Устройство для полимеразной цепной реакции

Устройство для полимеразной цепной реакции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для использования при проведении ПЦР-исследований.

Недавние достижения в области биоаналитических микрожидкостных микрочипов делают все более реальным их применения в медицине и биологии в виде портативных микролабораторий, так называемых «лабораторий на чипе» (Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B: Chemical. - 1990. - Vol.1. - P.244-248).

Синонимы «лабораторий на чипе» - micro total analysis system (µ-TAS), microelectromechanical system (MEMS) (Chen J., Chen D., Yuan Т., Chen X. Microfluidic PCR Chips // Nano biomedicine and engineering. - 2011. - Vol.3, №4. - P.203-210).

Большинство медико-биологических анализов - это добавление и удаление жидких реактивов во время проведения диагностического теста. Управление в микрочипе микрообъемами жидкостей из различных резервуаров, смешивание в микрореакторах, разделение, перемещение по каналам, контроль за каждым из этапов перемещения, детекция результатов, преобразование данных в процессоре, отображение результатов на мониторе компьютера повторяет в миниатюре все то, что делает лаборант в процессе проведения диагностического теста в лаборатории. То есть весь лабораторный процесс проходит на чипе размером 1-2 см². Малые объемы регентов, соответственно низкая себестоимость, сокращение времени проведения анализа, высокая точность, все это привлекает исследователей для разработки чипов в диагностике биохимических и клинико-биологических анализов (DeMello A.J. Control and detection of chemical reactions in micro-fluidic systems // Nature. - 2006. - Vol.442, №7101. - P.394-402; Baek S.H., Chang W.J., Baek J.Y., Yoon D.S., Bashir R., Lee S.W. Dielectrophoretic technique for measurement of chemical and biological interactions // Analytical chemistry. - 2009. - Vol.81, №18. - P.7737-7742; Dittrich P.S., Manz A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery // Nature reviews. Drug discovery. - 2006. - Vol.5, №3. - P.210-218).

Малые объемы жидкостей, их уникальное поведение в микрообъемах, позволяет четко контролировать концентрации реагентов, удешевляет анализ, ускоряет процесс проведения анализа, снижает количество загрязнений окружающей среды, позволяет проводить анализ вне централизованных лабораторий.

ПЦР - один из самых важных методов в диагностике и один из самых удобных методов для микрочипирования. Первый чип для ПЦР был предложен в 1993 году (North-up M.A., Ching M.T., White R.M., Watson R.T. DNA amplification in a microfabricated reaction chamber // «Transducers '93», Seventh International Conference on Solid State Sensors and Actuators, Yokohama, Japan. - New York: IEEE, 1993. - P.924-927). С тех пор были созданы различные варианты микрофлюидных чипов для ПЦР (Chen J., Chen D., Yuan Т., Chen X. Microfluidic PCR Chips // Nano biomedicine and engineering. - 2011. - Vol.3, №4. - P.203-210).

Типичный микрофлюидный чип для ПЦР состоит из трех температурных зон (денатурация, элонгация, отжиг) и микрокапиллярного канала, в котором ПЦР-смесь проходит через эти зоны.

В микрочиповой системе для ПЦР увеличивается однородность распределения температуры, снижается время поддержания температур на стадиях синтеза и денатурации ДНК и сокращается количество циклов со стандартных 35-45 до 20-25, что ускоряет проведение ПЦР и увеличивает аналитическую чувствительность метода (Fuchiwaki Y., Saito M., Wakida S., Tamiya E., Nagai H. Ultra-fast and highly-efficient flow-through PCR microfluidics using vapor pressure and its application to rapid field detection // 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. 3-7 October 2010, Groningen, The Netherlands // Micro Total Analysis Systems. - 2010. - Vol.1. - P.148-150).

В чипах применяются следующие способы продвижения жидкости (Chen J., Chen D., Yuan Т., Chen X. Microfluidic PCR Chips // Nano biomedi-cine and engineering. - 2011. - Vol.3, №4. - P.203-210; RU 2432205, B01L 3/00, G01N 33/487).

1. Движение обеспечивается давлением, создаваемым механическим насосом или сжатым газом.

2. Электрокинетический способ.

3. Центрифугирование.

4. Воздействие внешним магнитным полем.

5. Термально-конвекционно управляемый чип, основанный на принципе Rayleigh-Benard конвекции.

Недостатками этих аналогов являются необходимость использования дополнительного внешнего блока, создающего условия для продвижения и смешивания компонентов реакций, а также необходимость герметизации этих компонентов и необходимость синхронизации работы различных блоков при увеличении числа внешних факторов, от которых зависит качество проведения реакции, что усложняет устройство.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения - прототипом - является устройство для осуществления молекулярно-биологической реакции (в том числе ПЦР или ПЦР в реальном времени), в котором отдельные необходимые компоненты реакции находятся в месте реакции, но пространственно отделены друг от друга перед реакцией на носителе. Согласно формуле прототипа твердый носитель является пористым носителем, предпочтительно пористым фильтром. Реакции с применением данного носителя согласно описанию прототипа могут проводиться с помощью известных способов в отдельной емкости с использованием другого устройства после растворения сорбированных на носителе реактивов в буфере, который не включен в прототип (WO 2012010708, C12Q 1/68).

Основным недостатком прототипа является невозможность достижения технического результата - проведения в одном устройстве этапов выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующей ПЦР с детекцией результатов реакции.

Главной задачей, решаемой заявляемым техническим решением, является проведение в одном устройстве этапов выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующей ПЦР с детекцией результатов реакции при упрощении устройства.

Поставленная задача реализуется за счет того, что устройство для полимеразной цепной реакции состоит из, по крайней мере, четырех частей, каждая из которых имеет две плоские, параллельные поверхности, перпендикулярные общей оси, относительно которой части могут поворачиваться относительно друг друга, и отверстия, при этом первая часть имеет, по крайней мере, шесть сквозных отверстий, соединяющих две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, четыре отверстия снабжены гидрофильными фильтрами, контактирующими с плоской поверхностью второй части, вторая часть выполнена с, по крайней мере, двумя сквозными отверстиями, соединяющими две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, одно отверстие содержит сорбент, зафиксированный гидрофильными фильтрами, контактирующими с плоскими поверхностями первой и третьей частей, третья часть имеет, по крайней мере, два сквозных отверстия, соединяющих две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, одно отверстие содержит гидрофильный фильтр, контактирующий с плоскими поверхностями второй и четвертой частей, и, по крайней мере, три несквозных отверстия, содержащих гидрофильные фильтры, контактирующие с плоской поверхностью второй части, а четвертая часть выполнена с, по крайней мере, одним несквозным, оптически прозрачным отверстием, содержащим гидрофильный фильтр, контактирующий с плоской поверхностью третьей части, не контактирующий с дном отверстия его содержащим.

Количество отверстий, фильтров, сорбентов и реактивов для амплификации и детекции нуклеиновых кислот в частях заявляемого устройства может быть увеличено при увеличении количества анализируемых биологических объектов, и/или при увеличении количества проводимых в устройстве мультиплексных ПНР и/или униплексных (симплексных) ПЦР, и/или при увеличении числа этапов очистки нуклеиновых кислот. Дополнительную очистку нуклеиновых кислот также может обеспечить увеличение числа частей устройства.

В основу заявляемого изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков - это подобранное последовательное расположение в частях устройства отверстий, гидрофильных фильтров и сорбента, которое: во-первых, дает возможность проводить в устройстве этапы выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующих мультиплексных ПЦР и/или униплексных (симплексных) ПЦР с детекцией результатов реакции; во-вторых, обеспечивает без использования дополнительного внешнего блока условия для продвижения и смешивания компонентов реакций в результате пропитывания (в том числе поочередного) фильтров жидкими компонентами; в-третьих, дает возможность изменять количества используемых жидких компонентов, что предотвращает высыхание фильтров во время реакции, просачивание жидкостей между плоскими поверхностями и таким образом исключает необходимость герметизации компонентов.

Предлагаемое в качестве изобретения техническое решение апробировано в различных вариантах в лаборатории иммунологии и вирусологии, группе молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института медицинской приматологии Российской академии медицинских наук.

Сущность заявляемого технического решения поясняется чертежами варианта устройства для проведения анализа одного биологического объекта с использованием одной мультиплексной или униплексной (симплексной) ПНР, где:

1, 2, 3 и 4 - части устройства;

5, 6, 7, 8, 12, 14, 15, 16, 17, 18 и 20 - гидрофильные фильтры, содержащиеся в отверстиях устройства;

9, 10, 11 и 19 - отверстия в частях устройства, не содержащие фильтров;

13 - сорбент, содержащийся в отверстии части 2 устройства;

21 - несквозное, оптически прозрачное отверстие, в открытом конце которого содержится гидрофильный фильтр 20, не контактирующий с дном отверстия его содержащим;

22 - общая ось четырех частей устройства.

На фиг.1 показан вариант последовательности исходного расположения отверстий 9, 10, 11, 19, не содержащих фильтры, отверстия 21,частично содержащего фильтр 20, фильтров 5, 6, 7, 8, 12, 14, 15, 16, 17, 18 и 20 и сорбента 13 в частях 1, 2, 3 и 4 устройства.

На фиг.2 показан вариант схематичного внешнего вида устройства с общей осью 22 частей 1, 2, 3 и 4 и с возможным исходным расположением видимых, не содержащих фильтров отверстий 9 и 10 и фильтров 5, 6, 7 и 8 части 1.

На фиг.3 показан вариант схематичного внешнего вида устройства с общей осью 22 частей 2, 3 и 4 и с возможным исходным расположением видимого, не содержащего фильтра отверстия 11 и видимого фильтра 12 части 2.

На фиг.4 показан вариант схематичного внешнего вида устройства с общей осью 22 частей 3 и 4 и с возможным исходным расположением видимого, не содержащего фильтра отверстия 19 и видимых фильтров 15, 16, 17 и 18 части 3.

На фиг.5 показан вариант схематичного внешнего вида части 4 устройства с возможным исходным расположением видимого фильтра 20.

При этом все фильтры и сорбент содержатся в отверстиях. Фильтр 20 включает высушенные реактивы для амплификации и детекции нуклеиновых кислот, которые могут быть включены только в часть фильтра.

Предпочтительными являются варианты устройства, в которых при поворачивании их частей отверстие 10 совмещается только с отверстием 11, отверстие 11 совмещается только с отверстием 10 и отверстием 19, отверстие 19 совмещается только с отверстием 11 и фильтром 20.

Приведенные на схемах конфигурация (форма) и пропорциональное соотношение размеров частей, отверстий, фильтров и сорбента заявляемого устройства обусловлены необходимостью информативного описания общих принципов его работы и не предназначены для практического использования.

Приведенный вариант устройства показывает конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивает объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Из патентно-технической литературы и практики ПЦР-исследований не известно об устройстве для полимеразной цепной реакции, которое было бы идентично заявляемому.

Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - проведения в одном устройстве этапов выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующей ПЦР с детекцией результатов реакции при упрощении устройства. Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемое устройство может быть реализовано многократно, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется на следующем примере, показывающем возможность проведения в описанном выше варианте заявляемого устройства этапов выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующей ПЦР с детекцией результатов реакции. При этом приведенный пример устройства показывает конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивает объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

До начала работ выполняется следующее:

- в фильтры 7 и 8 вносится отмывочный раствор;

- в фильтр 5 вносится элюирующий раствор.

Затем выполняются следующие операции.

Вносится лизат биологического объекта (смесь биологического объекта и лизирующего раствора) в отверстие 9 части 1 устройства. При этом лизат биологического объекта поочередно (последовательно) пропитывает фильтр 12, сорбент 13, фильтр 14 и фильтр 18, и нуклеиновые кислоты связываются с сорбентом 13.

Часть 2 устройства поворачивается до совмещения фильтров 8 и 12, а также фильтров 14 и 17. При этом отмывочный раствор из фильтра 8 поочередно (последовательно) пропитывает фильтр 12, сорбент 13, фильтр 14 и фильтр 17, отмывая нуклеиновые кислоты, связанные с сорбентом 13.

Часть 2 устройства поворачивается до совмещения фильтров 7 и 12, а также фильтров 14 и 16. При этом отмывочный раствор из фильтра 7 поочередно (последовательно) пропитывает фильтр 12, сорбент 13, фильтр 14 и фильтр 16, отмывая нуклеиновые кислоты, связанные с сорбентом 13.

Часть 2 устройства поворачивается до совмещения фильтров 6 и 12. При этом подсушиваются фильтр 12, сорбент 13 и фильтр 14.

Часть 2 устройства поворачивается до совмещения фильтров 5 и 12, а также фильтров 14 и 15. При этом элюирующий раствор из фильтра 5 поочередно (последовательно) пропитывает фильтр 12, сорбент 13, фильтр 14 и фильтр 15 и нуклеиновые кислоты элюируются с сорбента 13 и переносятся на фильтр 15.

Часть 4 устройства поворачивается до совмещения фильтров 15 и 20. При этом элюированные нуклеиновые кислоты пропитывают фильтр 20 и переносятся на фильтр 20.

Часть 4 устройства поворачивается до совмещения отверстий 10, 11, 19 и фильтра 20. В отверстие 10 вносится растворитель, который пропитывает фильтр 20 и протекает с растворенными нуклеиновыми кислотами и реактивами для амплификации и детекции нуклеиновых кислот на дно отверстия 21.

В отверстие 10 вносится масло для проведения ПЦР.

ПЦР проводится с использованием любого базового блока, содержащего источник света, детектор флуоресценции и термоэлемент, обеспечивающие цикличное доведение температуры реакционной смеси в отверстии 21 до 62-95°C и детекцию нуклеиновых кислот в отверстии 21.

В устройстве проводятся мультиплексная ПЦР или униплексная (симплексная) ПЦР.

При увеличении числа отверстий, фильтров и сорбентов в устройстве проводятся две и более мультиплексные ПЦР и/или униплексные (симплексные) ПЦР.

Увеличение числа частей устройства позволяет проводить дополнительную очистку нуклеиновых кислот.

Технические преимущества заявляемого устройства состоят в проведении в одном устройстве этапов выделения (очистки) нуклеиновых кислот и последующей ПЦР с детекцией результатов реакции при упрощении устройства в виде чипа.

1. Устройство для полимеразной цепной реакции, содержащее фильтр, отличающееся тем, что оно состоит из, по крайней мере, четырех частей, каждая из которых имеет две плоские, параллельные поверхности, перпендикулярные общей оси, относительно которой части могут поворачиваться относительно друг друга, и отверстия, при этом первая часть имеет, по крайней мере, шесть сквозных отверстий, соединяющих две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, четыре отверстия снабжены гидрофильными фильтрами, контактирующими с плоской поверхностью второй части, вторая часть выполнена с, по крайней мере, двумя сквозными отверстиями, соединяющими две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, одно отверстие содержит сорбент, зафиксированный гидрофильными фильтрами, контактирующими с плоскими поверхностями первой и третьей частей, третья часть имеет, по крайней мере, два сквозных отверстия, соединяющих две ее плоские поверхности, из которых, по крайней мере, одно отверстие содержит гидрофильный фильтр, контактирующий с плоскими поверхностями второй и четвертой частей, и, по крайней мере, три несквозных отверстия, содержащих гидрофильные фильтры, контактирующие с плоской поверхностью второй части, а четвертая часть выполнена с, по крайней мере, одним несквозным, оптически прозрачным отверстием, содержащим гидрофильный фильтр, контактирующий с плоской поверхностью третьей части, не контактирующий с дном отверстия его содержащим.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что его части выполнены в форме дисков.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что его фильтры выполнены из материала, выбранного из ряда: бумага, целлюлоза, ацетат целлюлозы, полиамид, поликарбонат или их смеси.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что сорбент его второй части выполнен в форме, выбранной из ряда: порошок, гранулы, волокно или их смеси.

5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что сорбент его второй части выполнен из вещества, выбранного из ряда: диоксид кремния, оксид алюминия или их смесь.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит, по крайней мере, один реактив для амплификации и детекции нуклеиновых кислот.

7. Устройство по п.6, отличающееся тем, что оно содержит реактив для амплификации и детекции нуклеиновых кислот в сухом виде в, по крайней мере, одном отверстии четвертой части.

8. Устройство по п.6, отличающееся тем, что оно содержит реактив для амплификации и детекции нуклеиновых кислот в сухом виде на, по крайней мере, одном фильтре в отверстии четвертой части.