Способ молекулярной диагностики генетического риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции, приводящих к нарушению репродуктивной функции, у человека

Способ молекулярной диагностики генетического риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции, приводящих к нарушению репродуктивной функции, у человека

Реферат

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области медицины и представляет собой способ молекулярной диагностики индивидуального генетического риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции (УГХИ), приводящих к развитию нарушений репродуктивной функции у человека. Изобретение может быть использовано для персонализации тактики ведения пациентов с УГХИ.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Урогенитальный хламидиоз является широко распространенной инфекцией, передаваемой половым путем (ИППП). В мире ежегодно наблюдается более 90 млн. новых случаев инфицирования С.trachomatis, из них 4 миллиона приходится на США и около 5,5 миллионов на Европу [Moss T.R. Human genital infections with С.trachomatis / Moss T.R., Darougar R. 2001].

На территории России урогенитальная хламидийная инфекция подлежит обязательной регистрации, начиная с 1994 года. В течение последних десятилетий в Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем [Анализ эпидемиологической ситуации по ВИЧ-инфекции и сопутствующим заболеваниям (туберкулез, ИППП, гепатиты): Минздравсоцразвития. 2007] и составила в 2011 году 65,9 случаев на 100 000 населения. На сегодняшний день в России урогенитальный хламидиоз - вторая по распространенности регистрируемая ИППП после трихомоноза.

В группе риска инфицирования хламидийной инфекцией оказываются в основном молодые люди. Согласно современным исследованиям, распространенность заболевания в популяционной группе 18-25 лет на 60% выше в сравнении с другими возрастными группами [Kohl K.S. Developments in the screening for Chlamydia trachomatis: a review / Kohl KS, Markowitz LE, Koumans EH. Obstet Gynecol Clin North Am. 2003; 30(4):637-58.].

С клинической точки зрения, УГХИ подразделяется на неосложненную (в случае развития уретрита у мужчин и уретрита и/или цервицита у женщин) и осложненную (когда диагностируют воспалительные заболевания органов малого таза у женщин и эпидидимоорхит и простатит у мужчин). По данным разных авторов, осложнения в результате инфицирования С.trachomatis могут наблюдаться в 30-50% случаев как у мужчин, так и у женщин.

Заболевание нередко характеризуется малосимптомным и бессимптомным течением. Бессимптомное течение заболевания у мужчин встречается в 40-50% случаев, у женщин - в 70-80%. Согласно результатам современных исследований, урогенитальная хламидийная инфекция выявляется у 29-32% женщин, не имеющих патологических выделений из цервикального канала, у 80-84% - со слизисто-гнойными выделениями, у 79-87% - с наличием гипертрофической эрозии шейки матки [Анри-Сюше Ж. Хламидиозы в гинекологии // Актуальные микробиологические и клинические проблемы хламидийных инфекций. - М., 1990. - С.16-30; Kleimann D., Sarov I., Insler V. The effects of contraceptive hormones on the replication of Clamydia trachomatis in human endometrial cells // Contraception. - 1987.- Vol.35, №6. - P. 533-542.; Ripa K.T. Biological principles of the culture of Clamydia trachomatisin cells monolayers // Acta pathol., microb., immunol. Scand. - 1982. - Suppl. 32. - P. 4-8].

Малосимптомное и бессимптомное течение заболевания, отсутствие своевременного и адекватного лечения может приводить к позднему обращению пациентов к врачу и развитию серьезных осложнений со стороны репродуктивной системы: у женщин - к воспалительным заболеваниям органов малого таза (ВЗОМТ) и, как следствие, к развитию эктопической беременности, трубному бесплодию.

ВЗОМТ представляют собой различные комбинации нозологических форм, характеризующих поражения верхних отделов репродуктивной системы женщин. ВЗОМТ широко распространены во всем мире и наносят обществу значительный экономический и демографический урон. Munday P.E. (1997), Paavonen J. (1996) [Paavonen J. Immunopathogenesis of pelvic inflamantory disease and infertility - what do we know and what shal we do? / J. Paavonen // J. Br. Fert. - 1996. - Soc. - 1. - P. 42-45; Munday PE. Clinical aspects of pelvic inflammatory disease. / PE Munday // Hum Reprod. - 1997. - Nov; 12(11 Suppl):121-6. Review] указывают, что до 60% случаев ВЗОМТ вызваны возбудителями ИППП. Основное значение в инициировании ВЗОМТ имеют хламидийная и гонококковая инфекции, возбудители которых поражают слизистую оболочку цервикального канала, что приводит к снижению ее барьерной функции и возникновению восходящего процесса верхних отделов половой системы.

С.trachomatis является часто выявляемым инфекционным агентом из нижних и верхних отделов полового тракта женщин с хроническими ВЗОМТ (11,1% - 54,0%), у больных с хроническими гнойными ВЗОМТ также установлена высокая инфицированность данными микроорганизмами (до 40% наблюдений) [Канищева Е.Ю. Воспалительные заболевания органов малого таза у женщин и их связь с инфекциями, передаваемыми половым путем. Диагностика, лечение. / Вест, дерматологии и венерологии 2002, 4, 16-23]. Каждый год в Европе эпидемиологи регистрируют около миллиона случаев сальпингитов, из них большая часть, около 600 тыс., хламидийной этиологии. Примерно, в 120 тыс. случаев инфекция заканчивается так называемым механическим бесплодием. При этом каждый новый эпизод обусловленного хламидиями воспаления увеличивает вероятность развития вторичного бесплодия в несколько раз [Domeika М., Mardh P.A. ABC on Chlamydia. Syva a Syntex Company, Berkshire, 1993.].

В патогенезе бесплодия при воспалительных заболеваниях придатков матки ведущую роль играют функциональные нарушения кинетики и обструкция маточных труб. Обструкция маточных труб возникает в результате рубцовых склеротических изменений при разрушении инфекцией трубного эпителия. После однократного эпизода сальпингита обструкция маточных труб выявлена у 11-13% больных, двукратного - у 23-36%, троекратного и более - у 54-75%) пациенток [Эль-Рифаи Набиль Рифаи. Трубное бесплодие: диагностика и методы хирургического лечения. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 1986].

У мужчин урогенитальная хламидийная инфекция может приводить к развитию орхитов, эпидидимитов, простатитов [Гомберг М.А., Ковалык В.П., 2002; Сафина О.Н., 2003; Валиева С.А. и др., 2005; Mardh P.A. et al., 1978; Ostaszewska-Puchalska I. et al., 2004], что также служит фактором развития бесплодия, вызванного как повреждением мочеполовых путей, так и изменением качества спермы.

Расходы национальных систем здравоохранения на лечение последствий, вызываемых урогенитальной хламидийной инфекцией, в том числе нарушений репродуктивной функции, являются весьма существенными. Исследования экономической эффективности мероприятий по обследованию и лечению больных урогенитальной хламидийной инфекцией в развитых странах показали, что наилучшей стратегией в данном случае является ранняя диагностика и лечение неосложненной инфекции [Kamwendo F, Forslin L, Bodin L, Danielson D. Decreasing incidences of gonorrhea - and chlamydia-associated acute pelvic inflammatory disease: a 25-year study from an urban area of central Sweden. Sex Transmit Dis 1996; 23:384-91].

В основе повреждающего воздействия С.trachomatis на ткани организма лежит внутриклеточная репликация, воспалительные и иммунные реакции организма хозяина.

Урогенитальная хламидийная инфекция запускает специфические и неспецифические иммунологические реакции, в которых участвуют гуморальный и клеточный звенья иммунитета.

Установлено, что важную роль в регуляции воспалительных реакций, межклеточных взаимодействий играет система цитокинов, представленная множеством протеинов или гликопротеидов, вырабатываемых преимущественно активированными лимфоцитами и моноцитарно-макрофагальной системой, а также в меньшей мере фибробластами, эндотелиальными, соматическими клетками.

Считается, что цитокины оказывают влияние на работу не только иммунной системы, но и способны корректировать ключевые функции репродуктивной системы человека. Исследования показывают, что цитокины принимают участие в процессах регуляции выработки мужских и женских половых клеток, оплодотворения и эмбрионального развития [Ingman W.V., Jones R.L. Cytokine knockouts in reproduction: the use of gene ablation to dissect roles of cytokines in reproductive biology. / W.V. Ingman // Human reproduction update. - 2008. - vol. 24, No3, pp.179-192]. При урогенитальной хламидийной инфекции поражаются эпителиальные клетки урогенитального тракта, при разрушении которых происходит выброс молекул цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, фактора некроза опухолей, макрофагального колониестимулирующего фактора, и других), которые взаимодействуют с клетками иммунной системы, инициируя развитие воспалительной реакции различной степени интенсивности.

Различное клиническое течение урогенитального хламидиоза, в том числе сопровождающегося осложнениями и нарушением репродуктивной функции, может быть связано с генетически детерминированными факторами, зависящими от организма человека.

В современной научной литературе имеется большое количество публикаций, свидетельствующих о наличии ассоциаций между полиморфизмами в регуляторных областях генов, кодирующих про- и противовоспалительные цитокины, и предрасположенностью к развития заболеваний, к различному типу клинического течения заболевания и развитию осложнений клинического течения различных заболеваний [Öhman Н., Triitinen A., Halttunen М, et al. IL-10 polymorphism and cell-mediated immune response to Chlamydia trachomatis. / H. Öhman // Genes and Immunity. - 2006. - 7. - P. 243-249; Rasouli M, Kiany S. Association of interferon-gamma and interleukin-4 gene polymorphisms with susceptibility to brucellosis. / M. Rasouli // Cytokine. - 2007. - 38. - P. 49-53; Hvid, M., A. Baczynska, B. Deleuran, J. Fedder, H. Knudsen, G. Christiansen, and S. Birkelund. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell. Microbiol. 2007; Mamyrova G, Hanlon T.P., Sillers L. et al. Cytokine gene polymorphisms as risk and severity factors for juvenile dermatomyositis./ G. Mamyrova//Arthritis and Rheumatism 2008. - 58(12). - P. 3941-50; Öhman H., Triitinen A., Halttunen M., et al. Cytokine polymotphisms and severity of tubal damage in womaen with Chlamydia-associated infertility. / H. Öhman // The journal of infectious diseases. - 2009. - 199. - P. 1353-9; Kinnunen et al., 2002; Mei В., Luo Q., Du K. et al., Assotiation of MICA gene polymorphisms with Chlamydia trachomatis infection and related tubal pathology in infertile woman / Mei B.// Hum Reprog 2009. - 24912. - P. 3090-5].

Однако проблема прогнозирования клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции, сопровождающегося осложнениями и развитием нарушений репродуктивной функции, в том числе бесплодия, на основании изучения полиморфизмов генов, кодирующих про- и противовоспалительные цитокины человека, на данный момент изучена недостаточно. Появление современных лабораторных методов, в частности, технологии секвенирования генов с целью выявления особенностей их индивидуальной молекулярной структуры, диктует необходимость поиска принципиально новых путей предотвращения развития заболевания и его осложнений. Так, прогнозирование течения заболевания на основании генетически детерминированных, индивидуальных особенностей иммунного ответа на агент, становится перспективным путем решения проблемы ранней диагностики и, как следствие, своевременного и адекватного лечения урогенитальной хламидийной инфекции. Определение предикторов развития осложнений заболевания является критерием для дополнительного обследования пациентов с целью ранней диагностики осложнений и назначения терапии в соответствии с установленным диагнозом.

Учитывая высокую социальную значимость развития осложнений урогенитального хламидиоза, приводящих к бесплодию, особую актуальность представляет персонализированный подход к ведению больных. Реализация персонализированного подхода осуществляется в разработке молекулярно-генетических методов, позволяющих прогнозировать характер клинического течения заболевания до назначения лечения, и корригировать назначаемую терапию в зависимости от результатов молекулярно-генетических исследований, что дает возможность своевременно назначать терапию по схемам лечения осложненных форм заболевания.

С целью определения предшествующего уровня техники настоящего изобретения был проведен патентный поиск.

Объектом патентного исследования являлись технологии молекулярной диагностики индивидуального генетического риска развития нарушений репродуктивной функции, ассоциированных с УГХИ у человека. Для обеспечения правовой охраны результатов исследования, определения их патентной чистоты и патентоспособности проведены патентные исследовании в соответствии с ГОСТ P 15011-96.

По результатам исследования сети патентной информации espacenet.com, созданной Европейским патентным ведомством, и базы данных патентной информации www.freepatentsonline.com и www.google.com/patents/ была установлена чистота патентного поля. Поиск производился по комбинациям названий изучаемой патологии, патогенного микроорганизма, ассоциированного с патологией, и группы молекулярных маркеров.

Поиск патентов в кратких аннотациях к документам по базе американских патентов www.freepatentsonline.com, проведенный по ключевому слову «chlamydia», показал только патенты, касающиеся диагностики хламидийной инфекции. Однако в патентной базе esp@cenet, охватывающей также патенты европейской части, при запросе с ключевым словом «chlamydia» было найдено три патента, полученных в России и на Украине, касающихся способов прогнозирования беременности у лиц, перенесших хламидийную инфекцию, прогнозирования течения хламидиоза, а также определения активности хламидии.

Поиск по ключевым словам «infertility» и «polymorphism» в базе www.freepatentsonline.com показал два патента, в которых были представлены гены, связанные с женской фертильностью, способы диагностики фертильности, связанные с определением их активности, а также методы контрацепции, основанные на использовании продуктов этих генов. Также было найдено два патента, касающихся способов диагностики делеций и полиморфизмов, ассоциированных с мужским бесплодием. Кроме того, был найден патент на метод модуляции мужской фертильности на основе белкового ингибитора апоптоза, а также патент на фрагменты ДНК, кодирующие белок, который отвечает за сперматогенез и способы диагностики и лечения мужского бесплодия, основанные на его использовании.

При осуществлении поиска по ключевым словам «chlamydia» и «polymorphism» по всему документу было найдено несколько патентов на белки-иммуномодуляторы, такие как TNF, ICE LAP-7 и иммуногенные комбинации препаратов, а также способы их получения и коммерческого применения.

Поиск по ключевым словам «infertility», «female» и «markers» выявил патент, касающийся диагностики фертильности у женщин, основанный на определении концентрации различных веществ в фолликулярной жидкости (широкий список веществ включает IL-6, IL-10, IFNγ, TNFα). Принципиальным отличием данного патента от предмета разработки настоящей темы НИР является методологический подход: в запатентованном методе проводятся количественные измерения конечных белковых продуктов, а не качественное выявление полиморфизмов генов, кодирующих обозначенные маркеры, ассоциированных с осложненным течением воспалительного заболевания.

Поиск по ключевым словам «infertility» и «polymorphism» в базе esp@cenet выявил один патент, непосредственно относящийся к рассматриваемой теме. Это патент на набор для диагностики полиморфизмов гена, связанного с мужским бесплодием.

Таким образом, патентный поиск показал, что на данный момент зарегистрированы патенты, касающиеся как прогнозирования риска развития нарушений репродуктивной функции при УГХИ, течения болезни и определения степени активности урогенитальной хламидийной инфекции, так и определения активности генов и полиморфизмов в последовательности генов, ассоциированных с бесплодием. Однако патента, непосредственно связанного с оценкой репродуктивного риска, ассоциированного с урогенитальной хламидийной инфекцией, на основе исследования полиморфизмов генов у человека обнаружено не было. Перечень выявленных патентов, относящихся к разрабатываемой теме, приведен в таблице 1.

Раскрытие настоящего изобретения

Задачей изобретения является разработка способа молекулярной диагностики индивидуального генетического риска развития осложнений УГХИ, приводящих к развитию нарушений репродуктивной функции у человека.

Технический результат изобретения заключается в возможности прогнозирования характера клинического течения УГХИ на основании определения молекулярных маркеров в крови больных, что позволяет осуществлять прогнозирование осложненного клинического течения УГХИ, которое приводит нарушениям репродуктивной функции, в том числе бесплодия, на основании определения гомозиготного СС генотипа гена цитокина IL6 человека (у женщин и мужчин) в положении - 174 и гетерозиготного генотипа GC гена TGFb1, в положении - 915 (у женщин) и определять индивидуальную тактику ведения пациентов с предполагаемым неосложненным и осложненным течением УГХИ.

Это достигается за счет того, что у пациентов УГХИ стандартным способом производят забор крови из локтевой вены и осуществляют:

- выделение ДНК;

-амплификацию фрагмента гена IL6 человека, включающего полиморфизм в позиции - 174 и гена TGFb1, включающего полиморфизм в позиции -915;

- детекцию и визуализацию продуктов амплификации фрагмента гена IL6 человека в позиции - 174 и гена TGFb1, в позиции - 915 (оценочный электрофорез);

- секвенирование фрагмента IL6 человека в позиции - 174 и фрагмента гена TGFb1 в позиции - 915;

- анализ полученных результатов, заканчивающийся определением генотипа фрагмента гена IL6 человека в позиции - 174 и фрагмента гена TGFb1 в позиции - 915.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

У пациента до начала лечения стандартным способом производят забор крови из локтевой вены.

Выделение ДНК

Выделение ДНК осуществляется с использованием коммерческого набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100.

Выделение ДНК проводится в боксе биологической безопасности во избежание загрязнения помещения и последующей контаминации инкубационной смеси чужеродной ДНК при постановке ПНР.

В состав набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100 входит лизирующий реагент (Lysis reagent) с гуанидинтиоционатом, в присутствии которого ДНК активно сорбируется на сорбенте NucleoS (суспензия сорбента), затем отмывается от белков и солей спиртовым раствором.

В пробирку типа эппендорф объемом 1.5 мл к полученному лизату добавляется 400 мкл лизирующего реагента, содержимое пробирки перемешивается переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Далее пробирка со смесью термостатируется при 65°C в течение 1 часа. После термостатирования пробирка со смесью центрифугируется в течение 15 сек при 5000 g (≈12000 об/мин) в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворимый остаток. Прозрачный супернатант целиком переносится в чистую пробирку типа эппендорф объемом 1.5 мл, и к нему добавляется 20 мкл суспензии сорбента NucleoS. Перед использованием NucleoS интенсивно встряхивается на вортексе. Пробирка помещается на ротатор, перемешивается в течение 30-40 мин (10-20 об/мин), затем центрифугируется в течение 15 сек при 5000 g. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. К осадку добавляется 200 мкл лизирующего реагента, смесь тщательно перемешивается на вортексе до полного гомогенного состояния. Если суспендирование затруднено из-за сильного слипания сорбента, которое может быть обусловлено высоким содержанием ДНК, то сорбент необходимо вначале осторожно суспендировать пипетированием, а затем перемешать на вортексе. Затем в пробирку добавляется 1 мл рабочего раствора солевого буфера (Saline burrer) для отмывки ДНК. Содержимое пробирки перемешивается переворачиванием пробирки 5-10 раз и центрифугируется в течение 15 сек при 5000 g. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. К осадку добавляется 1 мл рабочего раствора солевого буфера, содержимое пробирки перемешивается на вортексе и центрифугируется в течение 15 сек при 5000 g. Супернатант удаляется осторожно, не задевая осадок. Процедура отмывки ДНК повторяется еще один раза. Осадок подсушивается при температуре 65°C в течение 4-5 мин. ДНК элюируется из сорбента путем добавления 50-100 мкл ЭкстраГена Е (Extragene Е) (100 мкл добавляется, если выделение проводится из цельной крови или другой пробы, содержащей большое количество ДНК). ЭкстраГен Е отбирается из пробирки при постоянном перемешивании. Далее содержимое пробирки суспендируется на вортексе в течение 5-10 сек до получения гомогенной суспензии, затем термостатируется при 65°C в течение 5-10 мин, еще раз суспендируется на вортексе и центрифугируется в течение 1 мин при 10000 g. Полученный раствор, содержащий ДНК, пригоден для дальнейшего использования. Однако через 2-3 дня рекомендуется центрифугировать данный раствор, содержащий сорбент, в течение 1 мин при 10000 g и перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку типа эппендорф объемом 1.5 мл. ДНК хранится при температуре 4°C. При длительном хранении рекомендуется перенести пробирки с ДНК в температуру -20°C.

Амплификация ДНК фрагментов генов IL6 человека в позиции - 174 и гена TGFb1, в положении - 915

Для выделения ДНК гена IL6 человека в позиции - 174 и гена TGFb1, в позиции - 915 использованы праймеры, характеристика которых представлена в таблице 2.

Таблица 2.
Праймеры для выделения ДНК и проведения амплификации фрагмента гена IL6 человека в позиции - 174 и гена TGFb1 в позиции - 915
Название гена	Последовательность праймеров	Температура отжига °C	Размер амплифицируемого продукта, п.н.
IL6	IL6-Fw: 5′-TGTCAAGACATGCCAAAGTGCT-3′ IL6-Rev: 5′-GGCTGATTGGAAACCTTATTAA-3′	64	180
TGFb1	TGF-Fw: 5′-CCAGCTCCATGTCGATAGTCT-3′ TGF-Rev: 5′-CCACACCAGCCCTGTTCGC-3′	64	163

Чтобы избежать контаминации, сбор амплификационной смеси проводится в стерильном ламинаре.

Амплификация осуществляется с использованием коммерческого набора регентов "Набор реагентов для проведения ПЦР" (фирма "Синтол", Россия).

Перед проведением реакции подготавливается нужное количество ПЦР пробирок типа эппендорф объемом 0.2 мл. Пробирки маркируются соответствующим образом: положительный (K+), отрицательный (K-) контроли и исследуемые пробы (указывается номер пробы).

Затем приготавливается амплификационная смесь, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (Таблица 3).

Таблица 3.
Состав амплификационной смеси
№	Наименование	Объем, мкл
1	10×Буфер для Taq-полимеразы десятикратный без детергентов	2.5
2	Праймер F, 4 мкМ	2.5
3	Праймер R, 4 мкМ	2.5
4	dNTP	2,5
5	Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл	0.5
6	dH2O	7

После приготовления смесь компонентов перемешивается и центрифугируется на вортексе.

Затем в каждую пробирку типа эппендорф объемом 0.2 мл вносится по 20 мкл приготовленной амплификационной смеси и по 5 мкл исследуемого образца ДНК или отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используется dH₂O. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл.

ПЦР проводится в амплификаторе Dyad. На первой стадии образцы подвергаются тепловой денатурации при 96°C в течение 10 минут. Затем следуют 35 циклов, состоящие из стадии денатурации ДНК - 96°C, 30 сек, отжига праймеров - 60°C, 30 сек и синтеза ДНК - 72°C, 60 сек. На последней стадии образцы подвергаются обработке при 72°C в течение 10 минут.

Детекция и визуализация продуктов амплификации ДНК фрагмента гена IL6 человека в позиции - 174 и гена TGFb1, в положении - 915 (оценочный электрофорез)

А) Приготовление 2%-ного агарозного геля. Приготовление геля проводится в соответствии с указаниями Маниатис с соавторами, 1984. Для приготовления 75 мл 2%-ного агарозного геля к 1.5 г агарозы добавляется 7.5 мл 10-кратного трисборатного буфера (10×TBE) и 67.5 мл дистиллированной воды. Приготовленная смесь прогревается в СВЧ-печи 5-7 мин (до полного растворения агарозы), затем в нее добавляется 8-10 мкл бромистого этидия (10 мг/мл) и перемешивается. Расплавленная агароза охлаждается до температуры 50-60°C и заливается в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов на планшет устанавливается одна или две гребенки. В некоторых случаях при установлении гребенок используются зажимы типа «бульдог» (в зависимости от модели камеры для горизонтального электрофореза). Раствор агарозы застывает за 15-30 мин при комнатной температуре.

Б) Разделение продуктов амплификации ДНК фрагмента гена IL6 в позиции - 174 человека и гена TGFb1, в положении - 915 методом горизонтального электрофореза

В камеру для горизонтального электрофореза помещается 1×TBE буфер, приготовленный разбавлением 10×TBE буфера дистиллированной водой.

После застывания агарозы гребенка/гребенки осторожно вынимается/ются из геля. Планшет с агарозным гелем переносится в камеру для проведения электрофореза. 1×TBE буфер должен покрывать агарозный гель на 5-7 мм.

Для электрофоретического анализа продуктов амплификации выбранных генов отбирается одинаковый объем (5 мкл) инкубационной смеси из каждой пробы, полученной в результате амплификации, смешивается с 1-2 мкл раствора, предназначенного для нанесения проб в агарозный гель (содержит бромфеноловый синий), и наносится в карманы геля. Для установления точного размера амплифицируемого продукта в один из карманов агарозного геля вносится маркер молекулярного веса ДНК в растворе, предназначенном для нанесения на гель (100 bp) GeneRuler.

Затем электрофоретическая камера подключается к источнику питания и задается напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/см. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации осуществляется в направлении от катода (-) к аноду (+).

Контроль над электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1.5-2 см или 6-8 см в зависимости от размера используемого агарозного геля.

В) Визуализация результатов электрофореза продуктов амплификации выбранного гена

После электрофореза агарозный гель фотографируется в трансиллюминаторе в коротковолновом УФ-свете (длина волны 254-310 нм) с выводом данных на экран монитора компьютера.

По полученным данным последовательно оцениваются четыре параметра:

1) отсутствие светящихся полосок в дорожке, в которую был нанесен амплифицированный отрицательный контроль;

2) прошла ли реакция амплификации (наличие/отсутствие светящихся полосок в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам);

3) насколько специфично прошла реакция амплификации (наличие одной/нескольких светящихся полосок в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам);

4) соответствует ли размер амплификационного продукта ожидаемому (если реакция амплификации прошла специфично, и в дорожках агарозного геля, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам, определяется одна светящаяся полоска, то сравнивается положение данной полоски на геле с положением маркера молекулярных весов ДНК).

Г) Выделение ДНК IL6 и TGFb1 человека из агарозного геля

Если все параметры оценены положительно, а именно в дорожке, в которую был нанесен амплифицированный отрицательный контроль, отсутствует светящаяся полоска, а в дорожках, соответствующих положительному контролю и анализируемым образцам, реакция прошла специфично, и размер амплифицированного продукта соответствует ожидаемому, то данные продукты агарозного электрофореза подходят для дальнейшего исследования.

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляется с использованием коммерческого набора реагентов WizardR SV Gel and RCR Clean-Up System.

На первом этапе проводится растворение геля. Для этого выбранные бэнды (светящиеся полоски) вырезаются из агарозного геля, взвешиваются и помещаются в пробирку типа эппендорф объемом 1.5 мл. Затем в пробирку добавляется мембрансвязывающий раствор (Membrane Binding Solution) в соотношении 1 мкл раствора на 1 мг геля. Содержимое пробирки интенсивно перемешивается на вортексе и инкубируется при 50-65°C до полного растворения геля (данный процесс контролируется визуально). На втором этапе проводится связывание ДНК. Для этого колонка (SV Minicolumn) вставляется в пробирку для сбора материала (Collection Tube). Затем в колонку переносится растворенный агарозный гель. Содержимое колонки инкубируется при комнатной температуре в течение 1 мин и центрифугируется при 16000 g в течение 1 мин. Колонка вынимается из пробирки для сбора материала, содержимое данной пробирки сливается, и колонка вновь вставляется в пробирку для сбора материала. На третьем этапе проводится отмывка ДНК. Для этого в колонку добавляется 700 мкл мембранотмывающего раствора (Membrane Wash Solution) и центрифугируется при 16000 g в течение 1 мин. Колонка вынимается из пробирки для сбора материала, содержимое данной пробирки сливается, и колонка вновь вставляется в пробирку для сбора материала. Затем в колонку добавляется 500 мкл мембранотмывающего раствора и центрифугируется при 16000 g в течение 5 мин. Колонка вынимается из пробирки для сбора материала, содержимое данной пробирки сливается, и колонка вновь вставляется в пробирку для сбора материала. Колонка центрифугируется с открытой крышкой при 16000 g в течение 1 мин для полного удаления этанола, содержащегося в мембранотмывающем растворе. На последнем этапе проводится элюция ДНК с колонки. Колонка аккуратно вставляется в чистую пробирку типа эппендорф объемом 1.5 мл. В колонку добавляется 50 мкл горячей дистиллированной водой (Nuclease-Free Water) (≈80°C) и центрифугируется при 16000 g в течение 1 мин. Колонка вынимается из пробирки типа эппендорф объемом 1.5 мл и выбрасывается. ДНК хранится при температуре 4°C. При длительном хранении рекомендуется перенести пробирки с ДНК в температуру -20°C.

Осаждение продуктов амплификации ДНК фрагмента гена IL6 и гена TGFb1

Осаждение продуктов амплификации ДНК проводится для того, чтобы получить чистый препарат ДНК и избавится от компонентов амплификационной смеси, таких как праймеры и dNTP, которые в дальнейшем мешают проведению сиквенсовой реакции.

В настоящее время существует несколько способов осаждения продуктов амплификации.

Осаждение продуктов амплификации ДНК фрагмента гена IL6 и гена TGFb1 7M ацетатом аммония

Подготавливается и подписывается необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 1,5 мл, в каждую пробирку добавляется по 60 мкл охлажденного 96° этилового спирта.

Далее в пробирки типа эппендорф объемом 0.2 мл с реакционной смесью добавляется 10 мкл 7M ацетата аммония. Реакционная смесь с ацетатом аммония переносится в пробирки с этиловым спиртом и аккуратно перемешивается. Пробы инкубируются в морозильной камере при -22°C в течение 1,5 часов, затем центрифугируются в течение 15-20 мин при 14000 об/мин при 4°C (используется центрифуга с функцией охлаждения). Затем надосадочная жидкость удаляется. К осадку добавляется 400 мкл охлажденного 80° этилового спирта и с ним инкубируется при комнатной температуре в течение 3-5 мин. Затем этиловый спирт удаляется, и осадок высушивается при 40°-45°C в настольном термостате до полного высыхания (контролируется визуально). После высушивания к осадку добавляется 5-20 мкл dH₂O (в зависимости от интенсивности свечения полосок при оценочном электрофорезе), перемешивается на вортексе и инкубируется 5-10 мин при 41°C или 20-30 мин при комнатной температуре для полного растворения осадка.

Затем повторно проводится оценочный форез №2 для того, чтобы убедиться в том, что на стадии осаждении амплифиционных продуктов не произошли потери ДНК.

Оценочный электрофорез №2 проводится так, как описано в разделе 9.5.2. За исключением того, что в данном случае для анализа отбирается одинаковый объем (2 мкл) из каждой пробы после переосаждения ДНК, смешивается с 1-2 мкл раствора, предназначенного для нанесения проб в агарозный гель (содержит бромфеноловый синий), и наносится в карманы геля (раздел 9.5.2.2).

Если в каждой дорожке агарозного геля видна светящаяся полоска, значит, осаждение прошло успешно, потери ДНК не произошло, и можно переходить к разделу 10.6. Если в каких-то или во всех дорожках геля светящиеся полоски отсутствуют, значит, произошли потери ДНК, и необходимо вернуться к работе с раздела 10.3.

Осаждение продуктов амплификации ДНК фрагмента гена IL6 и гена TGFb1 ферментами

Более современным, надежным, удобным и быстрым методом является осаждение продуктов амплификации ферментами. Для этого используются экзонуклеаза I из E.coli и щелочная фосфатаза. Существует два вида используемых фосфатаз. Одна выделена из кишечника теленка, вторая - креветочная. В данном исследовании используется креветочная щелочная фосфатаза.

Перед проведением реакции подготавливается и маркируется необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 0.2 мл. Затем на льду приготовляется смесь ферментов, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку: 0.5 мкл экзонуклеазы (20 ед. в мкл) и 1 мкл фосфатазы (1 ед. в мкл). Смесь ферментов готовится с запасом (т.е. на количество реакций, большее на 10%, чем реально необходимое). Ферменты отбираются из пробирок с поверхности, плавным движением.

После приготовления смесь ферментов аккуратно перемешивается и центрифугируется на вортексе.

Затем в каждую пробирку типа эппендорф объемом 0.2 мл вносится по 1.5 мкл приготовленной смеси ферментов и по 5 мкл амплификационного продукта (см. раздел 10.3). Общий объем реакционной смеси составляет 6,5 мкл.

Реакция проводится в амплификаторе Dyad по следующему протоколу: 1) 37°C в течение 20 мин, 2) 90°C в течение 20 мин.

После проведения реакции пробы необходимо разбавить dH₂O в зависимости от интенсивности свечения полосок при оценочном электрофорезе (возможно добавление от 6 до 48 мкл dH₂O).

Проведение сиквенсовой ПЦР

Проведение сиквенсовой реакции осуществляется с использованием коммерческого набора реагентов для секвенирования ДНК Big Dye Terminator v1.1 или v3.1 Sequencing RR-100.

Перед проведением реакции подготавливается и маркируется необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 0.2 мл.

Затем приготавливается сиквенсовая амплификационная реакционная смесь, включающая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (Таблица 4).

Таблица 4.
№	Наименование	Объем, мкл
1	Оптимизированный буфер для Big Dye Terminator v1.1 или v3.1	2
2	Big Dye Terminator v1.1 или v3.1	4
3	Праймер, 10 мкМ	2
4	dH2O	10

В качестве праймеров для сиквенсовой реакции используются праймеры, представленные в таблице 1.

После приготовления смесь компонентов перемешивается и центрифугируется на вортексе.

Затем в каждую пробирку типа эппендорф объемом 0.2 мл вносится по 18 мкл приготовленной смеси компонентов и по 2 мкл очищенной (по любой из двух описанных в разделе 10.5 методике) ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл.

Сиквенсовая ПЦР проводится в амплификаторе Dyad и состоит из стадии денатурации (96°C, 10 сек), отжига (60°C, 5 сек) и синтеза (60°C, 4 мин). Количество циклов составляет 25.

Осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР

Осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР проводится для того, чтобы избавится от компонентов сиквенсовой смеси, таких как праймеры и меченые ddNTP, которые в дальнейшем мешают проведению реакции секвенирования на приборе 3130 Genetic Analyzer.

В настоящее время существует несколько способов осаждения сиквенсовых амплификатов ДНК.

Осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР 3M ацетатом натрия

Подготавливается и подписывается необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 1.5 мл, в каждую пробирку добавляется по 50 мкл охлажденного 96% этилового спирта. Далее в пробирки типа эппендорф объемом 0,2 мл с реакционной смесью добавляется 2 мкл 0,125M ЭДТА и 2 мкл 3M ацетата натрия. Реакционная смесь с ацетатом натрия из микропробирок переносится в пробирки с этиловым спиртом и перемешивается на вортексе. Пробы инкубируются в морозильной камере при -20°C в течение 45 минут, затем центрифугируются в течение 15-20 мин при 12000 об/мин при 4°C (используется центрифуга с функцией охлаждения). Затем надосадочная жидкость тщательно удаляется (сливается и отстукивается 2-3 раза). К осадку добавляется 70 мкл охлажденного 80% этилового спирта. Пробы центрифугируются в течение 10 мин при 12000 об/мин при 4°C, надосадочная жидкость тщательно удаляется (сливается и промакивается салфеткой). Осадок высушивается при 41°C (не более) в настольном термостате до полного высыхания (контролируется визуально). После высушивания к осадку добавляется 15 мкл формамида, перемешивается на вортексе и инкубируется 5-10 мин при 41°C или 20-30 мин при комнатной температуре для полного растворения осадка. Пробы готовы для последующей процедуры секвенирования или хранятся при минус 20°C.

Осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР с использованием коммерческого набора реагентов X-Terminator