Способ получения антимикробного средства из надземной части черемши

Способ получения антимикробного средства из надземной части черемши

Реферат

Изобретение относится к медицине и касается способов получения препаратов из растительного сырья - лука медвежьего (Allium ursinum L.) и лука победного (Allium victoriale L.) (черемши), семейство луковые (Alliaceae Juss.), которое может быть использовано в качестве антимикробного средства.

Известны фитонцидные антибактериальные средства, полученные на основе растительного сырья (растений): спиртовая настойка из репчатого лука («Аллилчеп») [Регистр лекарственных средств России. / Под ред. Ю.Ф.Крылова.- М.: Инфармхим, 1993. - С.164.], таблетки с порошком чеснока «Алисат», жидкий спиртовый экстракт чеснока «Аллилсат» и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства: справочное издание, 15-е изд., перераб., испр. и доп. / Машковский М.Д. - М.: Новая волна, 2006 - С.962]. Наиболее близким прототипом является жидкий спиртовый экстракт чеснока «Аллилсат», используемый как фунгицидное, противомикробное, антигельминтное, бактериостатическое средство и др.

Способ получения жидкого спиртового экстракта чеснока «Аллилсат» заключается в следующем: луковицы чеснока очищают от чешуек и измельчают в мясорубке. 34,6 кг чесночной массы помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают 52 л 90% спирта этилового и настаивают 72 часа при комнатной температуре. Полученную вытяжку сливают, в перколятор наливают вторую порцию спирта в количестве 24 л и настаивание повторяют еще раз. По истечении 72 часов вытяжку сливают и настаивание повторяют в третий раз с 24 л экстрагента. По истечении 72 часов и слива вытяжки мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют ко всем вытяжкам, собранным в общий отстойник. Отстоявшуюся в течение 48 часов вытяжку переводят в смеситель с якорной мешалкой, добавляют по 0,228 кг эфирных масел (тминное, укропное и мятное по 0,3%), перемешивая смесь в течение часа с якорной мешалкой. По окончании перемешивания аллилсат фильтруют. Определяют содержание сухого остатка и спирта в экстракте [Муравьев И.А. Технология лекарств: В 2-х Т. / Муравьев И.А. - М., 1980. - Т.1. - С.212-213].

Перечень вытяжек для внутреннего применения, получаемых из растительного сырья вида Allium, обладающих антибактериальным действием, ограничен. Недостатками экстракта чеснока «Аллилсат» являются: продолжительность экстрагирования (216 часов), умеренная антимикробная активность. Вместе с тем, перечень препаратов, обладающих антибактериальным действием, ограничен из-за отсутствия соответствующей базы растений. Следовательно, расширение арсенала препаратов, характеризующихся антибактериальным действием, является актуальной задачей.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения средства из надземной части свежесобранной черемши (лука медвежьего - Allium ursinum l. или лука победного - Allium victoriale, семейство луковые - Alliaceae) с продолжительностью экстрагирования 12 часов, характеризующегося высокой антибактериальной активностью.

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука медвежьего - Allium ursinum L. или лука победного - Allium victoriale L. семейство луковые (Alliaceae)) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор. Сырье заливают спиртом этиловым 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают при комнатной температуре 4 часа. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз при комнатной температуре 4 часа. Затем полученную вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз со спиртом этиловым 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз при комнатной температуре 4 часа. Вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки. Экстракт отстаивают в течение 48 ч и проверяют содержание сухого остатка. Водно-спиртовые экстракты черемши представляют собой прозрачные жидкости от светло- до темно-зеленого цветов, с характерным чесночным запахом и жгучим вкусом.

Полученные экстракты исследовали на противомикробную активность.

Результаты эксперимента представлены в примерах 1-6. Применение в качестве экстрагента спирта этилового 40%, 70%, 90% гарантирует максимальную экстракцию действующих веществ. Температурный режим, продолжительность экстракции и экстрагент выявлены экспериментально и гарантируют оптимальность технологического процесса.

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука медвежьего - Allium ursinum L.) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают спиртом этиловым 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают 4 часа при комнатной температуре. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз. По истечении четырех часов вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л). По истечении четырех часов вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками в отстойнике. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки.

Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г. Полноту извлечения контролируют по содержанию суммы окисляемых соединений и содержанию сухого остатка (3,26%).

Пример 2

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука медвежьего - Allium ursinum L.) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают спиртом этиловым 70% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают 4 часа при комнатной температуре. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 70% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз. По истечении четырех часов вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л). По истечении четырех часов вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками в отстойнике. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки. Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г. Полноту извлечения контролируют по содержанию суммы окисляемых соединений и содержанию сухого остатка (2,83%).

Пример 3

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука медвежьего - Allium ursinum L.) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают спиртом этиловым 90% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают 4 часа при комнатной температуре. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 90% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз. По истечении четырех часов вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л). По истечении четырех часов вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками в отстойнике. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки. Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г. Полноту извлечения контролируют по содержанию суммы окисляемых соединений и содержанию сухого остатка (2,15%).

Пример 4

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука победного Allium victoriale L.) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают спиртом этиловым 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают 4 часа при комнатной температуре. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 40% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз. По истечении четырех часов вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л). По истечении четырех часов вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками в отстойнике. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки.

Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г. Полноту извлечения контролируют по содержанию суммы окисляемых соединений и содержанию сухого остатка (2,13%).

Пример 5

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука победного Allium victoriale L.) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают спиртом этиловым 70% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают 4 часа при комнатной температуре. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 70% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз. По истечении четырех часов вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л). По истечении четырех часов вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками в отстойнике. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки. Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г. Полноту извлечения контролируют по содержанию суммы окисляемых соединений и содержанию сухого остатка (2, 25%).

Пример 6

100 кг надземной части свежесобранной черемши (лука победного Allium victoriale L.) измельчают в мясорубке и помещают в герметически закрывающийся перколятор, заливают спиртом этиловым 90% в соотношении сырье-экстрагент 1:1,5 (150 л) и настаивают 4 часа при комнатной температуре. Затем полученную вытяжку сливают. В перколятор заливают вторую порцию спирта этилового 90% в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л) и настаивание повторяют еще раз. По истечении четырех часов вытяжку сливают. Настаивание повторяют в третий раз в соотношении сырье-экстрагент 1:0,75 (75 л). По истечении четырех часов вытяжку сливают, соединяют с первой и второй вытяжками в отстойнике. Мезгу отжимают в прессе и отжим присоединяют к вытяжкам, собранным в общий отстойник, получают 385 л вытяжки. Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г. Полноту извлечения контролируют по содержанию суммы окисляемых соединений и содержанию сухого остатка (2,11%).

При изучении антимикробных свойств целевого продукта изучали:

1) экстракты черемши (лука медвежьего - Allium ursinum L.) спиртовые жидкие, полученные с использованием 40%, 70%, 90% спирта этилового,

2) экстракты черемши (лука победного - Allium victoriale L.) спиртовые жидкие, полученные с использованием 40%, 70%, 90% спирта этилового,

3) экстракт чеснока жидкий спиртовый «Аллилсат».

При исследовании антимикробной активности целевого продукта использовали метод, основанный на способности лекарственных веществ диффундировать в агар, зараженный тест-культурами микроорганизмов, и подавлять рост последних [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. Биргера М.О. - М.: Медицина, 1982. - С.172-177.].

Определение активности изучаемых экстрактов проводили в 3-х чашках Петри одинакового диаметра с плоским дном. В чашки, устанавливаемые горизонтально, наливали по 15 мл расплавленного питательного агара. Слой агара в чашке Петри заливали 1-2 мл взвеси испытуемого микроба в физиологическом растворе. Затем излишек взвеси полностью удаляли, подсушивали поверхность агара в течение 30 минут. Затем сверлом (6 мм диаметром) пробуравливали 6 отверстий («колодцев») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга, «колодцы» заполняли образцами экстрактов и растворителем в соответствующей концентрации (контроль). Чашки оставляли при комнатной температуре на 30 минут, после чего их ставили в термостат при температуре 37°С, не переворачивая, строго горизонтально, чтобы получить круглые зоны. Под крышки чашки Петри помещали стерильный фильтр во избежание попадания конденсата на лунки. Зоны угнетения измеряли через 16 часов. Оценка результатов проводилась по диаметру зон задержки роста вокруг «колодца», включая диаметр самого «колодца»:

- отсутствие зоны задержки роста - испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации препарата;

- диаметр зоны задержки роста 10 мм - умеренная чувствительность культуры к данной концентрации препарата;

- диаметр зоны задержки роста более 10 мм - высокая чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации препарата.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Результаты исследований, представленные в таблице 1, показывают, что экстракты черемши (лука медвежьего - Allium ursinum L.), полученные с использованием 40%, 70%, 90% спирта этилового, и экстракты черемши (лука победного - Allium victoriale L.).), полученные с использованием 40%, 70%, 90% спирта этилового, обладают: выраженным антимикробным действием в отношении грамположительных кокков рода Staphylococcus: Staphylococcus aureus (209); Staphylococcus aureus (Type); Staphylococcus epidermidis Wood - 46, Salmonella gallinarum; Escherichia coli 055; спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus: Bacillus anthracoides - 96; Bacillus anthracoides; Bacillus subtilis, а также Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris (табл.1).

Контроль, жидкий экстракт чеснока «Аллилсат», показал умеренное антимикробное действие в отношении Staphylococcus aureus (209); Staphylococcus aureus (Type); Staphylococcus epidermidis Wood - 46, Salmonella gallinarum; Escherichia coli 055; Bacillus anthracoides - 96; Bacillus anthracoides; Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris (табл.1).

Таблица 1
Результаты антибактериального действия экстрактов черемши
Экстрагент	Время экстрагирования на каждой ступени экстракции, ч	Диаметр зоны задержки роста тест-культур микроорганизмов, мм
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
	Экстракт черемши (лук медвежий)
40%	4	32	30	33	32	28	25	28	29	32	28	29
70%	4	22	18	12	14	13	12	15	14	19	12	14
90%	4	10	10	10	10	12	13	17	15	17	11	13
	Экстракт черемши (лук победный)
40%	4	31	29	32	33	29	26	27	28	31	29	30
70%	4	23	18	12	13	12	12	14	13	18	12	13
90%	4	11	11	11	11	13	14	18	16	18	12	14
	Контроль (экстракт чеснока «Аллилсат»)
90%	72	9	9	9	9	9	9	10	10	10	10	10
Тест-культуры: 1. Staphylococcus aureus (209); 2. Staphylococcus aureus (Type); 3 Staphylococcus epidermidis Wood-46; 4 Escherichia coli 675; 5. Escherichia coli 055; 6. Bacillus subtilis L2; 7. Bacillus anthracoides - 96; 8. Bacillus anthracoides - 2; 9. Salmonella gallinarum; 10. Pseudomonas aeruginosa; 11. Proteus vulgaris.

1. Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью, характеризующийся тем, что надземную часть свежесобранного лука медвежьего (Allium ursinum L.) измельчают до кашицеобразного состояния, заливают спиртом этиловым 40%, или 70%, или 90%, настаивают трехкратно, по 4 часа при комнатной температуре, при соотношении сырье-экстрагент: при первой экстракции 1:1,5, второй экстракции 1:0,75, третьей экстракции 1:0,75, после каждой экстракции извлечения сливают, полученные извлечения объединяют.

2. Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью, характеризующийся тем, что надземную часть свежесобранного лука победного (Allium victoriale L.) измельчают до кашицеобразного состояния, заливают спиртом этиловым 40%, или 70%, или 90%, настаивают трехкратно, по 4 часа при комнатной температуре, при соотношении сырье-экстрагент: при первой экстракции 1:1,5, второй экстракции 1:0,75, третьей экстракции 1:0,75, после каждой экстракции извлечения сливают, полученные извлечения объединяют.