Способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы

Способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы

Реферат

Изобретение относится к химии природных соединений, в частности к способу приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы, и может найти свое применение в производстве вискоэластиков для офтальмологии.

Известна фармацевтическая композиция на основе гликозаминогликанов, в частности глазные капли, действующими веществами которых являются гликозоаминогликаны в количестве 0.1 мас.% в физиологическом растворе, выделенные из плаценты человека (патент РФ 2216331, МКИ⁷ A61K 31/726, A61K 9/08, A61F 9/00, A61P 27/00). Данные гликозоаминогликаны представляют собой смесь, состоящую из гиалуроновой кислоты (46-57%) и гепарина с гепарансульфатом (2-7%).

Известен протектор эндотелия роговицы «Визитон-1», содержащий сульфатированные гликозоаминогликаны, производное целлюлозы, буферные соли и воду (патент РФ 2114587, МКИ⁶ A61F 9/00, A61K 31/715), предназначенный для защиты эндотелия роговицы от повреждения при экстракции катаракты с имплантацией ИОЛ.

Известен препарат "Глекомен", содержащий сульфатированные гликозоаминогликаны и ионы меди (патент РФ №215158 от 28.10.1999 г.), предназначенный для активации пролиферации эндотелия роговицы.

Одним из лучших вискоэластиков является раствор натрия гиалуроната в сбалансированном солевом буфере. В мировой практике широко применяются следующие вискоэластичные протекторы на основе натрия гиалуроната: "Vislube" (Chemedica AG, Германия); "Amvisc", "Amvisc plus" (Chiron vision, Франция); "Oculocrom" (Croma Pharma GmbH, Австрия); "Healon" (Pharmacia & Upjohn, Швеция).

Однако все перечисленные вискоэластики не включают в свой состав вещества, способные нормализовать биохимические процессы в стекловидном теле, кроме того, они мало доступны из-за высокой стоимости.

Известна фармацевтическая композиция, содержащая водорастворимую смесь гликозоаминогликанов, выделенных из роговицы глаз крупного рогатого скота, в которых гликозоаминогликаны взяты в количестве 0,1-1,0 мас.%, остальное - физиологический раствор (патент РФ 2062079, МКИ⁶ A61F 9/06).

Недостатком этой фармацевтической композиции на основе гликозоаминогликанов является то, что она имеет ограниченный срок хранения, требует определенной осторожности при хранении и транспортировке.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому техническому решению является способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы (Патент RU №2234310, опубл. 20.08.2004). Фармацевтическую композицию готовят: 2,0 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (источник получения - бактериальная ферментация, фирма "Sigma-Aldrich", США) растворяют в 98,0 мл фосфатного буферного раствора с pH 7,0-7,4. Растворение ведется при температуре 20°C в течение 48 часов. В процессе растворения раствор подвергают двукратному перемешиванию в течение 8 часов. Получают раствор с вязкостью 290 Па/с. Раствор подогревают на водяной бане до 70°C, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 2,0 мкм, расфасовывают в стеклянные шприцы по 1 мл и автоклавируют при 120°C в течение 8 минут. Получают стерильный раствор с вязкостью 85 Па/с.

Недостатком такого способа приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы является то, что не обеспечивают нормализацию биохимических процессов в стекловидном теле.

Технический результат изобретения - восстановление биохимических процессов в эндотелиальном слое роговицы при постоянном увлажнении роговицы глаза и повышение биосовместимости, что способствует быстрой реабилитации после травм и/или оперативного лечения.

Задача решается тем, что в способе приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы, включающем растворение исходного терапевтического компонента с избыточной вязкостью в фосфатном буфере, фильтрацию и стерилизацию до получения требуемого значения вязкости, в качестве исходного терапевтического компонента используют 3% раствора нативной гиалуроновой кислоты, после растворения вводят 1% пептидного комплекса, состоящий из короткоцепочных пептидов - олигопептидов, а стерилизацию проводят ионизирующим излучением в диапазоне радиационного излучения от 78×10⁷ до 11×10⁸ Мрад.

Для деструкции гиалуроновой кислоты применяли γ-излучение в диапазоне от 78×10⁷ до 11×10⁸ Мрад, что позволило получить гиалуроновую кислоту с молекулярной массой (M_w) 40-80 кДа. При этом воздействие на водный раствор гиалуроновой кислоты γ-излучения до 78×10⁷ Мрад не позволяет получить низкомолекулярную гиалуроновую кислоту, а воздействие выше 11×10⁸ Мрад вызывает полное разрушение ГК, что и в том, и в другом случае ведет к отсутствию лечебного эффекта, так как повышенная вязкость протектора может вызывать катаракту, а полное разрушение ГК не дает лечебного эффекта.

Способ осуществляют следующим образом. Готовят 3% раствор нативной гиалуроновой кислоты. Гиалуроновую кислоту разводят в 100 мл фосфатного буферного раствора с pH 7,0-7,4. Получают раствор с вязкостью 300 Па/с. Добавляют 1% пептидного комплекса, состоящего из короткоцепочных пептидов - олигопептидов, состав которых представлен в таблице 1.

Таблица 1
Исследуемые параметры	Хим. формула	Масса	Дельта массы в нанопотоковом режиме	Масса в отн.ед.
GlyTrpIle	C19H26N4O4	374.19541	-2.33	10.692
IleAspIle	C16H29N3O6	359.20564	12.97	8.674
PheArgPro	C20H30N6O4	418.23285	-0.29	9.024
GlnHisHis	C17H24N8O5	420.18697	-5.74	17.732
AlaTrpLys	C20H29N5O4	403.22195	-5.76	8.934
ProHisTyr	C20H25N5O5	415.18557	-11.10	14.407
ThrTrpTrp	C26H29N5O5	491.21687	-12.84	9.460
LysPheThr	C19H30N4O5	394.22162	-7.25	8.854
LysArgMet	C17H35N7O4S	433.24712	10.73	9.102
PheCysMet	C17H25N3O4S2	399.12865	4.19	11.108
IleIle	C12H24N2O3	244.17869	8.67	11.038
AspLysLys	C16H31N5O6	389.22743	16.59	8.863
TrpPro	C16H19N3O3	301.14264	-18.38	10.672
GluThr	C9H16N2O6	248.10084	3.47	5.500
Desmosine	C24H40N5O8	526.28769	-15.37	9.523

Как видно из таблицы 1, пептидные комплексы имеют различный аминокислотный состав с варьирующей молекулярной массой 244-459 кДа. В обнаруженных пептидах превалируют алифатические (лейцин, изолейцин, аланин, глицин) и полярные незаряженные аминокислотные остатки: треонин, пролин, гистидин, серина, также полярные заряженные аминокислотные остатки: аргинин, глутамин, аспарагин, лизин, аргинин. Кроме того, присутствуют димеры изолейцинов, и полимерные трипептиды, в том числе пептиды, содержащие ароматические аминокислотные остатки (триптофан) и полярные незаряженные аминокислотные остатки.

Важно, что в пептидной фракции присутствует десмозин (аминокислота, производная лизина). Благодаря своей разветвленной структуре, которая имеет четыре аминокислотные группы, одна молекула десмозина может входить одновременно в четыре пептидные цепи. Благодаря этому дисахаридные остатки деструктурированной гиалуроновой кислоты стабилизируются и не образуют вновь макромолекулярные комплексы в процессе стерилизации ионизирующим излучением.

Далее раствор подогревают на водяной бане до 70°C, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 2,0 мкм, расфасовывают в стеклянные шприцы по 1 мл и стерилизуют радиационным методом по ГОСТ Р ISO 11137 в центре радиационной медицины (г. Москва) в диапазоне гамма излучения от 78×10⁷ до 11×10⁸ Мрад. Стерилизацию проводят ионизирующим излучением, вследствие чего вязкость раствора снижается, происходит деструкция гиалуроновой кислоты в свою очередь входящие в состав препарата пептиды стабилизируют гиалуроновую кислоту. Получают стерильный раствор с вязкостью 90 Па/с.

Стерилизацию ионизирующим излучением проводят в диапазоне радиационного излучения от 78×10⁷ до 11×10⁸ Мрад, т.к. при этом снижается молекулярная масса и вязкость раствора, что отражено в таблице 2, где показана зависимость параметров сред немассовой молекулярной массы (M_w) от поглощенной дозы радиационного излучения.

Таблица 2
Доза, Мрад	Mw, кДа	Статистическая вязкость водного раствора ГК, дл/г
0	1800	21,0
78×107	180	8,5
11×108	150	5,2
18×108	90	1,3

Для изучения влияния созданного препарата, содержащего пептидный комплекс, на роговицу и другие структуры переднего отрезка глаза, на базе вивария Оренбургского государственного университета проведены экспериментальные исследования на 12 кроликах (24 глаза) породы Шиншилла с использованием ранее разработанных стандартных токсико-гигиенических методов изучения полимерных материалов для внутриглазного использования. Для этого все кролики были поделены на 2 группы: контрольную группу (6 кроликов), использующую препарат по прототипу, и вторую группу из 6-ти кроликов, которым применяли препарат вискоэластичный протектор эндотелия роговицы. Для контрольной группы животных применяли вископротектор "Вискомет", представляющий собой раствор гидроксипропилметилцеллюлозы (производитель - Юнимед Технолоджис Лтд., Индия). В переднюю камеру глаз вводили препараты в количестве 0,2 мл.

Были поставлены 3 серии эксперимента. Исследование выполнено совместно с д.м.н., профессором Нотовой С.В.

1. Биопроба - введение препарата в переднюю камеру глаза кролика с последующей биомикроскопией.

Исследования проводились на 12 животных. Биомикроскопия проводилась через 24 часа после введения препаратов. Воспалительной реакции или каких-либо признаков раздражения не наблюдалось. Конъюктива оставалась спокойной, без инъекции сосудов. Роговица была прозрачной, блестящей, зеркальной. Влага передней камеры прозрачна. Радужка рельефна. Имплантированный материал интактен. Отека эпителия роговицы, преципитации и гиперемии не наблюдалось. Разницы между опытом и контролем не отмечено.

2. Для исследования эндотелиального слоя роговицы применяли контактный зеркальный эндотелиальный микроскоп "TOPCON SP-3000P". Исследования эндотелия роговицы кроликов проводились через 3, 7, 14, и 30 дней после введения препаратов.

Экспериментальные исследования эндотелиального пласта роговицы животных свидетельствовали об отсутствии качественных и количественных изменений эндотелиальных клеток и об идентичности микроскопической картины на опытных и контрольных глазах кроликов. Количество эндотелиальных клеток составило в среднем 3035±20 кл/мм, что соответствует среднестатистической норме.

3. Патогистологическое изучение глаз опытных и контрольных кроликов в сроки 3 и 30 дней после введения "Вискомет" и разработанного препарата вискоэластичного протектора эндотелия роговицы в переднюю камеру показало, что во всех глазах роговица оставалась без изменений, эпителий ее сохранился на всем протяжении, параллельность роговичных коллагеновых пластин и клеточных элементов не нарушена. Десцеметова оболочка хорошо выражена на всем протяжении, слой эндотелиальных клеток без патологических изменений.

Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ позволяет получить эффективный биосовместимый стерильный вискоэластичный протектор с заданной вязкостью. Изобретение обеспечивает нормализацию биохимических процессов в стеловидном теле (за счет входящих в состав пептидов), предупреждает тяжелые осложнения, быструю реабилитацию после операций (за счет содержания деструктурированной гиалуроновой кислоты), препарат способен длительное время пребывать в глазу, а при необходимости легко вымывается, не токсичен.

Способ приготовления вискоэластичного протектора эндотелия роговицы, включающий растворение исходного терапевтического компонента с избыточной вязкостью в фосфатном буфере, фильтрацию и стерилизацию до получения требуемого значения вязкости, отличающийся тем, что в качестве исходного терапевтического компонента используют 3% раствора нативной гиалуроновой кислоты, после растворения вводят 1% пептидный комплекс, состоящий из аминокислоты десмозин и следующих короткоцепочных пептидов-олигопептидов: GlyTrpIle; IleAspIle; PheArgPro; GlnHisHis; ProHisTyr; ThrTrpTrp; LysPheThr; LysArgMet; PheCysMet; IleIle; AspLysLys; TrpPro; GluThr, а стерилизацию проводят ионизирующем излучением в диапазоне радиационного излучения от 78×10⁷ Мрад до 11×10⁸ Мрад.