на компоненты РАС. К последним относятся ингибиторы АПФ, которые связываются с активным центром молекулы АПФ и нарушают способность этого фермента связывать и расщеплять свои субстратами. К характерным побочным эффектам ингибиторов АПФ относятся сухой кашель, «гипотензия первой дозы» и развитие ангионевротического отека. Другой класс препаратов, действующих на РАС, представлен блокаторами рецепторов ангиотензина АТ₁. Блокаторы рецепторов ангиотензина специфически влияют на функцию Анг II, блокируя связывание ангиотензина II с рецептором AT₁. Недавно на рынок поступил новый препарат, действующий на РАС - Алискерин, ингибирующий активность ренина.

В данной области техники также предполагается применять антагонисты Анг II, которые обладают большим сродством к рецепторам AT₁, чем Анг II. В публикации WO 2005/044313 А раскрываются соединения, которые могут применяться для лечения сердечнососудистых заболеваний и болезней, связанных с фиброзом и атеросклерозом. Соединения, раскрываемые в заявке WO 2005/044313 А, включают октапептид с общей формулой X₁X₂VYIHPX₃, в которой X₁ может быть любым аминокислотным остатком, Х₂ может представлять собой аргинин, или N-алкилированный аргинин, или миметик аргинина, а Х₃ может быть аминокислотным остатком, содержащим гидрофобную боковую цепь. Эти соединения имеют более высокое сродство к рецептору AT₁, чем Анг II (антагонистическая активность).

В патенте Великобритании 2001653 А раскрывается соединение, которое представляет собой производное ангиотензина II и имеет общую формулу XRVYIHPY, в которой Х представляет собой α-аминоокси алифатическую ацильную группу, a Y может быть лейцином, изолейцином, аланином или треонином. Такое соединение может применяться в лечении почечной гипертензии.

В заявках WO 2002/087504 A, WO 2001/043761 A, WO 2001/098325 А и WO 2000/002905 А предоставляются соединения, которые действуют как аналоги ангиотензина II.

Несмотря на то что на рынке имеются и разные лекарства для лечения артериальной гипертензии, добиться адекватной коррекции последней пока не удается. В целом недостаточно эффективное лечение обусловлено, с одной стороны, тем, что артериальная гипертензия протекает бессимптомно, с другой - необходимостью длительного применения препаратов, которые больные должны принимать, по меньшей мере, один раз в сутки.

В последнее время активная иммунотерапия вызывает повышенный интерес как потенциально новая стратегия лечения артериальной гипертензии и связанных с нею заболеваний.

Возможность применения вакцинации против компонентов РАС для лечения артериальной гипертензии была продемонстрирована на различных животных моделях (Michel-JB et al.. Am Heart J. 1989; 117:756). Один из первых подходов показал, что вакцинация против ренина эффективно снижает АД. Однако этот подход в последующие годы не разрабатывался, так как у животных развивался аутоиммунный нефрит (Michel-JB et al. Circulation. 1990; 81(6): 1899-910). Другие подходы имели целью индуцировать иммунный ответ против компонентов РАС, которые экспрессируются в виде трансмембранных белков на клеточной поверхности, таких, как АПФ и AT₁R. Ряд научных коллективов изучал влияние активной иммунизации против AT₁R. И хотя в некоторых исследованиях сообщалось о том, что антитела к N-концу AT₁R могут уменьшить тяжесть проявлений артериальной гипертензии у крыс со спонтанной гипертензией, в большинстве случаев такой подход не оказывал существенного эффекта на АД. Работ по изучению активной иммунизации против АПФ очень мало. В одной из них сообщается о вакцинации кроликов, но лишь у одного из 50 животных удалось обнаружить антитела против АПФ (Soffer-RL et al., Fed. Proc. 1983; 42(19):2735-9). Исследования по активной иммунизации против ангиотензиногена не проводились, но в ряде работ были сделаны попытки выяснить возможность вакцинации против ангиотензина I и ангиотензина II.

Вакцинация Анг I, конъюгированным с белками-носителями (например, гемоцианином фиссуреллы) вызвала индукцию гуморального иммунного ответа высокой специфичности к антигену. В экспериментах на различных животных моделях антитела к ангиотензину I, индуцированные вакцинацией, по-видимому, обладали функциональной активностью, так как, во-первых, они были способны связываться с ангиотензином I (что было показано способом Вестерн-блоттинга) и, во-вторых, АД достоверно снижалось, что говорит о блокировании влияния ангиотензина на РАС (Downham et al., Br J din Pharmacol. 2003; 56: 505-12). В отличие от экспериментальных данных, клинические исследования на здоровых добровольцах не выявили снижения АД (Downham et al., 2003). Эти данные получили дополнительное подтверждение в исследованиях на больных с артериальной гипертензией, которых лечили аналогом Анг I, содержащем 12 аминокислот, ковалентно связанных с гемоцианином фиссуреллы и адсорбированном на квасцах (он известен как PMD3117) (Brown et al., Clin Sci. 2004; 107:167-73). Важно, что больные хорошо перенесли такое лечение и что оно индуцировало у них стойкий гуморальный антиген-специфический иммунный ответ. Кроме того, лечение влияло на рениновую систему, о чем можно было судить по изменениям уровня ренина и альдостерона. Однако сравнение результатов опытной и контрольной группы, получавшей плацебо, показало, что вакцинация PMD3117 не повлияла на уровень АД (Brown et al., 2004). В отличие от этого, вакцина Со Vaccine HT™, полученная после незначительной доработки этой вакцины к Анг I компанией «Протерикс» и замены квасцов новым адъювантом, оказывала эффект. Введение этой новой вакцины, приготовленной по новой технологии, вызывало 10-кратное повышение титра антител к ангиотензину на доклинической стадии испытания, а у здоровых людей приводило к изменениям систолического и диастолического давления. Тем не менее, снижение АД было незначительным и наблюдалось лишь в состоянии покоя, но не в период активности, что было бы более важно.

При других подходах к получению антител, которые могут блокировать РАС, в качестве антигенов использовались пептиды, являющиеся производными ангиотензина II. В отличие от предыдущего исследования, в котором инъекция конъюгатов ангиотензина II с белком-носителем, не вызывала снижения АД, вакцинация ангиотензином II, связанным с вирусоподобными частицами (VLP - virus-like particles), индуцировала гуморальный иммунный ответ высокой антигенной специфичности, сопровождавшийся статистически достоверным снижением АД (AMbühl et al., J Hypertension. 2007; 25:63-72.). Однако в недавно проведенном клиническом исследовании, в котором больным вводилась вакцина ангиотензина II, связанного с вирусоподобными частицами, такого снижения АД не наблюдалось. Это говорит о том, что индукция гуморального иммунного ответа этой пептидной вакциной могла быть неоптимальной или недостаточной. Таким образом, в данной области техники сохраняется потребность в новых, более эффективных вакцинах к ангиотензиновым пептидам.

Целью настоящего изобретения является предоставление препарата для профилактики и лечения состояний, связанных с повышенным уровнем ангиотензина II, вырабатываемого РАС, на основе вакцины.

Оказалось, что вакцину, включающую пептид, связанный с фармацевтически приемлемым носителем, можно успешно применять для лечения и/или профилактики физического расстройства, связанного с ренин-активируемой ангиотензиновой системой, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность

,

X₁ представляет собой G или D,

X₂ представляет собой А, Р, М, G или R,

Х₃ представляет собой G, А, Н или V,

Х₄ представляет собой S, А, D или Y,

X₅ представляет собой А, D, Н, S, N или I,

Х₆ представляет собой A, L или F,

где m, n и о независимо друг от друга равны 0 или 1 при условии, что когда о равно 0, m и n равны 0 и, когда n равно 0, m равно 0, и где пептид не является пептидом DRVYIHPF.

Не только пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, соответствующую Формуле I, можно применять для лечения и/или профилактики физического расстройства, связанного с ренин-активируемой ангиотензиновой системой, но и пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, соответствующую Формулам II и III. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к вакцине, включающей пептид, связанный с фармацевтически приемлемым носителем и имеющий аминокислотную последовательность

,

для лечения и/или профилактики физического расстройства, связанного с ренин-активируемой ангиотензиновой системой, в которой

X₁ представляет собой G, А или D,

Х₂ представляет собой А, Р, М G или R,

Х₃ представляет собой G, А, Н или V,

Х₄ представляет собой S, А, D или Y,

Х₅ представляет собой A, D, H, S, N или I,

Х₆ представляет собой Y или И,

Х₇ представляет собой А, V, L, I или F,

где m, n и независимо друг от друга равны 0 или 1 при условии, что когда о равно 0, m и n равны 0 и, когда n равно 0, m равно 0, и где пептид не является пептидом DRVYIHPF.

Согласно наиболее предпочтительному воплощению настоящего изобретения вакцина содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность

который можно применять для лечения и/или профилактики физического расстройства, связанного с ренин-активируемой ангиотензиновой системой, предпочтительно артериальной гипертензии и связанных с ней нарушений, в которой

X₁ представляет собой G, А или D,

Х₂ представляет собой А, Р, M, G или R,

Х₃ представляет собой G, A, H или V,

Х₄ представляет собой S, А, D или Y,

Х₅ представляет собой А, D, H, S, N или I,

Х₆ представляет собой Y или H,

Х₇ представляет собой А, V, L, I или F, и где пептид не является пептидом DRVYIHPF.

Вакцина настоящего изобретения при введении млекопитающим способна индуцировать у них образование антител к ангиотензину I или ангиотензину II при связывании ее с белком-носителем (или с пептидом, содержащим антигенную детерминанту Т-клеток). Пептиды, обозначенными формулами I-III, могут индуцировать образование антител, которые имеют более высокую специфичность к Анг II, чем к Анг I. Вакцины, содержащие пептид, имеющий аминокислотную последовательность, отраженную в формулах I-III, и аминокислоты Н и L на С-конце пептида X₁X₂X₃X₄X₅X₆PX₇HL (обе аминокислоты происходят из Анг I), например, индуцируют образование антител, которые распознают Анг I и более специфичны по отношению к нему, чем к Анг II. Это дает возможность специфически «нацелить» вакцину только на один вид пептидов ангиотензина или на их комбинацию. Поскольку у животных, о которых говорилось выше, эти антитела связываются с пептидами, производными ангиотензина, уровень пептидов ангиотензина может значительно меняться, что дает возможность применять эти иммуногенные пептиды в иммунотерапевтическом подходе к лечению состояний, связанных с повышенными уровнями ангиотензина II, продуцируемого РАС или другими протеазами (например, химазой). Не ограничивая себя рамками той или иной теории молекулярного механизма действия, отметим, что пептидные варианты настоящего изобретения будут действовать как иммуногены, индуцирующие образование антител, которые связываются с более чем одним видом ангиотензинового пептида и таким образом нейтрализуют одновременно все существующие виды ангиотензиновых пептидов, участвующие в развитии артериальной гипертензии. При альтернативном подходе индуцированные антитела могут специфически связываться с С-концом ангиотензина II. При таких условиях индуцированные антитела дополнительно блокируют связывание ангиотензина II с его рецептором AT₁R.

Аминокислотные остатки, приведенные в формулах I-III, можно заменять на соответствующие аминокислотные остатки, указанные выше. Аминокислотная последовательность, получающаяся путем указанных замен, включает в себя один, два, три, четыре, пять, шесть или семь аминокислотных остатков, которые не идентичны исходной аминокислотной последовательности ангиотензина II (DRVYIHPF). Предпочтительнее всего, чтобы формулы I-III отличались от аминокислотной последовательности ангиотензина II, по меньшей мере, на один аминокислотный остаток более предпочтительно, по меньшей мере, на два и максимум на семь аминокислотных остатков, более предпочтительно, максимум на шесть аминокислотных остатков, более предпочтительно, максимум на пять, более предпочтительно, максимум на четыре и даже более предпочтительно, максимум на три аминокислотных остатка.

Пептиды, имеющие приведенные выше формулы, могут также включать пять, шесть, семь или восемь аминокислотных остатков (начиная от X₁ или Х₂ или Х₃ до последнего аминокислотного остатка).

Пептид в соответствии с настоящим изобретением может состоять из 5, 6, 7 или 8 (до 20) аминокислотных остатков, предпочтительно из 5, 6, 7 или 8 (до 15), в частности из 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислотных остатков. Пептиды в настоящем изобретении могут быть также частью полипептида или белка, количество аминокислотных остатков в котором достигает 300, предпочтительно 200, а еще более предпочтительно 150 и даже более предпочтительно 100 аминокислотных остатков.

Пептиды настоящего изобретения не идентичны естественному ангиотензину II, имеющему формулу DRVYIHPF. Вакцина настоящего изобретения вызовет иммунный ответ у хозяина, который реагирует на ангиотензиновые пептиды.

Пептиды настоящего изобретения можно получить способами химического синтеза, которые хорошо известны в данной области техники, либо в виде изолированного пептида, либо пептида, входящего в состав другого пептида или полипептида. При альтернативном способе пептид синтезируется микроорганизмами, а затем выделяется и при необходимости подвергается дополнительной очистке. Вариант пептида может продуцироваться микроорганизмами, такими как бактерии, дрожжевые и плесневые грибы, клетками эукариот, такими как клетка млекопитающего или насекомого, или с помощью рекомбинантного вектора таких вирусов, как аденовирусы, поксвирусы, герпесвирусы, вирусы леса Семлики, бакуловирусы, а также бактериофагов и вирусов Синдбис и Сендай. К бактериям, которые подходят для использования в качестве продуцента соединения/пептида, относятся Е. coli, В. subtilis или любая другая бактерия, способная экспрессировать пептиды. Пригодные дрожжевые грибы для экспрессии указанного соединения/пептида включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida spp., Pichia pastoris и любые другие дрожжевые грибы, которые способны экспрессировать пептиды. Соответствующие способы хорошо известны в данной области техники. Способы выделения и очистки пептидов, получаемых рекомбинантным путем, также хорошо известны в данной области техники и включают, например, гель-фильтрацию, аффинную и ионообменную хроматографию и др.

Чтобы облегчить выделение пептида, может быть получен слитый полипептид, в которой данный пептид трансляционно слит (ковалентно связан) с гетерологическим полипептидом, обеспечивающим возможность выделения путем аффинной хроматографии. Типичными гетерологическими полипептидами являются His-Tag (например. His 6, то есть 6 остатков гистидина), GST-Tag (глутатион-3-трансфераза) и др. Слитый полипептид не только облегчают процесс очистки пептида, но может также предотвращать разрушение указанного пептида при очистке. Если гетерологический полипептид надо удалить после очистки, то в слитом полипептиде создают сайт расщепления, расположенный между гетерологическим пептидом и выделяемым пептидом. Сайт расщепления состоит из аминокислотной последовательности, которая расщепляется ферментом, активный центр которого специфичен к данной аминокислотной последовательности (например, протеазами).

Используемые здесь формулировки «пептид, связанный с фармацевтически приемлемым носителем» и «пептид, связанный с носителем» означают, что пептид слит или конъюгирован с носителем. Если пептид настоящего изобретения слит или конъюгирован (например, через карбоксильную или аминогруппу, или сульфгидрильную, гидроксильную, имидазолильную, гуанидильную или индолильную группу) с белковым носителем, можно ввести линкер между пептидом и белковым носителем.

Согласно особенно предпочтительному воплощению настоящего изобретения Формула I может содержать следующие заместители:

X₁ представляет собой G или D,

Х₂ представляет собой G, R, А, Р или М,

Х₃ представляет собой А, V или G,

Х₄ представляет собой Y, А или S,

Х₅ представляет собой N, I, D, S или А и/или

Х₆ представляет собой F.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения пептид с Формулой I выбирается из группы, состоящей из GRVYIHPF, DPVYIHPF, DMVYIHPF, DGVYIHPF, DAVYIHPF, DRGYIHPF, DRAYIHPF, DRHYIHPF, DRVAIHPF, DRVSIHPF, DRVDIHPF, DRVYAHPF, DRVYNHPF, DRVYDHPF, DRVYHHPF, DRVYSHPF, DRVYIHPA, DRVYIHPL, DAAYIHPF, DRAAIHPF, DRVAAHPF, DRAYAHPF, DRAAAHPF, DAAAIHPF, DAGYIHPF, DAHYIHPF, DPGYIHPF, DPAYIHPF, DMGYIHPF, DMAYIHPF, DMHYIHPF, DGGYIHPF, DGAYIHPF, DGHYIHPF, DPVAIHPF, DMVAIHPF, DMVSIHPF, DRGAIHPF, DRHAIHPF, DRGYAHPF, DRGYDHPF, DRGYHHPF, DRGYSHPF, DRGYNHPF, DRAYDHPF, DRAYHHPF, DRAYSHPF, DRAYNHPF, DRHYAHPF, DRHYSHPF, DRHYNHPF, DRHYDHPF, DRHYHHPF, DRGADHPF, DRVAHHPF, DRHADHPF, GRGAIHPF, DPGAIHPF, DPGSIHPF, DMGAIHPF, DMGSIHPF, GPGYIHPF, GPGSIHPF, GMGSIHPF, DRGSIHPF, DPHAIHPF. DMHAIHPF, GPHAIHPF, GMHSIHPF, PVYIHPF, MVYIHPF, GVYIHPF, AVYIHPF, RGYIHPF, RAYIHPF, RHYIHPF, RVAIHPF, RVSIHPF, RVDIHPF, RVYAHPF, RVYNHPF, RVYDHPF, RVYHHPF, RVYSHPF, RVYIHPA, RVYIHPL, AAYIHPF, RAAIHPF, RVAAHPF, RAYAHPF, RAAAHPF, AAAIHPF, AGYIHPF, AHYIHPF, PGYIHPF, PAYIHPF, MGYIHPF, MAYIHPF, MHYIHPF, GGYIHPF, GAYIHPF, GHYIHPF, PVAIHPF, PVSIHPF, MVAIHPF, MVSIHPF, RGAIHPF, RHAIHPF, RGYAHPF, RGYDHPF, RGYHHPF, RGYSHPF, RGYNHPF, RAYDHPF, RAYHHPF, RAYSHPF, RAYNHPF, RHYAHPF, RHYSHPF, RHYNHPF, RHYDHPF, RHYHHPF, RGADHPF, RGAHHPF, RHADHPF, RHSIHPF, PGAIHPF, RHAIHPF, PGSIHPF, MGAIHPF, MGSIHPF, RGSIHPF, PHAIHPF, MHAIHPF, PHSIHPF, MHSIHPF, GYIHPF, AYIHPF, HYIHPF, VYAHPF, VYNHPF, VYDHPF, VYHHPF, VYSHPF, VYIHPA, VYIHPL, AAIHPF, AYAHPF, HYIHPF, GAIHPF, HAIHPF, GYAHPF, GYDHPF, GYHHPF, GYSHPF, GYNHPF, AYDHPF, AYHHPF, AYSHPF, AYNHPF, HYAHPF, HYSHPF, HYNHPF, HYDHPF, HYHHPF, GAIHPF, HSIHPF, GSIHPF, HAIHPF, AIHPF, SIHPF, DIHPF, YAHPF, YNHPF, YDHPF, YHHPF и YSHPF.

Особенно предпочтительными пептидами являются DPVYIHPF, DMVYIHPF, DGVYIHPF, DAVYIHPF, DRGYIHPF, DRAYIHPF, DRHYIHPF, DRVAIHPF, DRVYAHPF, DRVYNHPF, DRVYDHPF, DRVYSHPF, DRVYIHPL, DAAYIHPF, DRAAIHPF, DRVAAHPF, DRAYAHPF, DAGYIHPF, DAHYIHPF, DPGYIHPF, DPAYIHPF, DMGYIHPF, DMAYIHPF, DMHYIHPF, DGGYIHPF, DGAYIHPF, DGHYIHPF, DMVSIHPF, DRGAIHPF, DRGYAHPF, DRGYDHPF, DRGYSHPF, DRGYNHPF, DRAYDHPF, DRAYSHPF, DRHYAHPF, DRHYSHPF, DRHYNHPF, DRHYDHPF, GPGYIHPF, GPGSIHPF, DRGSIHPF, PVYIHPF, GVYIHPF, AVYIHPF, RGYIHPF, RAYIHPF, RHYIHPF, RVAIHPF, RVSIHPF, RVDIHPF, RVYAHPF, RVYNHPF, RVYDHPF, RVYSHPF, RVYIHPL, AAYIHPF, RAAIHPF, RVAAHPF, RAYAHPF, AGYIHPF, AHYIHPF, PGYIHPF, PAYIHPF, GGYIHPF, GAYIHPF, GHYIHPF, PVSIHPF, MVSIHPF, RGAIHPF, RGYAHPF, RGYDHPF, RGYSHPF, RGYNHPF, RAYDHPF, RAYSHPF, RAYNHPF, RHYAHPF,RHYSHPF, RHYNHPF, RHYDHPF, RHSIHPF, PGAIHPF, RHAIHPF, PGSIHPF,MGAIHPF, MGSIHPF, MGYIHPF, RGSIHPF, PHAIHPF, MHAIHPF, PHSIHPF, MHSIHPF, GYIHPF, AYIHPF, VYAHPF, VYNHPF, VYDHPF, VYSHPF, AAIHPF, AYAHPF, HYIHPF, GAIHPF, GYAHPF, GYDHPF, GYSHPF, GYNHPF, AYDHPF, AYSHPF, AYNHPF, GAIHPF, GSIHPF.

Еще более предпочтительными пептидами являются DPVYIHPF, DMVYIHPF, DGVYIHPF, DAVYIHPF, DRGYIHPF, DRAYIHPF, DRHYIHPF, DRVYIHPL, DAAYIHPF, DRAAIHPF, DRVAAHPF, DRAYAHPF, DAGYIHPF, DAHYIHPF, DPGYIHPF, DPAYIHPF, DMGYIHPF, DMAYIHPF, DMHYIHPF, DGGYIHPF, DGAYIHPF, DGHYIHPF, DMVSIHPF, DRGAIHPF, DRGYAHPF, DRGYDHPF, DGAYIHPF, DGHYIHPF, DMVSIHPF, DRGAIHPF, DRGYAHPF, DRGYDHPF, DRGYSHPF, DRGYNHPF, DRAYDHPF, DRAYSHPF, DRAYNHPF, GPGYIHPF, PVYIHPF, GVYIHPF, RGYIHPF, RAYIHPF, RVSIHPF, RVYIHPL, AAYIHPF, RAAIHPF, RAYAHPF, AGYIHPF, PGYIHPF, PAYIHPF, GAYIHPF, PVSIHPF, MVSIHPF, RGAIHPF, RGYAHPF, RGYSHPF, GYIHPF, где самыми предпочтительными являются пептиды DPVYIHPF, DMVYIHPF, DAAYIHPF, DRAAIHPF, DRAYAHPF, DAGYIHPF, DPGYIHPF, DGAYIHPF, DMVSIHPF, DRGAIHPF, DRGYDHPF, DRGYSHPF, PVYIHPF, GVYIHPF, AAYIHPF, RAAIHPF, RAYAHPF, PGYIHPF, PVSIHPF, MVSIHPF, RGAIHPF.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения

X₁ в формулах II и III представляет собой G, А или D,

X₂ в формулах II и III представляет собой G, А, Р, М или R,

Х₂ в формулах II и III представляет собой G, А, Н или V,

Х₄ в формулах II и III представляет собой S, А, D или Y,

Х₅ в формулах II и III представляет собой А, D, Н, S, N или I,

Х₆ в формулах II и III представляет собой Y или Н,

Х₇ в формулах II и III представляет собой А, V, L, I или F.

Упомянутые выше аминокислотные остатки являются наиболее предпочтительными заместителями.

Пептиды настоящего изобретения могут быть укороченными на своих N-концах, так что в этих пептидах отсутствуют первый, второй и/или третий аминокислотные остатки.

Пептиды предпочтительно выбираются из группы, состоящей из: GRVYIHPF, DPVYIHPF, DMVYIHPF, DAVYIHPF, DRGYIHPF, DRAYIHPF, DRHYIHPF, DRVAIHPF, DRVSIHPF, DRVDIHPF, DRVYAHPF, DRVYNHPF, DRVYDHPF, DRVYHHPF, DRVYSHPF, DRVYIYPF, DRVYIHPA, DRVYIHPV, DRVYIHPL, DRVYIHPI, DAAYIHPF, DRAAIHPF, DRVAAHPF. DRAYAHPF, DRAAAHPF, ARAAIHPF, ARVAAHPF, DAAAIHPF, DAAAAHPF, DAVAAHPF, DAGYIHPF, DAHYIHPF, DPGYIHPF, DPAYIHPF, DMGYIHPF, DMAYIHPF, DMHYIHPF, DGGYIHPF, DGAYIHPF, DGHYIHPF, DPVAIHPF, DPVSIHPF, DMVAIHPF, DMVSIHPF, DRGAIHPF, DRHAIHPF, DRGYAHPF, DRGYDHPF, DRGYHHPF, DRGYSHPF, DRGYNHPF, DRAYDHPF, DRAYHHPF, DRAYSHPF, DRAYNHPF, DRHYAHPF, DRHYSHPF, DRHYNHPF, DRHYDHPF, DRHYHHPF, DRHYIYPF, DRGADHPF, DRGAHHPF, DRVAHHPF, DRHADHPF, GRGAIHPF, GRHSIHPF, GRHADYPF, DPGAIHPF, GRHAIIIPF, DPGSIHPF, DMGAIHPF, DMGSIHPF, GPGYIHPF, GMGYIHPF, GPGSIHPF, GMGSIHPF, DRGSIHPF, DPHAIHPF, DMHAIHPF, GPHAIHPF, GPHAIHPF, GMHAIHPF, GPHSIHPF и GMHSIHPF.

Укороченные варианты пептидов, в которых отсутствует первый N-концевой аминокислотный остаток, предпочтительно выбираются из группы, состоящей из: PVYIHPF, MVYIHPF, GVYIHPF, AVYIHPF, RGYIHPF, RAYIHPF, RVAIHPF, RVSIHPF, RVDIHPF, RVYAHPF, RVYNHPF, RVYDHPF, RVYHHPF, RVYSHPF, RVYIYPF, RVYIHPA, RVYIHPV, RVYIHPL, RVYIHPI, AAYIHPF, RAAIHPF, RVAAHPF, RAYAHPF, RAAAHPF, RAAIHPF, RVAAHPF, AAAIHPF, AAAAHPF, AVAAHPF, AGYIHPF, AHYIHPF, PGYIHPF, PAYIHPF, MGYIHPF, MAYIHPF, MHYIHPF, GGYIHPF, GAYIHPF, GHYIHPF, PVAIHPF, PVSIHPF, MVAIHPF, MVSIHPF, RGAIHPF, RHAIHPF, RGYAHPF, RGYDHPF, RGYHHPF, RGYSHPF, RGYNHPF, RAYDHPF, RAYSHPF, RAYNHPF, RHYAHPF, RHYSHPF, RHYNHPF, RHYDHPF, RHYHHPF, RHYIYPF, RGADHPF, RGAHHPF, RVAHHPF, RHADHPF, RHSIHPF, RHADYPF, PGAIHPF, RHAIHPF, PGSIHPF, MGAIHPF, MGSIHPF, RGSIHPF, PHAIHPF, MHAIHPF, PHSIHPF и MHSIHPF.

Укороченные варианты пептидов, у которых отсутствуют первые два N-концевых аминокислотных остатка, предпочтительно выбираются из группы, состоящей из: GYIHPF, AYIHPF, HYIHPF, VAIHPF, VSIHPF, VDIHPF, VYAHPF, VYNHPF, VYDHPF, VYHHPF, VYSHPF, VYIHPA, VYIHPV, VYIHPL, VYIHPI, AAIHPF, VAAHPF, AYAHPF, AAAHPF, HYIHPF, GAIHPF, HAIHPF, GYAHPF, GYDHPF, GYHHPF, GYSHPF, GYNHPF, AYDHPF, AYSHPF, AYNHPF, HYAHPF, HYSHPF, HYNHPF, HYDHPF, HYHHPF, HYIYPF, GADHPF, GAHHPF, VAHHPF, HADHPF, GAIHPF, HSIHPF, HADYPF, GSIHPF и HAIHPF.

Укороченные варианты пептидов, у которых отсутствуют первые три N-концевых аминокислотных остатка, предпочтительно выбираются из группы, состоящей из: AIHPF, SIHPF, DIHPF, YAHPF, YNHPF, YDHPF, YHHPF, YSHPF, YIYPF, YIHPA, YIHPV, YIHPL, YIHPI, AAHPF, ADHPF, AHHPF и ADYPF.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения, по меньшей мере, один цистеиновый остаток присоединен к N-концу аминокислотной последовательности в соответствии с формулами I, II и/или III и всех упомянутых выше специфических пептидов.

Пептид в настоящего изобретения может дополнительно включать, по меньшей мере, один цистеиновый остаток на N-конце. Этот цистеиновый остаток может служить реактивной группой для связывания пептида с другой молекулой или носителем. Например, эта группа может использоваться для связывания данного пептида с белком-носителем. Альтернативно этому, цистеиновый остаток можно присоединить к С-концу пептида настоящего изобретения.

Пептиды настоящего изобретения являются связанными с носителем, предпочтительно с белковым носителем.

Для увеличения продукции специфических антител к ангиотензиновому пептиду у млекопитающего соединение настоящего изобретения является связанным с носителем.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения носитель выбирается из группы, в которую входят гемоцианин фиссуреллы, столбнячный анатоксин и дифтерийный токсин или любой другой белок или пептид, содержащий антигенные детерминанты (эпитопы) Т-клеток.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения пептид конъюгируют с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы (KLH - Keyhole Limpet Haemocyanin), столбнячным анатоксином, альбумин-связывающим белком, бычьим сывороточным альбумином, дендримером (MAP; Biol Chem. 358: 581), пептидными линкерами (или фланкирующими участками), а также с адъювантными веществами, описанными Singh et al. в Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (особенно веществами, приведенными в Табл. 1 этого документа) и O'Hagan et al. в Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (особенно описанными ими эндогенными иммунопотенцирующими соединениями и системами доставки) или их смесями. Реакцию конъюгации (например, с помощью гетеробифункциональных соединений, таких как GMBS и, конечно же, других веществ, описанных в «Bioconjugate Techniques» Greg. Т.Hermanson) для связывания пептида с носителем можно выбрать из реакций, известных специалистам в данной области техники. Кроме того, в состав вакцины можно включить адъювант, предпочтительно малорастворимую композицию алюминия, в частности гидроксид алюминия. И конечно, можно использовать такие адъюванты, как MF59 фосфат алюминия, фосфат кальция, цитокины [например, IL-2, IL-12, GM-CSF (гранулоцитарно-макрофаговый колониестимулирующий фактор)], сапонины (например, QS21), производные мурамилдипептида (MDP), CpG олигонуклеотиды, липополисахариды, монофосфориллипид А, полифосфазены, эмульсии [например, с адъювантом Фройнда или синтетическим маслом «Синтекс» (SAF)], липосомы, виросомы, иммуностимулирующие комплексы (iscoms), протеолипосомы с улиткообразной структурой (cochleates), полилактидкогликолидные микрочастицы (PLG microparticles), полоксамерные частицы, вирусоподобные частицы, термолабильный энтеротоксин, холерный токсин, мутантные токсины (например, LTK63 и LTR72), микрочастицы и/или полимеризованные липосомы.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения пептид готовят вместе с адъювантом, предпочтительно адсорбированном на квасцах.

В близком воплощении настоящее изобретение являе