Антитела против mst1r и их применение

Антитела против mst1r и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

MST1R (рецептор стимулирующего макрофаги белка 1; MST1R человека, номер доступа в GenBank NM_002447.2), также описанный как RON или CDw136, представляет собой родственную c-Met тирозинкиназу, находящуюся в клетках эпителиального происхождения. Одноцепочечный предшественник, состоящий из 1400 аминокислот расщепляется на связанный дисульфидной связью гетеродимер, состоящий из внеклеточной α-цепи 40кДа и β-цепи 150кДа, которая содержит внутриклеточный тирозинкиназный домен. Подобно c-Met, MST1R индуцирует рост инвазивных клеток, миграцию, диссоциацию клеток и вхождение в матрикс. [Wang, et al., Carcinogenesis 24, 1291-1300, 2003; Lee, et al., Clin. Cancer Res. 11, 2222-2228, 2005]. Обе тирозинкиназы сверхэкспрессируются при ряде злокачественных опухолей, таких как рак молочной железы, легкого или предстательной железы [O'Toole, et al., Cancer Res. 66, 9162-9170, 2006]. Единственным лигандом MST1R, известным до настоящего времени, является MSP, стимулирующий макрофаги белок. Связывание MSP запускает аутофосфорилирование тирозинкиназного домена MST1R. Активированный таким образом MST1R запускает ряд каскадов в различных путях. [Wang, et al., Carcinogenesis 24, 1291-1300, 2003; O'Toole, et al., Cancer Res. 66, 9162-9170, 2006]. Также сообщалось об образовании биологически активных укороченных вариантов MST1R вследствие сплайсинга мРНК [Wang, et al., Carcinogenesis 24, 1291-1300, 2003]. Например, в некоторых образцах колоректальной карциномы выявлен вариант MST1RΔ160, и его сверхэкспрессия без лиганда опосредовала образование опухолей у "голых" мышей [Zhou et al., Oncogene 22, 186-197, 2003]. Антитела против MST1R, такие как IMC-41A10, блокируют взаимодействие лиганд-рецептор и являются эффективными ингибиторам рецептора и нисходящей передачи сигнала, клеточной миграции и образования опухоли [O'Toole, et al., Cancer Res. 66, 9162-9170, 2006].

В заключение, антитела, блокирующие активность MST1R имеют потенциальную терапевтическую применимость при злокачественной опухоли человека.

Сущность

Объектом изобретения являются антитела человека и гуманизированные антитела против MST1R.

Другим объектом являются антитела, которые безопасны для человека.

Еще одним объектом изобретения являются способы лечения заболевания и/или состояний, связанных с активацией MST1R, с использованием одного или нескольких антител по изобретению. Эти и другие объекты более подробно описаны в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления выделенное антитело или функциональный фрагмент, содержащий антиген-связывающую область, специфичны к MST1R.

Такое антитело или его функциональный фрагмент могут содержать антиген-связывающую область, содержащую область H-CDR3 (CDR3 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область H-CDR2 (CDR2 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5; и антиген-связывающая область также может содержать область H-CDR1 (CDR1 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6. Такое антитело или его функциональный фрагмент могут содержать антиген-связывающую область, содержащую область L-CDR3 (CDR3 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область L-CDR1 (CDR1 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 или 15; и антиген-связывающая область также может содержать область L-CDR2 (CDR2 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

Антитела (и их функциональные фрагменты), описываемые в настоящем документе, могут содержать антиген-связывающую область, специфичную к эпитопу MST1R, где эпитоп содержит один или несколько аминокислотных остатков аминокислоты с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17. Для определенных антител эпитоп может быть линейным, тогда как для других он может быть конформационным (т.е., прерывным). Антитело или его функциональный фрагмент с одним или несколькими из этих свойств могут содержать антиген-связывающую область, содержащую область H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5; и антиген-связывающая область также может содержать область H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6. Такое специфичное против MST1R антитело по изобретению может содержать антиген-связывающую область, содержащую область L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область L-CDR1, приведенную в SEQ ID NO:13 или 15; и антиген-связывающая область также может содержать область L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

Варианты пептидов последовательностей, описываемых в настоящем документе также включены в различные варианты осуществления изобретения. Таким образом, варианты осуществления включают антитела против MST1R с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, область CDR которых по меньшей мере на 60 процентов идентична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 или 6; и/или область CDR которых по меньшей мере на 80 процентов гомологична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 или 6. Кроме того, изобретение включает антитела против MST1R с аминокислотной последовательностью легкой цепи, область CDR которых по меньшей мере на 60 процентов идентична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16; и/или область CDR которых по меньшей мере на 80 процентов гомологична областям CDR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

Описываемое в настоящем документе антитело может представлять собой IgG (например, IgG₁), тогда как фрагмент антитела может представлять собой, например, Fab или scFv. Таким образом, фрагмент антитела по изобретению может представлять собой или может содержать антиген-связывающую область, ведущую себя одним или несколькими способами, как описано в настоящем документе.

Другой вариант осуществления также относится к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, каждая из которых может кодировать антиген-связывающую область антитела человека или его функциональный фрагмент, специфичные к эпитопу MST1R. Такая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела и содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, 20, или последовательность нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующуюся с комплементарной цепью SEQ ID NO:18 или 20. Нуклеиновая кислота может кодировать вариабельную область легкой цепи выделенного антитела или его функционального фрагмента и может содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30, 32, или последовательность нуклеиновой кислоты, в условиях с высокой жесткостью гибридизующуюся с комплементарной цепью SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 или 32.

Описываемые в настоящем документе нуклеиновые кислоты подходят для рекомбинантного получения. Таким образом, векторы и клетки-хозяева, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, описываемую в настоящем документе, также представляют собой дополнительные варианты осуществления.

Описываемые в настоящем документе композиции можно использовать для терапевтического или профилактического применения. Таким образом, эти варианты осуществления включают фармацевтическую композицию, содержащую антитело по изобретению (или функциональный фрагмент антитела) и его фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В связанном аспекте другой вариант осуществления включает способы лечения нарушения или состояния, связанных с нежелательным присутствием MST1R или экспрессирующих MST1R клеток. Такой способ предусматривает стадии введения индивидууму, при необходимости, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело по изобретению, как описано или предусмотрено в настоящем документе.

Другие варианты осуществления относятся к выделенным эпитопам MST1R, в линейной или конформационной форме, и их использованию для выделения антитела или его функционального фрагмента, где антитело или фрагмент антитела содержат антиген-связывающую область, специфичную к указанному эпитопу. При этом конформационный эпитоп может содержать один или несколько аминокислотных остатков из SEQ ID NO:17. Эпитоп MST1R можно использовать, например, для выделения антител или их функциональных фрагментов (где каждое из антител или фрагментов антител содержит антиген-связывающую область, специфичную к такому эпитопу), включающего стадии приведения в контакт указанного эпитопа MST1R c библиотекой антител и выделения антител(а) или их функциональных фрагментов(а).

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному эпитопу MST1R, по существу состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17. Как используют в настоящем документе, такой эпитоп "по существу состоит из" одной из непосредственно предшествующих аминокислотных последовательностей плюс обладает дополнительными характеристиками, при условии, что дополнительные характеристики существенно не влияют на основные и новые характеристики эпитопа.

Изобретение также относится к набору, содержащему (i) выделенный эпитоп MST1R, содержащий один или несколько аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17; (ii) библиотеку антител и (iii) инструкции для использования библиотеки антител для выделения одного или нескольких представителей такой библиотеки, которые специфически связываются с таким эпитопом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение основано на открытии новых антител, специфичных или имеющих высокую аффинность к MST1R и способных обеспечивать терапевтический эффект у индивидуума. Описываемые в настоящем документе антитела, которые могут представлять собой антитела человека или гуманизированные антитела, можно использовать во многих ситуациях, как более подробно описано в настоящем документе.

Таким образом, антитело "человека" или функциональный фрагмент антитела человека определены как антитело или функциональный фрагмент антитела, не являющиеся химерными (например, не являющиеся "гуманизированными") и не полученные (целиком или частично) у не являющихся человеком видов. Антитело или функциональный фрагмент антитела человека может быть получено у человека, или они могут представлять собой синтетическое антитело человека. "Синтетическое антитело человека" определено в настоящем документе как антитело с последовательностью, целиком или частично, полученной in silico из синтетических последовательностей, основанных на анализе известных последовательностей антител человека. Конструирование последовательности антитела человека или его фрагмента in silico можно осуществлять, например, посредством анализа базы данных последовательностей антител или фрагментов антител человека и конструирования полипептидной последовательности с использованием данных, полученных из нее. Другим примером антитела или функционального фрагмента антитела человека является антитело или функциональный фрагмент антитела человека, кодируемые нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения (т.е., такая библиотека основана на антителах, полученных у человека, в качестве природного источника).

"Гуманизированное антитело" или функциональный фрагмент гуманизированного антитела определены в настоящем документе как антитело или функциональный фрагмент антитела, которые (i) получены из не являющегося человеком источника (например, у трансгенной мыши, обладающей гетерологичной иммунной системой), где антитело основано на последовательности зародышевой линии человека; или (ii) являются химерными, где вариабельный домен получен из не являющегося человеком источника, а константный домен имеет человеческое происхождение, или (iii) содержат привитые определяющие комплементарность области (CDR), где CDR вариабельного домена происходят из являющегося человеком источника, тогда как один или несколько каркасов вариабельного домена являются человеческого происхождения и константный домен (если присутствует) является человеческого происхождения.

Как используется в настоящем документе, антитело "специфически связывается с" антигеном, "специфично к" антигену или "специфически распознает" антиген (в настоящем документе MST1R), если такое антитело может различать такой антиген и один или несколько эталонных антигенов, так как специфичность связывания не является абсолютным, но является относительным свойством. В его наиболее общей форме (и когда не приведено определенного указания) "специфическое связывание" относится к способности антитела различать представляющий интерес антиген и неродственный антиген, как определено, например, в соответствии с одним из приведенных ниже способов. Такие способы включают, но ими не ограничиваются, вестерн-блоттинг, тесты ELISA, RIA, ECL, IRMA и пептидное сканирование. Например, можно проводить стандартный анализ ELISA. Оценку можно осуществлять посредством стандартного развития окраски (например, вторичное антитело с пероксидазой хрена и тетраметилбензидин с пероксидом водорода). Реакцию в определенных лунках оценивают по оптической плотности, например, при 450 нм. Обычный фон (=отрицательная реакция) может составлять 0,1 OD; обычная положительная реакция может представлять собой 1 OD. Это означает, что различие положительного/отрицательного может быть более чем 10-кратным. Как правило, определение специфичности связывания проводят с использованием не одного эталонного антигена, а набора приблизительно из трех-пяти неродственных антигенов, таких как порошковое молоко, BSA, трансферрин или т.п.

Однако "специфическое связывание" также может относиться к способности антитела различать антиген-мишень и один или несколько близкородственных антигенов, которые используют в качестве ориентиров, например, MST1R-мишень и семафорин-мишень. Кроме того, "специфическое связывание" может относиться к способности антитела различать различные части его антигена-мишени, например, различные домены или области MST1R, такие как эпитопы в N-концевой или в C-концевой области MST1R-мишени, или один или несколько ключевых аминокислотных остатков или участков из аминокислотных остатков MST1R-мишени.

Также, как используют в настоящем документе, "иммуноглобулин" (Ig) в настоящем документе определен как белок, принадлежащий классу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD (или любому их подклассу), и включает все общеизвестные антитела и их функциональные фрагменты. "Функциональный фрагмент" антитела/иммуноглобулина в настоящем документе определен как фрагмент антитела/иммуноглобулина (например, вариабельная область IgG), который сохраняет антиген-связывающую область. "Антиген-связывающая область" антитела, как правило, находится в одной или нескольких гипервариабельных областях антитела, т.е., в областях CDR-1, -2 и/или -3; однако "каркасные" области вариабельного домена также могут играть важную роль в связывании антигена, такую как обеспечение поддержки для CDR. В различных вариантах осуществления "антиген-связывающая область" содержит по меньшей мере аминокислотные остатки 4-103 вариабельного домена легкой цепи (VL) и 5-109 вариабельного домена тяжелой цепи (VH), аминокислотные остатки 3-107 VL и 4-111 VH, и являются полными цепями VL и VH (положения аминокислот 1-109 VL и 1-113 VH; нумерация по WO 97/08320). Характерный класс иммуноглобулинов для применения в вариантах осуществления, описываемых в настоящем документе, представляет собой IgG. "Функциональные фрагменты" по изобретению включают домен F(ab')₂-фрагмента, Fab-фрагмент и scFv. F(ab')₂ или Fab можно конструировать для минимизации или полного устранения межмолекулярных взаимодействий в виде образования дисульфидных связей, которые происходят между доменами CH1 и CL.

Описываемое в настоящем документе антитело может быть получено из библиотеки рекомбинантных антител, которая основана на аминокислотных последовательностях, сконструированных in silico и кодируемых нуклеиновыми кислотами, полученными синтетически. Конструирование последовательности антител in silico осуществляют, например, с помощью анализа базы данных последовательностей человека и конструируя полипептидную последовательность с использованием данных, полученных из нее. Способы конструирования и получения созданных in silico последовательностей описаны, например, в Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; Krebs et al., J. Immunol. Methods. 254:67-84, 2001; и в патенте США № 6300064, выданном Knappik et al., которые включены в объем настоящей заявки в качестве ссылки в полном объеме.

(Описываемые в настоящем документе антитела)

На всем протяжении настоящего описания, приводится указание на следующие эталонные антитела: "ном. антител" или "LACS" или "MOR" X. MOR X представляет собой антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 или 20 (ДНК)/SEQ ID NO:19 или 21 (белок) и с вариабельной областью легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 24, 26, 28, 30 и 32 (ДНК)/SEQ ID NO:23, 25, 27, 29, 31 и 33 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:22 (ДНК)/SEQ ID NO:23 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:20 (ДНК)/SEQ ID NO:21 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:24 (ДНК)/SEQ ID NO:25 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:26 (ДНК)/SEQ ID NO:27 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:28 (ДНК)/SEQ ID NO:29 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:30 (ДНК)/SEQ ID NO:31 (белок).

В одном из примеров в описании представлено антитело с вариабельной областью тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO:18 (ДНК)/SEQ ID NO:19 (белок), и с вариабельной областью легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO:32 (ДНК)/SEQ ID NO:33 (белок).

В другом аспекте изобретение относится к приведенным ниже антителам.

В одном из примеров в описании представлено антитело, содержащее антиген-связывающую область, содержащую область H-CDR3 (CDR3 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 4; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область H-CDR2 (CDR2 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или 5; и антиген-связывающая область также может содержать область H-CDR1 (CDR1 тяжелой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 или 6. Такое антитело может содержать антиген-связывающую область, содержащую область L-CDR3 (CDR3 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 или 12; антиген-связывающая область может дополнительно содержать область L-CDR1 (CDR1 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 или 15; и антиген-связывающая область также может содержать область L-CDR2 (CDR2 легкой цепи) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или 16.

Изобретение также относится к антителу, содержащему антиген-связывающую область (i) область H-CDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, область H-CDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и область H-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, (ii) область H-CDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, область H-CDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 и область H-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

В одном из вариантов осуществления также представлено антитело, содержащее антиген-связывающую область, выбранную из группы, состоящей из (i) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (ii) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16, (iii) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (iv) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (v) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 или (vi) области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.

В другом варианте осуществления представлено антитело, содержащее антиген-связывающую область, выбранную из группы, состоящей из (i) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (ii) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16, (iii) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (iv) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, (v) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14 и (vi) области H-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, области H-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, области H-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, области L-CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, области L-CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13 и области L-CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14.

В другом аспекте изобретение относится к приведенным ниже антителам.

Один из вариантов осуществления также относится к антителу, содержащему (i) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 или 51; и (ii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO:53, 55, 57, 59, 61 и 63.

Другой вариант осуществления относится к антителу, выбранному из группы (i) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53 (обозначенное как "MOR07919"), (ii) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:55 (обозначенное как "MOR07692"), (iii) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:57 (обозначенное как "MOR07923"), (iv) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:59 (обозначенное как "MOR07924"), (v) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:61 (обозначенное как "MOR07925"), (vi) тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51 и легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:63 (обозначенное как "MOR07926").

В одном из аспектов изобретение относится к антителам с антиген-связывающей областью, которая может специфически связываться с одной или несколькими областями MST1R-мишени с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 или обладает высокой аффинностью к ним. То, что антитело обладает "высокой аффинностью" к антигену указывает, если измерение аффинности составляет по меньшей мере 100 нМ (моновалентная аффинность Fab-фрагмента) в виде K_D. Антитело или антиген-связывающая область, описываемые в настоящем документе, могут связываться с MST1R, например, с аффинностью приблизительно менее 100 нМ, приблизительно менее 60 нМ или приблизительно менее 30 нМ. Дополнительные варианты осуществления включают антитела, которые связываются с MST1R с аффинностью приблизительно менее 10 нМ или приблизительно менее 3 нМ. В частности, выделенные антитела человека или гуманизированные антитела или их функциональные фрагменты, содержащие антиген-связывающую область, которая специфична к частичному пептиду MST1R с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17, где антитело или его функциональный фрагмент обладают аффинностью к частичному пептиду MST1R в виде K_D приблизительно менее 10 нМ, приблизительно менее 5 нМ, приблизительно менее 1 нМ, приблизительно менее 0,5 нМ или приблизительно менее 0,1 нМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Тогда как аффинность к частичному пептиду MST1R в виде K_D приблизительно менее 10 нМ, приблизительно менее 5 нМ, приблизительно менее 1 нМ, приблизительно менее 0,5 нМ или менее 0,1 нМ, как определено посредством титрования равновесия раствора. Например, аффинность описываемого в настоящем документе антитела против MST1R может составлять приблизительно 0,98 нМ или 0,02 нМ (моновалентная аффинность Fab-фрагмента).

В таблице 1 приведены обобщенные данные об аффинности эталонных антител, описываемых в настоящем документе, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) и титрования равновесия раствора (SET):

ТАБЛИЦА 1: Аффинности антител
Антитело (Fab)	BIACORE (Fab) K D [нМ]	SET (Fab) K D [нМ]
MOR07692	0,80	0,25
MOR07919	0,98	0,27
MOR07923	0,07	0,02
MOR07924	0,20	0,03
MOR07925	0,02	0,01
MOR07926	0,13	0,04

Для таблицы 1 аффинность антител MOR X измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) на иммобилизованном рекомбинантном MST1R человека. Исследования Biacore проводили на непосредственно иммобилизованном антигене. Fab-формат MOR X демонстрирует диапазон моновалентной аффинности к иммобилизованному белку MST1R приблизительно от 0,02 и 0,98 нМ с демонстрирующим наибольшую аффинность Fab MOR07925 со следующими Fab MOR07923 и MOR07926. Кроме того, в исследованиях SET Fab-формат MOR X демонстрирует диапазон аффинности приблизительно от 0,01 и 0,27 нМ с демонстрирующим наибольшую аффинность Fab MOR07925 с последующими Fab MOR07923 и MOR07924.

Другой характеристикой описываемых в настоящем документе антител является их специфичность к области в пределах N-концевой области MST1R. Например, описываемые в настоящем документе MOR X могут специфически связываться с N-концевой областью MST1R.

Тип эпитопа с которым связывается антитело, как описано в настоящем документе, может быть линейным (т.е. один последовательный участок аминокислот) или конформационным (т.е. несколько участков аминокислот). Для определения того, является ли эпитоп конкретного антитела линейным или конформационным, специалист в данной области может анализировать связывание антител с перекрывающимися пептидами (например, 13-мерные пептиды с перекрытием 11 аминокислот), покрывающими различные домены MST1R. Анализ ELISA проводили с использованием рекомбинантного частичного пептида MST1R с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17. Так как MOR X не подходил для иммуноблот-анализа для детекции денатурированной формы того же рекомбинантного белка MST1R, то MOR X должен обладать конформационными эпитопами в пределах аминокислотных остатков SEQ ID NO:17.

Описываемое в настоящем документе антитело перекрестно связывается у видов, у людей и по меньшей мере одного другого вида, который может представлять собой, например, обезьяну или мышь. Антитело, которое перекрестно взаимодействует, например, по меньшей мере с яванским макаком, может обеспечивать большую гибкость и преимущества по сравнению с известными антителами против MST1R-мишени для целей проведения исследований in vivo у нескольких видов с одним и тем же антителом.

В одном из вариантов осуществления описываемое антитело не только способно связываться с MST1R, но также способно ингибировать активацию MST1R. Ингибирование рецептора приводит к подавлению свойственной рецептору киназной активности и подавляет передачу сигнала. Такое подавление может происходить, например, вследствие ограничения связывания лиганда с MST1R, изменения конформации MST1R или интернализации MST1R. Более конкретно, описываемое в настоящем документе антитело может опосредовать свой терапевтический эффект с помощью MST1R с помощью антитела-эффекторных функций.

Другой вариант осуществления относится к ингибированию активности MST1R в зависимом от лиганда фосфорилировании MST1R, описываемыми в настоящем документе антителами. Величина IC₅₀ описываемого антитела в зависимой от MSP системе анализа передачи сигнала MST1R, такой как "анализ люциферазы под действием Elk1", составляет по меньшей мере 100 нг/мл, по меньшей мере 50 нг/мл, по меньшей мере 20 нг/мл, по меньшей мере 10 нг /мл или по меньшей мере 5 нг/мл.

Другое описываемое в настоящем документе антитело также ингибирует независимую от лиганда активацию MST1R.

Дополнительное описываемое в настоящем документе антитело также ингибирует фосфорилирование ERK в ответ на лиганд MST1R MSP.

Другое описываемое в настоящем документе антитело также подавляет стимулируемую MSP пролиферацию опухолевых клеток, экспрессирующих MST1R.

(Варианты пептидов)

Антитела, описываемые в настоящем описания, не ограничены конкретными пептидными последовательностями, представленными в настоящем документе. Предпочтительнее также включены варианты этих полипептидов. На основании настоящего описания и общепринятых доступных технологий и источников специалист в данной области способен получать, тестировать и использовать функциональные варианты описываемых в настоящем документе антител, тогда как оценка этих вариантов со способностью подавлять обе/любую из зависимой и/или независимой от лиганда активации MST1R находится в объеме настоящего изобретения.

Вариант может включать, например, антитело, содержащее относительно пептидной последовательности, описываемой в настоящем документе, по меньшей мере одну измененную определяющую комплементарность область (CDR) (гипервариабельную) и/или каркасный (FR) (вариабельный) домен/положение. Для лучшей иллюстрации этой концепции, ниже приведено краткое описание структуры антитела.

Антитело состоит из двух пептидных цепей, где каждая содержит один (легкая цепь) или три (тяжелая цепь) константных домена и вариабельную область (VL, VH), где последняя из них в каждом случае состоит из четырех областей FR и трех расположенных с промежутками CDR. Антиген-связывающий участок формируется одной или несколькими CDR, тогда как области FR обеспечивают структурный каркас для CDR и, таким образом, играют важную роль в связывании антигена. Изменяя один или несколько аминокислотных остатков в области CDR или FR, специалист может обычным способом получать мутантные или разнообразные последовательности антител, которые можно подвергать скринингу относительно антигена, например, на наличие новых или улучшенных свойств.

На фиг. 1 (VH) и фиг. 2: (VL) приведены области CDR и FR (по определению Kabat) для определенных описываемых в настоящем документе антител и проведено сравнение аминокислот в данном положении друг с другом и с соответствующими последовательностями "основного гена" HuCAL (как описано в патенте США № 6300064).

Специалист в данной области может использовать данные на фиг. 1 и фиг. 2 для конструирования вариантов пептидов, которые находятся в объеме вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления варианты конструируют, заменяя аминокислоты в одной или нескольких областях CDR; вариант также может иметь одну или несколько измененных каркасных областей. В отношении сравнения новых антител друг с другом, остатки-кандидаты, которые можно заменять, включают остатки вариабельных областей легких и остатки вариабельных областей тяжелых цепей MOR X. Также изменения можно проводить в каркасных областях. Например, когда существует отличие остатка по сравнению с последовательностью зародышевой линии, можно изменять домен FR пептида.

Что касается сравнения новых антител с соответствующей консенсусной последовательностью или последовательностью "основного гена", остатки-кандидаты, которые можно изменять, включают остатки вариабельной области легкой цепи MOR X, такие как остатки VLλ3, и включают остатки вариабельной области тяжелой цепи MOR X, такие как остатки VH3. Альтернативно, специалист может провести такой же анализ, сравнивая аминокислотные последовательности, описываемые в настоящем документе, с известными последовательностями того же класса таких антител с использованием, например, способа, описываемого в Knappik et al. (J. Mol. Biol. 296, 57-86, 2000) и в патенте США № 6300064, выданном Knappik et al.

Кроме того, варианты могут быть получены с использованием одного из MOR X в качестве начальной точки для оптимизации с помощью изменения одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности MOR X, предпочтительно, аминокислотных остатков в одной или нескольких CDR, и с помощью скрининга полученного множества вариантов антител на варианты с улучшенными свойствами. Изменение одного или нескольких аминокислотных остатков в CDR-3 VL, CDR-3 VH, CDR-1 VL и/или CDR-2 VH можно проводить с помощью синтеза множества молекул ДНК с использованием технологии тринуклеотидного мутагенеза (TRIM) (Vimekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., and Moroney S.E. (1994) "Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis." Nucl. Acids Res. 22, 5600).

(Варианты с консервативными аминокислотами)

Можно получать варианты полипептидов, которые сохраняют общую молекулярную структуру пептидной последовательности антитела, описываемого в настоящем документе. Учитывая свойства отдельных аминокислот, специалисту очевидны некоторые обоснованные замены. Замены аминокислот, т.е., "консервативные замены", можно проводить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера рассматриваемых остатков.

Например, (a) неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; (b) полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (c) положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и (d) отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Как правило, замены можно проводить в пределах групп (a)-(d). Кроме того, глицин и пролин можно заменять друг на друга на основе их способности разрушать α-спирали. Подобным образом, определенные аминокислоты, такие как аланин, цистеин, лейцин, метионин, глутаминовая кислота, глутамин, гистидин и лизин более часто находятся в α-спи