Сухая стекловидная композиция для стабилизации и защиты биологически активного материала и способ ее получения

Сухая стекловидная композиция для стабилизации и защиты биологически активного материала и способ ее получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[001] Данная заявка имеет приоритет предварительной заявки на патент США №61/299,315, поданной в Ведомство по патентам и товарным знакам США 28 января 2010 года, содержание которой по всем назначениям включено в данное описание посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область изобретения

[002] Настоящее изобретение относится к стабилизации и защите биологических материалов в жестких условиях хранения и применения, более конкретно изобретение относится к инкапсулированию биологически активных материалов и биологических препаратов, включающих живые бактерии, в защитную форму аморфной стекловидной матрицы.

Уровень техники в области, к которой относится данная заявка

[003] Сублимационная сушка традиционно была самым распространенным способом защиты чувствительных биологических веществ, таких как живые или мертвые бактерии и вирусы и белки, в то время как другие способы, такие как распылительная сушка, сушка в кипящем слое и обезвоживание, как правило, не пригодны. Высокотемпературная сушка, используемая в этих способах, приводит к значительному повреждению самого биологически активного материала. Кроме того, эти способы могут высушивать материал в недостаточной степени для требований по конкретной остаточной влаге или активности воды для стабильности продукта, и поэтому может требоваться дополнительная стадия сушки другими способами. Общепринятый способ методом сублимационной сушки обычно включает замораживание раствора, содержащего биологически активный материал, и лиофилизацию замороженного биологического материала в полном вакууме, пока он остается замороженным. Низкие температуры процесса сублимационной сушки снижают реакцию разложения биологически активного материала и минимизируют потерю активности в конечной сухой форме. Часто процесс сублимационной сушки приводит к значительной потере активности и повреждению биологически активного материала вследствие образования кристаллов льда в ходе процесса медленной сушки. Более того, сама стадия замораживания, если она выполнена некорректно, может денатурировать или инактивировать биологически активный материал. Повреждения структуры, вызванного образованием кристаллов льда, можно избежать до некоторой степени путем добавления в биологически активный раствор криопротекторов (Morgan et al., 2006). Такие защитные агенты представляют собой хорошо растворимые химические вещества, которые добавляют в композицию для защиты клеточных мембран и белков во время замораживания и для повышения стабильности во время хранения. Обычные стабилизаторы для живых бактерий и вирусов включают высшие сахара, такие как сахароза, глицерин или сорбит, в высоких концентрациях с клеточным материалом или биологически активным материалом (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). Однако такие защитные агенты могут неадекватно проникать в клетку для защиты активных компонентов внутри внутриклеточного пространства, что может приводить к нестабильности при хранении веществ, подвергнутых сублимационной сушке. По этой причине мембранные биологические материалы, такие как вирусы, бактерии и клетки, не все выживают в процессе сублимационной сушки. Таким образом, остается значительная проблема для разработки оптимального способа сушки композиции, который сводит к минимуму потери при сушке, одновременно обеспечивая достижение адекватной стабильности высушенного материала при хранении.

[004] Некоторые из этих проблем, связанных с сублимационной сушкой, были разрешены за счет использования комбинации некоторых композиций и вакуумной сушки в стекловидном состоянии, в частности сахарных стекол (патент США №6190701). Сухие стабилизированные биологически активные материалы защищены в стекловидной матрице от неблагоприятных условий окружающей среды, таких как высокие температуры и влажность. Обычно стабилизацию посредством стеклообразования инициируют концентрированием сахарного раствора, содержащего биологически активную молекулу, до образования перенасыщенного сиропа. Последующее удаление воды приводит к постепенному затвердеванию сиропа, который в конце возвращается в твердое сахарное стекло с низким содержанием остаточной воды. Химическая диффузия мизерна в стекле, и поэтому химические реакции в сущности прекращаются. Поскольку денатурация или повреждения мембран являются химическими изменениями, они не могут происходить в стекле, и биологически активный материал стабилизируется и защищается. Многие стекла недостаточно стабилизируют, поскольку они реагируют с биологически активным материалом во время хранения. Очевидные проблемы возникают с восстанавливающими сахарами, которые могут образовывать хорошие физические стекла, но затем их альдегидные группы разрушающе воздействуют на аминогруппы на биологически активном материале по типичной реакции Мэйларда, тогда как нереакционно-способные сахара дают стабильные продукты, которые вовсе не требуют замораживания.

[005] Поскольку сахара по своей природе являются гигроскопическими веществами, удаление воды и окончательная сушка перенасыщенного сиропа становятся чрезвычайно трудными. На этот недостаток впервые обратил внимание Annear (Annear, 1962), который разработал композицию, содержащую бактерии в растворе сахаров и аминокислот, и способ вакуумной сушки, включающий кипячение и вспенивание концентрированного сиропа. Roser et al. (патент США №6964771) раскрыли сходный принцип сушки путем вспенивания, включающий стадию концентрирования путем выпаривания большого объема растворителя с последующим кипячением и вспениванием концентрированного сиропа под вакуумом. Для уменьшения окисления и повреждения в результате денатурации, которые происходят во время стадии кипячения, Bronshtein (патенты США №№5766520 и 7153472) ввел улучшенный защитный состав, содержащий углеводы и поверхностно-активные вещества. Сушка защитного раствора также включала поэтапный процесс концентрирования в умеренном вакууме перед применением глубокого вакуума для вызывания вспенивающего кипения остаточной воды с образованием сухой стабильной пены. Чтобы избежать стадии кипячения, Busson и Schroeder (патент США №6534087) ввели способ сушки композиции в жидком состоянии, подходящий для чувствительных биологически активных материалов, и использование вакуумной печи при очень умеренном вакуумметрическом давлении выше 30 Торр (3,999 кПа). После достижения некоторого уровня высушивания без кипячения материала применяли нагрев при температуре выше 20°С, и высушенный материал собирали только через несколько часов.

[006] Этот тип способа сушки, при котором биологически активный раствор поддерживается в жидком состоянии на протяжении всего процесса сушки, имеет преимущество более быстрого осуществления сушки вследствие испарения жидкости во время кипячения и увеличения площади поверхности за счет вспенивания. Однако кипячение и вспенивание требуют подведения значительного количества тепла для обеспечения необходимого всплеска раствора. Такой способ сушки не очень хорошо подходит для сушки чувствительных биологических материалов, таких как живые вирусы, клетки или бактерии, поскольку применяемое тепло ускоряет ферментативное расщепление (например, протеолиз) и химическое окисление (например, окисление и разрушающее воздействие свободных радикалов), которые могут ликвидировать активность или жизнеспособность биологического материала.

[007] Способ сушки, описанный выше, также имеет ограниченные возможности его масштабирования до крупномасштабного производственного процесса. Исключение замораживания требует проведения способа при более низком уровне вакуума (>7 Торр (933,1 Па)), чем при традиционной сублимационной сушке или при способе сушки с циклами распыления-сублимации. Самым значительным недостатком вышеописанных способов является невозможность контролировать и ограничивать увеличение объема пены внутри сосуда, поддона или флакона. Неконтролируемое разбрызгивание и часто избыточное пенообразование делает практически невозможным развитие способа в промышленных масштабах. Природа всплеска и вспенивания на стадии кипячения обуславливает разбрызгивание части материала на стенки сосуда и в сушильную камеру. Для смягчения всплеска во время кипячения Bronshtein (патенты США №№6884866 и 6306345) предложил специальные камеры и протокол контролируемого применения температуры/давления, который снижает перегрев до приемлемого уровня. Другой подход в сдерживании всплеска и избыточного пенообразования описан в публикации патентной заявки США №2008/0229609, где биологически активный раствор заключают в контейнер или баллон, покрытый воздухопроницаемыми мембранами. Опять же, эти протоколы трудны для осуществления в промышленных масштабах, они требуют специального оборудования и трудны для достоверного воспроизведения с разными композициями.

[008] Сухой пенный способ сушки, известный в данной области техники, не особенно хорошо адаптируется для консервации мембранных биологических материалов, таких как липосомы, вирусы или жизнеспособные клетки и бактерии. Липидные мембраны часто препятствуют прониканию защитных агентов в замкнутые пространства или препятствуют адекватному удалению воды из замкнутого пространства. Без адекватного проникания защитных агентов ферментативные процессы, такие как протеолиз, и химические процессы, такие как окисление и разрушающие воздействия свободных радикалов, могут ликвидировать активность или жизнеспособность мембранного биологического материала. Гипоосмотические среды, остающиеся в пространствах, заключенных в мембрану, могут стимулировать нестабильность биологического материала. Truong-le, Vu (патент США №7381425) описывает способ сублимационной сушки, подходящий для мембранных биологически активных материалов. Композиции по данному изобретению содержат полиол и мембранный биологически активный материал. Способ сушки начинается с охлаждения композиции до температуры, равной примерно температуре фазового перехода липидных мембран, снижения давления на композицию для образования стабильной пены, замораживания пены и затем сублимации воды из замороженной пены с получением лиофилизированной сухой пенной композиции. Для дальнейшей сушки пены могут быть использованы условия вторичной сушки.

[009] Остается потребность в подходящей защитной композиции, которая может быть высушена в стекловидном состоянии без кипячения и избыточного пенообразования. В частности, существует потребность в эффективной с точки зрения затрат композиции и эффективном масштабируемом способе сушки, который пригоден также для применений в других областях техники помимо фармацевтической промышленности, таких как пищевая промышленность и сельскохозяйственная промышленность. Защитные композиции и мягкие способы сушки необходимы для обеспечения адекватной сушки без воздействия высоких температур. Необходима композиция, которая может защищать такие биологические материалы при хранении в условиях высокой температуры и влажности. Согласно настоящему изобретению предложено решение всех этих проблем, которое описано ниже. Способ дегидратации по настоящему изобретению является очень мягким, и не подвергает активный агент воздействию кипячения или пенообразования, и, следовательно, имеет преимущество по сравнению с традиционными методами сублимационной сушки и пенной сушки, которые могут подвергать образец одному или обоим этим стрессам.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] Настоящее изобретение охватывает композиции и способы сушки для сохранения чувствительных биологически активных материалов, таких как пептиды, белки, ферменты, гормоны, витамины, каротиноиды, минералы, лекарственные средства, антибиотики, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инсектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела, вакцины, бактерии (пробиотические или иные), вирусы и/или клеточные суспензии, при хранении. Способы сушки обеспечивают процесс для сушки композиции, содержащей биологически активные материалы, агент, формирующий матрицу, и стеклообразующий агент. Композицию получают путем диспергирования всех твердых компонентов и биологически активных материалов в растворе. Раствор мгновенно замораживают с помощью средств, известных в данной области техники, таких как жидкий азот или сухой лед, с образованием аморфной композиции в виде небольших гранул, нитей или капельных частиц. Замороженные частицы можно хранить в морозильнике (при температуре от -30°С до -80°С) до сушки, или они сразу могут быть помещены на поддоны в замороженном аморфном состоянии для жидкостной сушки в стандартном сушильном аппарате для сублимационной сушки. Осуществление способа сушки начинают со стадии кратковременной дегазации и стабилизации структуры замороженных частиц под вакуумметрическим давлением ниже 2000 мТорр (266,6 Па) с последующей стадией первичной сушки при вакуумметрическом давлении выше 2000 мТорр и при желаемой температуре. Во время вторичной и окончательной стадии сушки стекловидного аморфного материала применяют полный вакуум и повышенную температуру для достижения конечной желаемой активности воды сухого материала.

[0011] В одном из воплощений композиция содержит достаточные количества агентов, формирующих матрицу, в которую инкапсулируют биологически активный материал. Примеры подходящих агентов, формирующих матрицу, включают, но ими не ограничены, ацетофталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), метилцеллюлозу, каррагинан, гуаровую камедь, аравийскую камедь, ксантановую камедь, камедь из плодов рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы и модифицированные крахмалы, циклодекстрины и олигосахариды (инулин, мальтодекстрины, декстраны и т.д.); и их комбинации. В одном конкретном воплощении предпочтительным агентом, формирующим матрицу, является альгинат натрия. Предпочтительно, композиция содержит, в массовых процентах от общей массы сухого вещества, 0,1-20% и более предпочтительно 1-12%.

[0012] В дополнительном воплощении агент, формирующий матрицу, содержит смесь альгината натрия и олигосахаридов в массовом соотношении альгинат натрия/олигосахариды 1:1-10, более предпочтительно 1:1-5.

[0013] В еще одном другом воплощении настоящего изобретения агент, формирующий матрицу, поперечно сшит ионами двухвалентных металлов с образованием плотного гидрогеля. Композицию на основе поперечно-сшитого гидрогеля образуют путем распыления или экструдирования суспензии в ванну, содержащую раствор ионов двухвалентных металлов, или путем добавления ионов двухвалентного металла прямо в суспензию и оставления композиции стоять до затвердевания и образования гидрогеля. Композицию гидрогеля затем моментально замораживают и сушат способами сушки по изобретению.

[0014] В еще одном другом воплощении композиция содержит значительные количества стеклообразующих агентов, в которых заключены микроорганизмы. Примеры подходящего агента включают, но ими не ограничены, белки, такие как яичный альбумин, яичный белок, желатин, иммуноглобулин, выделенный соевый белок, пшеничный белок, гороховый белок, хлопковый белок, сухое обезжиренное молоко, казеинат, белок молочной сыворотки и любой гидролизованный белок; углеводы, включая моносахариды (например, галактозу, D-маннозу, сорбозу и т.д.), дисахариды (например, лактозу, трегалозу, сахарозу и т.д.), аминокислоту, такую как лизин, глутамат, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин, и т.д.); метиламин, такой как бетаин; эксципиент соль, например сульфат магния; полиол, такой как трехатомные спирты или сахарные спирты высшей атомности (например, глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит); пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; плюроники; поверхностно-активные вещества; и их комбинации.

[0015] В одном предпочтительном воплощении стеклообразующий агент содержит смесь дисахарида и гидролизованного белка. В конкретном воплощении предпочтительный стеклообразующий агент представляет собой смесь трегалозы и гидролизованного белка. Предпочтительно композиция содержит, в массовых процентах от общей массы сухого вещества, 10-90% трегалозы и 0,1-30% гидролизованного белка, более предпочтительно 20-80% трегалозы и 0,1-20% гидролизованного белка, и наиболее предпочтительно 40-80% трегалозы и 0,1-20% гидролизованного белка.

[0016] Способ по изобретению типично включает смешивание в растворе биологически активных материалов (например, пептидов, белков, ферментов, гормонов, витаминов, каротиноидов, минералов, лекарственных средств, антибиотиков, микробиоцидов, фунгицидов, гербицидов, инсектицидов, спермицидов, нуклеиновых кислот, антител, вакцин, бактерий, вирусов и/или клеточных суспензий), по меньшей мере одного агента, формирующего матрицу, и по меньшей мере два стеклообразующих агента в гомогенную суспензию, быстрое замораживание суспензии путем распыления, капельной подачи или экструдирования в ванну с жидким азотом, сбор гранул, микрогранул, нитей или капельных частиц из ванны с жидким азотом и сушку в жидком состоянии в аппарате для сублимационной сушки или, альтернативно, хранение их в морозильнике (при температуре от -30°С до -80°С) до сушки.

[0017] В варианте настоящего изобретения количество агента, формирующего матрицу, в композиции корректируют для достижения желаемой вязкости и желаемой плотности композиции, что обеспечивает эффективную первичную сушку, одновременно исключая кипячение и избыточное пенообразование, которое обычно происходит во время первичной жидкостной стадии сушки. Желаемая плотность жидкой композиции может быть достигнута с помощью любых средств, известных в данной области техники, например взбивание или инжектирование газа, такого как воздух, азот, диоксид углерода, аргон и т.д. Предпочтительно, перед стадией быстрого замораживания в композицию в форме вязкой суспензии инжектируют азот при перемешивании до образования стабильной пористой или сметанообразной суспензии.

[0018] Согласно изобретению способ сушки включает три основные стадии: 1) стадия кратковременной дегазации и стабилизации структуры замороженных частиц под вакуумметрическим давлением менее 2000 мТорр; 2) первичная жидкостная стадия сушки под вакуумметрическим давлением более 2000 мТорр и при желаемой температуре; 3) вторичная и окончательная стадия сушки стекловидного материала под давлением полного вакуума и повышенной температуре в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды высушенной композиции до 0,3 Aw или менее.

[0019] В предпочтительных воплощениях способов сушки биологически активный материал смешивают в растворе, содержащем агент, формирующий матрицу, и стеклообразующий агент. В одном конкретном воплощении биологически активный материал содержит живые бактерии (например, пробиотические бактерии). Примеры подходящих микроорганизмов включают, но ими не ограничены, дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесневые грибы, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и Torulopsis, и бактерии, такие как бактерии родов Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus. Конкретные примеры подходящих пробиотических микроорганизмов могут быть представлены перечисленными ниже видами и включают биологические типы культур в пределах этих видов: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, В. licheniformis, В. mesentericus, В. pumilus, В. subtilis, В. natto, Bacteroides amylophilus, Вас. capillosus, Вас. ruminocola, Вас. suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacetylactis, E faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarius, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L. farciminis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. Rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae (damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop. shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus camosus, Staph. xylosus, Streptococcus infantarius, Strep. salivarius ss. thermophilus, Strep. Thermophilus и Strep. lactis.

[0020] В предпочтительных способах композицию смешивают при комнатной температуре или слегка подогревают, чтобы способствовать солюбилизации материалов в вязкий раствор (например, при температуре от 20°С до 40°С). После перемешивания до гомогенного состояния вязкую суспензию затем мгновенно замораживают путем распыления, капельной подачи или экструдирования в жидкий азот. Замороженные частицы собирают из ванны с жидким азотом и немедленно сушат или, альтернативно, хранят в морозильнике для последующей сушки. Обычно суспензию, содержащую биологически активный материал, мгновенно замораживают до температуры от -30°С до -180°С; более предпочтительно композицию мгновенно замораживают в жидком азоте.

[0021] В предпочтительном воплощении мгновенно замороженные частицы немедленно сушат или, иначе, хранят в морозильнике предпочтительно при -80°С до сушки. Замороженные частицы затем загружают на поддоны и немедленно переносят в камеру для вакуумной сушки, где их сушат согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, сушку начинают путем подвергания замороженных частиц воздействию вакуумметрического давления от 0 до 2000 мТорр. Замороженные частицы дегазируют и оставляют стоять для развития и стабилизации их структуры и объема в течение короткого периода времени. В типичных случаях желаемый период времени для подвергания замороженных частиц воздействию высокого вакуумметрического давления составляет не более 30 минут, более предпочтительно период времени составляет от 1 до 20 мин. После кратковременного начального дегазирования и стабилизации структуры замороженных частиц вакуум доводят до значения от 2000 до 10000 мТорр (1,333 кПа) и применяют нагрев для оттаивания частиц при температуре выше их точки замерзания. В типичных случаях вакуум доводят до значения от 2000 до 4000 мТорр (0,5332 кПа), и температуру частиц увеличивают до температуры от -5°С до +5°С. В этих предпочтительных условиях первичной сушки замороженные частицы быстро оттаивают и плохо сохраняют их первоначальную форму, и в то же время начинается ускоренная дегидратация. Последующую вторичную сушку осуществляют после удаления примерно 60-90% свободной воды, применяют максимальное вакуумметрическое давление и нагрев, при котором температура композиции поднимается до диапазона от 30°С до 60°С. Для максимального повышения стабильности конечного продукта композицию предпочтительно сушат в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды композиции до Aw=0,3 или менее. В предпочтительном воплощении данного изобретения вторичная сушка включает удаление связанной воды при давлении менее 1000 мТорр (133,3 Па).

[0022] Высушенная композиция может быть использована непосредственно в виде хлопьев, или ее измельчают в порошок и просеивают до среднего размера частиц от примерно 10 мкм до примерно 1000 мкм. Композицию можно вводить непосредственно животному, включая человека, в виде концентрированного порошка, в виде восстановленной жидкости (например, питья), или она может быть добавлена либо в форме хлопьев, либо в форме порошка, в имеющийся пищевой или кормовой продукт.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0023] Фиг.1 - визуальные и микроскопические наблюдения разных высушенных композиций, содержащих различные матрицы и стеклообразующие агенты, в виде замороженной твердой гранулы согласно способу по настоящему изобретению.

[0024] Фиг.2 - влияние формы культуры L. rhamnosus в виде свежей культуры, в виде замороженных гранул или в виде сухого порошка на количество ее начальных КОЕ (колониеобразующие единицы) в сухой композиции.

[0025] Фиг.3 - влияние температуры замораживания композиции, содержащей L. rhamnosus в виде замороженных твердых гранул в жидком азоте или в морозильнике при -80°С и в виде незамороженной вязкой суспензии при +4°С на количество бактериальных начальных КОЕ в сухой композиции. Результаты показывают только влияние температуры замораживания суспензии без дополнительной стадии дегазации перед сушкой.

[0026] Фиг.4 - влияние температуры замораживания композиции, содержащей Bifidobacterium animalis Bbl2, в виде замороженных твердых гранул в жидком азоте и в виде незамороженной вязкой суспензии при +4°С на количество бактериальных начальных КОЕ в сухой композиции. Результаты показывают только влияние температуры замораживания суспензии без дополнительной стадии дегазации перед сушкой.

[0027] Фиг.5 - влияние продолжительности дегазации под вакуумом замороженных твердых гранул на количество начальных КОЕ L. rhamnosus в сухой композиции.

[0028] Фиг.6 - профиль сушки в сушилке для сублимационной сушки композиции согласно способу по изобретению.

[0029] Фиг.7 - технологические потери и потери при сушке L. rhamnosus в композициях и способы сушки по изобретению.

[0030] Фиг.8 - тенденции в отношении стабильности композиции сухих пробиотических бактерий L. rhamnosus при хранении при 40°С и относительной влажности 33%.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0031] ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0032] Следует иметь в виду, что использованная в данном описании терминология использована только в целях описания конкретных воплощений и не является ограничивающей.

[0033] Использованные в этом описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают объекты во множественном числе, если контекст четко не диктует иное. Так, например, ссылка на ″белок″ включает белок в единственном числе или комбинацию двух или более белков; ссылка на ″фермент″, ″витамин″, ″бактерии″ и т.д. включает каждый из них один или смеси нескольких, и т.п.

[0034] ″Биологически активный материал″, ″биологически активная композиция″ или ″биологически активная форма″ относятся к препаратам, которые находятся в такой форме, в которой биологическая активность биологически активных ингредиентов однозначно является эффективной.

[0035] ″Агент, формирующий матрицу″ относится к соединениям или материалам, которые добавляют в композицию для увеличения вязкости и/или плотности влажной композиции или для образования гидрогеля. Примеры подходящего агента, формирующего матрицу, включают, но ими не ограничены, водорастворимые производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза и гипромеллоза; альгинаты, галактоманнан, геллановая камедь, трагакант, включая любые их производные, ацетофталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлоза, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), метилцеллюлоза, каррагинан, гуаровая камедь, аравийская камедь, ксантановая камедь, камедь из плодов рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевая кислота, крахмалы и модифицированные крахмалы, циклодекстрины и олигосахариды (инулин, мальтодекстрины, декстраны и т.д.) и их комбинации.

[0036] ″Стеклообразующий агент″ или ″сахарный стеклообразующий агент″ обычно относится к соединениям или материалам, которые легко растворяются в растворе и не загущаются или не полимеризуются при контакте с водой. Эти агенты добавляют для обеспечения или увеличения стабильности биологически активного материала в процессе сушки и впоследствии или для стабильности при долговременном хранении сухого порошкового продукта. Полезными стеклообразующими агентами могут быть мономерные, олигомерные или полимерные агенты.

[0037] Согласно одному из предпочтительных воплощений стеклообразующий агент представляет собой сахарид. Сахарид, или углевод, по определению представляет собой соединение, преимущественно состоящее из углерода, водорода и кислорода. Полезные сахариды включают восстанавливающие и невосстанавливающие сахара и сахарные спирты, олигосахариды, водорастворимые полисахариды и их производные. Предпочтительные сахариды согласно изобретению включают глюкозу, фруктозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, целлобиозу, галактозу, мальтотриозу, раффинозу, декстрин, декстран, инулин, маннит, сорбит, ксилит. Особенно предпочтительными сахаридами являются глюкоза и трегалоза.

[0038] Другие полезные стеклообразующие агенты могут быть выбраны из других классов химических веществ, таких как водорастворимые аминокислоты, пептиды или белки и гидролизованные белки. Примерами являются лизин, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин и т.д.); метиламин, такой как бетаин. Полезные белки включают желатин, яичный альбумин, яичный белок, белок молочной сыворотки, казеинат, иммуноглобулины, соевый белок, гороховый белок, хлопковый белок или другие пищевые, молочные или растительные белки.

[0039] ″Гидролизованные белки″ обычно относятся к белкам из животного, молочного или растительного источника, которые были расщеплены в результате ферментативного гидролиза или биологической переработки на более короткие пептидные фрагменты и/или аминокислоты. Полезными гидролизованными белками являются белки, подвергнутые интенсивному гидролизу, который снижает молекулярную массу 99% нативных белков до значения ниже 50000 Да, предпочтительно до значения ниже 10000 Да.

[0040] Комнатные температуры ″окружающей среды″ или условия ″окружающей среды″ представляют собой температуры или условия в любое данное время в данной окружающей среде. Обычно комнатная температура окружающей среды составляет 22-25°С, атмосферное давление окружающей среды и влажность окружающей среды без труда могут быть измерены и будут варьировать в зависимости от времени года, погоды и климатических условий, высоты над уровнем моря и т.д.

[0041] ″Дегазация″ или ″удаление газа″ в контексте настоящего изобретения относится к высвобождению газа из твердой или жидкой композиции, где парциальное давление газа больше, чем внешнее давление. Это не кипение раствора в жидкой форме, и это часто может происходить при давлениях выше давления, которое могло бы вызвать кипение раствора.

[0042] ″Кипение″ относится к быстрому фазовому переходу из жидкости в газ, который происходит при температуре жидкости выше ее температуры кипения. Температурой кипения является температура, при которой давление пара жидкости равно внешнему давлению. Кипение может быть особенно бурным, когда добавляют нагрев жидкости, которая уже находится при ее точке кипения.

[0043] ″Активность воды″, или ″Aw″, в контексте высушенных форм композиций относится к присутствию воды и отражает энергетическое состояние воды в системе. Ее определяют как давление пара воды над образцом, деленное на давление пара чистой воды при одинаковой температуре. Чистая дистиллированная вода имеет активность воды, равную точно единице, т.е. Aw=1,0.

[0044] ″Относительная влажность″ или ″OB″ в контексте стабильности при хранении относится к количеству водяного пара в воздухе при данной температуре. Относительная влажность обычно меньше, чем влажность, которая требуется для насыщения воздуха, и выражается в процентах от влажности насыщения.

[0045] ″Сухой″ и его варианты относятся к физическому состоянию, которое представляет собой лиофилизированный, дегидратированный или безводный, т.е. по существу не содержащий жидкость. Сушка включает, например, распылительную сушку, сушку в кипящем слое, лиофилизацию и вакуумную сушку.

[0046] ″Лиофилизация″ или ″сублимационная сушка″ относится к получению композиции в сухой форме путем быстрого замораживания и дегидратации в замороженном состоянии (иногда называется сублимацией). Этот процесс может протекать под вакуумом при давлении, достаточном для поддерживания продукта в замороженном состоянии, предпочтительно ниже примерно <2000 мТорр.

[0047] ″Первичная сушка″ или ″жидкостная сушка″, что касается описанных здесь способов, относится к сушке дегидратацией, которая происходит от момента времени таяния замороженных частиц до точки, когда начинается вторичная сушка. В типичных случаях первичная сушка в основном происходит в результате интенсивного испарения, в то время как температура продукта остается значительно ниже, чем температура источника тепла. Этот процесс может протекать под вакуумом при давлении, достаточном для поддерживания таяния продукта, предпочтительно выше примерно >2000 мТорр.

[0048] ″Вторичная сушка″, что касается описанных здесь способов, относится к стадии сушки, которая происходит при температурах, выше температур замерзания композиций и близких к температуре источника тепла. Этот процесс может протекать под вакуумом при давлении, достаточном для снижения активности воды композиции, предпочтительно менее примерно <1000 мТорр. В типичном способе сушки композиции стадия вторичной сушки снижает активность воды композиции до Aw 0,3 или менее.

[0049] ″Вспенивание″ относится к методике сушки чувствительных биологических материалов путем кипячения под вакуумом в условиях, при которых биологические материалы сохраняют активность или жизнеспособность в течение длительных периодов времени при температуре окружающей среды или при более высокой температуре. Конкретная методика формирования механически стабильной пористой структуры, протекающего в две стадии: (1) первичная сушка вспениванием и при кипячении под вакуумом, и (2) сушка для стабилизации/остекловывание, описана в патенте США №5766520, Bronshtein.

[0050] ″Стабильная″ форма или композиция представляет собой композицию, в которой биологически активное вещество по существу сохраняет его физическую стабильность, химическую стабильность и/или биологическую активность при хранении. Стабильность может быть измерена при выбранных температурных условиях и условиях влажности в течение выбранного периода времени. Анализ тенденции изменения может быть использован для оценки ожидаемого срока годности до того, как материал фактически находился на хранении в течение этого периода времени. Для живых бактерий, например, стабильность определяют как время, которое требуется для потери 1 log KOE/г сухой композиции при заданных условиях температуры, влажности и периода времени.

[0051] ″Жизнеспособность″ в отношении бактерий относится к способности образовывать колонию (КОЕ, или колониеобразующая единица) на питательной среде, подходящей для роста бактерий. Жизнеспособность в отношении вирусов относится к способности инфицировать подходящую клетку-хозяина и репродуцироваться в подходящей клетке-хозяине, вызывая образование пятна на газоне клеток-хозяев.

[0052] Композиции и способы по настоящему изобретению решают задачу создания экономически эффективных и промышленно применимых способов сушки композиций, содержащих чувствительные биологически активные вещества, такие как пептиды, белки, ферменты, гормоны, витамины, каротиноиды, минералы, лекарственные средства, антибиотики, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инсектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела, вакцины, бактерии, вирусы и/или клеточные суспензии, со значительно увеличенной продолжительностью жизни в сухом состоянии.

[0053] Согласно изобретению предложена композиция, содержащая биологически активное вещество, и матрицу, и стеклообразующие агенты в смеси растворов, и предложен способ сушки, включающий мгновенное замораживание указанной композиции в жидком азоте с образованием аморфной твердой структуры в форме капельных частиц, нитей, гранул или микрогранул и дегазацию замороженных частиц в глубоком вакууме с последующей стабилизацией биологически активного вещества в форме сахарного стекла путем лиофилизации или выпаривания влаги в режиме пониженного давления с одновременным нагреванием композиции.

[0054] Основную потерю жизнеспособности микроорганизма во время осуществления способов сушки можно объяснить сочетанием образования кристаллов льда, высоких осмотических и оксидативных стрессов, сдвиговых усилий и высвобождения энергии во время пузырьковых кавитаций, ассоциированных с ″кипением″ и вспениванием раствора при сушке при низком давлении и высокой температуре. Настоящее изобретение исключает такие негат