Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот, гетерогенный биокатализатор, полученный таким способом, и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого гетерогенного биокатализатора

Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот, гетерогенный биокатализатор, полученный таким способом, и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого гетерогенного биокатализатора

Реферат

Заявляемая группа изобретений относится к области получения гетерогенных биокатализаторов для ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика.

Гидролазы эфиров альфа-аминокислот (alpha-amino acid ester hydrolase, AEH; КФ 3.1.1.43) представляют собой класс ферментов, способных катализировать гидролиз эфиров альфа-аминокислот, гидролиз ациламидной связи различных цефалоспоринов и пенициллинов, а также N-ацилирование 7-аминоцефема и 6-аминопенама эфирами альфа-аминокислот. Подобная субстратная специфичность позволяет использовать эти ферменты в качестве биокатализаторов процессов синтеза цефалоспоринов и пенициллинов, содержащих аминогруппу в альфа-положении боковой цепи - аминоцефалоспоринов и аминопенициллинов, составляющих группу аминобета-лактамных антибиотиков.

Исследования структуры AEH показали, что эти ферменты относятся к классу α/β-гидролаз и содержат в активном центре каталитическую триаду Ser-His-Asp. По структуре, строению активного центра, субстратной специфичности и каталитическим свойствам AEH принципиально отличаются от таких ацилаз бета-лактамов как, например, пенициллин G ацилаза, также используемых для синтеза бета-лактамных антибиотиков. Эти ферменты структурно относятся к классу N-концевых гидролаз, содержащих в активном центре N-концевой остаток β-цепи, выступающий в качестве нуклеофила при каталитическом акте.

Все изученные ферменты АЕН, относящиеся к ацилазам бета-лактамов, обладают субъединичной структурой, причем подавляющее большинство из них состоит из четырех идентичных субъединиц, каждая с молекулярной массой 70-72 кДа при общей молекулярной массе белка 260-280 кДа [Биотехнология 5: 8-37 (2012); Curr Opin Biotechnol 15: 356-363 (2004)]. Изучение пространственной структуры ферментов АЕН методами кристаллографии и компьютерного моделирования показало, что эти белки представляют собой тетрамеры сферической полой формы диаметром около 100 Å [Биотехнология 5: 8-37 (2012); J Biol Chem 281 (9): 5804-5810 (2006); J Biol Chem 278: 23076-23084 (2003)].

К настоящему времени описано десять природных микробных штаммов, продуцирующих гидролазы эфиров альфа-аминокислот, относящиеся к ацилазам бета-лактамов [Биотехнология 5: 8-37 (2012)]. Клонированы и экспрессированы в Escherichia coli (E. coli) гены ферментов AEH из Acetobacter turbidans [WO 02086111; J Biol Chem 281 (9): 5804-5810 (2006); Appl Environ Microbiol 68: 211-218 (2002)], Xanthomonas citri WO 02086111; J Biol Chem 278: 23076-23084 (2003)], Xanthomonas campestris pv. campestris [J Mol Catal B: Enzym 67: 21-28 (2010)] и Xanthomonas rubrilineans [RU 2012120576; RU 2012139787; CN 102533695; CN 102653726; Biotechnol Lett 34: 1719-1724 (2012); Enzyme Microb Technol 51: 107-112 (2012)].

Гидролаза эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans выделена и охарактеризована в начале 1990-ых годов [Биохимия 55(12): 2226-2238 (1990); Enzyme Microb Technol 15: 965-973 (1993)]. Высокий потенциал практического применения этого фермента обусловлен его стереоселективностью, широкой субстратной специфичностью и широким pH-оптимумом, сдвинутым в кислую область. Работы по клонированию гена aehR из Xanthomonas rubrilineans и его экспрессии в E. coli позволили получить два высокопродуктивных рекомбинантных штамма, перспективных с точки зрения создания на их основе гетерогенных технологических биокатализаторов [RU 2012120576; RU 2012139787; Биотехнология 5: 8-37 (2012)].

Обязательным условием практического применения AEH в процессах биокаталитического синтеза аминобета-лактамных антибиотиков является разработка на их основе гетерогенных технологических биокатализаторов, пригодных для многократной эксплуатации и получаемых простыми и дешевыми способами. Известны способы получения гетерогенных биокатализаторов на основе АЕН из различных природных штаммов-продуцентов Acetobacter turbidans и нескольких микроорганизмов рода Xanthomonas, однако ни в патентной, ни в научной информации нет сведений о получении технологических биокатализаторов с использованием фермента AEN из высокопродуктивных штаммов, созданных методами генетической инженерии.

Известны способы получения гетерогенных биокатализаторов на основе АЕН из Acetobacter turbidans путем выделения фермента из биомассы клеток, его частичной или более глубокой очистки и последующей иммобилизации на модифицированной глутаровым альдегидом агарозе [Enzyme Microb Technol 25: 336 (1999)], а также с применением усовершенствованного способа иммобилизации AEH, включающего дополнительную модификацию фермента, иммобилизованного на агарозе, альдегид декстраном [J Mol Catal B: Enzym 11: 633 (2001); Biomacromolecules 2(1): 95 (2001)]. Однако эти способы трудоемки и малоэффективны из-за применения процедуры глубокой очистки фермента перед иммобилизацией и сложной многостадийной процедуры иммобилизации. Используют такие биокатализаторы для синтеза ампициллина и цефалексина.

Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе AEH из Xanthomonas citri, состоящий в адсорбционной иммобилизации на каолине или бентоните фермента, извлеченного из биомассы клеток и подвергнутого очистке, включающей фракционное осаждение сульфатом аммония и хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, а затем на сефарозе 4-В с общим выходом активности процесса получения биокатализатора от биомассы клеток 16-20% [Biotechnol Bioeng 23 (2): 361-381 (1981)]. Помимо сложности реализации и низкой эффективности, к недостаткам данного способа следует отнести низкий уровень операционной стабильности биокатализатора в процессе синтеза цефалексина, обусловленный использованием метода адсорбционной иммобилизации, не обеспечивающего многоточечного, прочного и необратимого связывания фермента с носителем; следствием этого является низкая термическая стабильность иммобилизованного фермента, а также возможная десорбция фермента и других белков раствором субстратов (особенно при высоких концентрациях субстратов). В первом цикле эксплуатации биокатализатора выход цефалексина по бета-лактамсодержащему полупродукту составил 85%.

Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе АЕН из Xanthomonas sp. путем включения грубоочищенного фермента, модифицированного глутаровым альдегидом, в полиакриламидный гель [Антибиот Химиотер 44: 6-11 (1999)]. Биокатализатор использован для синтеза цефалексина и цефаклора с выходами по бета-лактамсодержащему полупродукту 75 и 70%, соответственно.

Описан способ получения биокатализатора на основе АЕН путем иммобилизации клеток природного штамма Xanthomonas rubrilineans в Ca-альгинатном геле [Антибиот Химиотер 44: 6-11 (1999)]. В присутствии этого биокатализатора осуществлен синтез цефалексина с выходом по бета-лактамсодержащему полупродукту 55%.

Заявлен способ получения биокатализаторов процессов трансформации и синтеза антибиотиков, в частности на основе АЕН из Xanthomonas rubrilineans, путем иммобилизации в полиакриламидном геле биомассы клеток или выделенного из нее фермента, а также путем совместной их иммобилизации [RU 2000102705].

Описан синтез полусинтетических аминоцефалоспоринов и аминопенициллинов под действием биокатализатора, представляющего собой совместно иммобилизованные клетки, содержащие фермент, гидролизующий биосинтетические бета-лактамы с образованием бета-лактамсодержащих полупродуктов, и выделенный из Xanthomonas rubrilineans фермент AEH, синтезирующий целевые антибиотики [RU 2221046].

В качестве ближайших аналогов заявляемого способа получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans, заявляемого гетерогенного биокатализатора и заявляемого способа синтеза аминобета-лактамных антибиотиков под действием гетерогенного биокатализатора рассмотрим аналогичные объекты, заявленные в патентах RU 2381273 и соответствующем ему CN 101525603.

Ближайшим аналогом заявляемого способа получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans, является способ получения биокатализатора для синтеза аминобета-лактамных антибиотиков путем иммобилизации АЕН из природного штамма Xanthomonas rubrilineans методом поперечной сшивки ферментных агрегатов [RU 2381273]. Способ - ближайший аналог отражает полную процедуру получения гетерогенного биокатализатора, исходя из биомассы клеток.

Ближайший аналог заявляемого биокатализатора [RU 2381273] представляет собой поперечно-сшитые ферментные агрегаты (cross-linked enzyme aggregates, CLEAs), получаемые из раствора, содержащего гидролазу эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans, путем осаждения целевого фермента в виде агрегатов, в которых белковые молекулы ассоциированы за счет физических взаимодействий, и последующей сшивки этих агрегатов бифункциональным реагентом глутаровым альдегидом.

Ближайший аналог заявляемого способа синтеза аминобета-лактамных антибиотиков под действием биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans является способ синтеза аминобета-лактамных антибиотиков под действием биокатализатора - ближайшего аналога [RU 2381273].

Гетерогенные биокатализаторы без носителя в форме CLEAs и способы их получения разработаны в начале 2000-ных годов [US 2004235126; WO 02061067; WO 03066850; EP 1088887; Curr Opin Biotechnol 14: 387-394 (2003); Biotechnol. Lett. 24: 1379 (2002); Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 11: 655-670 (2001); Organic Lett 2 (10): 1361-1364 (2000)], а затем усовершенствованы применительно ко многим ферментам, в перечень которых, однако, не входит гидролаза эфиров альфа-аминокислот [Bioresource Technology 115: 48-57 (2012); Organic Process Research & Development 15: 213-223 (2011); Appl Microbiol Biotechnol 92: 466-477 (2011); Biocatalysis and Biotransformation Chem 23 (3/4): 141-147 (2005)]. Осаждение агрегатов осуществляют из ферментного раствора той или иной степени очистки одним из трех способов: путем высаливания (как правило, сульфатом аммония); путем изменения диэлектрической проницаемости под действием органических растворителей (ацетон, изопропиловый спирт, этиловый спирт и др.) или путем изменения гидратации белков за счет добавления неионного гидрофильного полимера (как правило, полиэтиленгликоля).

Известны способы получения CLEAs с улучшенными каталитическими и механическими свойствами, основанные на внесении в реакционную смесь при формировании агрегатов или после него добавок, способных соосаждаться с целевым ферментом и/или взаимодействовать со сшивающим агентом. Описано использование для этой цели белка (бычьего сывороточного альбумина) [CN 102492683; Bioresource Technology 102: 6186-6191 (2011); Bioresource Technology 101: 6569-6571 (2010); Journal of Biotechnology 132: 23-31 (2007); Analytical Biochemistry 351: 207-213 (2006)], белка куриного яйца [Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 71: 113-118 (2011)], аминосодержащего полимера полиэтиленимина [J Mol Catal В: Enzym 74: 184-191 (2012); J Mol Catal B: Enzym 71: 113-118 (2011); Enzyme Microb Technol 39: 750-755 (2006); Biomacromolecules 6: 1839-1842 (2005)], сахаров [Journal of Biotechnology 156: 30-38 (2011)], крахмала [CN 101629171], алкоксисилана [US 2012149082]. В источниках не обнаружено сведений об использовании водорастворимого производного аминополисахарида хитозана в качестве добавки для улучшения свойств CLEAs на основе каких-либо ферментов.

Биокатализатор в форме CLEAs на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ его получения описаны в ближайшем аналоге [RU 2381273], где в качестве источника фермента использован штамм Xanthomonas rubrilineans ВКПМ B-9915. В источниках информации не обнаружено сведений о получении CLEAs на основе AEH из высокопродуктивных рекомбинантных штаммов.

Способ получения биокатализатора согласно ближайшему аналогу состоит в следующем. Фермент АЕН извлекают из биомассы клеток штамма Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915 методом химического лизиса под воздействием бутилацетата в условиях, оптимизированных для каждого используемого штамма-продуцента и условий его биосинтеза по таким параметрам как концентрация биомассы клеток в суспензии, концентрация бутилацетата, температура, pH и момент остановки процесса. Из бесклеточного экстракта, полученного путем коагуляции разрушенной биомассы клеток и ее отделения, получают гетерогенный биокатализатор в форме поперечно-сшитых ферментных агрегатов. Для этого осаждают AEH в виде ферментных агрегатов под действием полиэтиленгликоля с выбранной молекулярной массой, взятого в количестве, необходимом для полного осаждения целевого фермента, а затем осуществляют поперечную сшивку этих агрегатов глутаровым альдегидом, взятым в оптимизированной концентрации, рассчитываемой по отношению к содержанию белка в бесклеточном экстракте.

Биомассу клеток бактерий Xanthomonas rubrilineans, содержащих фермент AEH подвергают криообработке при температуре от -25 до -30°C, а затем размораживают и суспендируют в буфере при концентрации биомассы клеток в суспензии 20÷100 мг сух./мл. К полученной суспензии добавляют бутилацетат в концентрации 2÷6 об.% и осуществляют процедуру разрушения клеточной биомассы и экстракции фермента в водную фазу при интенсивном перемешивании при температуре 25÷35°C. Экстракцию ведут сначала в условиях спонтанно устанавливающегося градиента pH, а затем при постоянном значении pH, поддерживаемом путем добавления щелочного титранта и регистрируют его расход. Диапазон pH, обеспечивающий оптимальные результаты, зависит от используемого штамма Xanthomonas rubrilineans, а также от условий биосинтеза культуры и устанавливается в серии предварительных экспериментов. Процедуру экстракции фермента прекращают, когда скорость расхода раствора аммиака сократится в установленное экспериментально число раз К_опт. Время достижения К_опт, то есть продолжительность процедуры разрушения клеточной биомассы и экстракции фермента, не нормируется и составляет 3÷7 часов, в зависимости от биохимических параметров исходной биомассы клеток, а также от выбранных условий проведения процесса по температуре и концентрациям биомассы клеток и бутилацетата. Разрушенную клеточную биомассу отделяют от бесклеточного экстракта центрифугированием и промывают буфером, присоединяя промывные воды к бесклеточному экстракту. Синтетазная активность бесклеточного экстракта (в отношении синтеза цефалексина) - 14÷16 МЕ/мл¹ (¹ За международную единицу (ME) ферментативной активности препарата в отношении какой-либо биокаталитической трансформации принимают такое количество этого препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата (или образование 1 мкмоля продукта) в выбранных условиях за 1 минуту); удельная активность - 2,5÷4,5 МЕ/мг белка; выход активности процедуры извлечения фермента количественный.

С целью осаждения ферментных агрегатов к бесклеточному экстракту добавляют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000÷10000, взятый в количестве, 0,25÷0,30 г/мл бесклеточного экстракта, в зависимости от молекулярной массы полиэтиленгликоля. Процедуру осуществляют при температуре 2÷4°C при перемешивании в течение времени, необходимого для полного растворения полиэтиленгликоля (15÷30 мин). Затем для поперечной сшивки ферментных агрегатов в реакционную смесь вносят глутаровый альдегид в количестве, необходимом для создания его относительной концентрации 1·10^-2÷5·10^-2 моль/мг белка, и проводят модификацию и сшивку белков в течение 2 часов при слабом перемешивании при температуре 2÷4°C.

Биокатализатор в виде поперечно-сшитых ферментных агрегатов отделяют от реакционной смеси вакуумной фильтрацией и отмывают буфером.

Общая продолжительность процедуры получения биокатализатора - 12÷15 часов. Согласно примерам 1 и 2 из ближайшего аналога способа получения гетерогенного биокатализатора, съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (бесклеточного экстракта) на стадии получения CLEAs - 10 МЕ/мл и 5 мг сух./мл, соответственно.

Активность биокатализатора - ближайшего аналога составляет 1300÷2200 МЕ/г сух.

Согласно ближайшему аналогу способа синтеза аминобета-лактамных антибиотиков под действием биокатализатора на основе AEH из природного штамма Xanthomonas rubrilineans лучший результат достигнут при синтезе аминоцефалоспоринового антибиотика цефалексина путем ацилирования бета-лактамсодержащего полупродукта 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) метиловым эфиром Д-аминофенилуксусной кислоты (МЭФГ) в водно-органической среде (в присутствии многоатомного спирта этиленгликоля).

Процесс синтеза цефалексина под действием биокатализатора, полученного согласно ближайшему аналогу, осуществляют в следующих условиях: содержание этиленгликоля в исходной реакционной смеси - 50 об.%; температура - 5°C; pH 6,0÷6,2; начальная концентрация 7-АДЦК - 30 мг/мл; молярное соотношение МЭФГ и 7-АДЦК в исходной реакционной смеси - 2,5:1; нагрузка по ферментативной активности - 40 МЕ/мл; нагрузка по массе биокатализатора - 20 мг сух./мл; продолжительность процесса - 180 мин. Выход цефалексина по 7-АДЦК составляет 98,3%.

Основные недостатки ближайших аналогов гетерогенного биокатализатора на основе AEH из природного штамма Xanthomonas rubrilineans, способа его получения и способа синтеза аминобета-лактамных антибиотиков под действием этого биокатализатора следующие:

1. Сложность, многостадийность и значительная продолжительность процедуры химического лизиса, используемой для извлечения фермента из биомассы клеток и перевода его в раствор.

2. Низкая синтетазная и удельная активности исходного ферментного раствора для получения CLEAs, в качестве которого в ближайшем аналоге выступает бесклеточный экстракт (14÷6 МЕ/мл и 2,2÷4,5 МЕ/мг белка, соответственно).

3. Низкий съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (бесклеточного экстракта) на стадии получения CLEAs (10 МЕ/мл и 5 мг сух./мл, соответственно).

4. Относительно низкая синтетазная активность биокатализатора в форме CLEAs (1300÷2200 МЕ/г сух.).

5. Необходимость длительного (180 мин) проведения биокаталитического процесса в неблагоприятных операционных условиях: высокое содержание этиленгликоля в реакционной смеси (50 об.%); низкая температура (5°C); высокая нагрузка по активности и массе биокатализатора (40 МЕ/мл и 20 мг сух./мл, соответственно) для достижения высокого выхода целевого продукта при синтезе цефалексина (98,3% согласно Примеру 6 ближайшего аналога).

Задачи заявляемой группы изобретений:

- разработать более эффективный способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из штамма бактерий, содержащих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans;

- повысить синтетазную активность гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из штамма бактерий, содержащих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans;

- расширить арсенал способов синтеза аминобета-лактамного антибиотика путем ацилирования ключевого бета-лактамного соединения соответствующим производным эфира D-аминофенилуксусной кислоты под действием гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из штамма бактерий, содержащих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans.

Задачи решены путем:

- разработки способа получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli, несущих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans, включающего получение биомассы бактерий путем культивирования этого штамма в подходящих условиях, разрушения клеток полученной биомассы методом гомогенизации высокого давления с образованием гомогената и последующей иммобилизации гидролазы эфиров альфа-аминокислот путем формирования ферментных агрегатов непосредственно из полученного гомогената под действием сульфата аммония или полиэтиленгликоля, в присутствии водорастворимого производного аминополисахарида хитозана и поперечной сшивки глутаровым альдегидом этих агрегатов, содержащих хитозан;

- получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli ВКПМ В-11271, несущих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans;

- получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli ВКПМ В-11246, несущих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans;

- разработки способа синтеза аминобета-лактамного антибиотика путем ацилирования ключевого бета-лактамного соединения соответствующим производным эфира D-аминофенилуксусной кислоты под действием гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот, полученного заявляемым способом из рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli, несущего ген aehR из Xanthomonas rubrilineans.

Заявляемый способ получения гетерогенного биокатализатора в общем виде

Для осуществления способа выращивают биомассу клеток рекомбинантного штамма Escherichia coli, несущего ген aehR из Xanthomonas rubrilineans путем индуцируемого биосинтеза на среде LB, следующего состава, в мас.%: бактотриптон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 1, вода - остальное, содержащей 10÷25 мкг/мл канамицина; при температуре 35÷40°C; со скоростью перемешивания 180÷240 об/мин; при концентрации индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактозида (ИПТГ) 0,8÷1,2 мМ. Время культивирования до индукции 2,5÷3,5 часа; время культивирования после индукции 2,5÷5,5 часов. Биомассу отделяют центрифугированием при 3000÷5000 об/мин и температуре 2÷8°C, промывают 0,1 М фосфатным буфером с pH 7,0÷8,0.

Затем биомассу суспендируют в 0,1 М фосфатном буфере при pH 7,0÷8,0, взятом в количестве 3÷6 мл буфера на 1 г влажной биомассы клеток. Полученную клеточную суспензию охлаждают до 2÷4°C и пропускают через гомогенизатор высокого давления French Press (THERMO ELECTRON CORPORATION, США) при рабочем давлении не менее 150 мПа. Ячейку аппарата промывают охлажденным буфером и промывные воды присоединяют к клеточному гомогенату. Выход активности на стадии получения клеточного гомогената по отношению к активности исходной биомассы клеток составляет (100±5)%, то есть является количественным в пределах ошибки эксперимента.

Полученный клеточный гомогенат используют без какой-либо очистки в качестве исходного ферментного раствора для иммобилизации фермента AEH путем получения ферментных агрегатов и их поперечной сшивки в присутствии водорастворимого производного аминополисахарида хитозана (в частности, сукцината или ацетата хитозана). Все операции осуществляют при температуре 2÷4°C (ледяная баня). В клеточный гомогенат при перемешивании вносят водный раствор хитозана в количестве, обеспечивающем его концентрацию в реакционной смеси 0,2÷0,6 вес.%. С целью формирования ферментных агрегатов к реакционной смеси добавляют осадитель, взятый в количестве, необходимом для полного осаждения целевого фермента, а именно: сульфат аммония, 0,45÷0,65 г/мл клеточного гомогената или полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000÷8000 Да, 0,23÷0,35 г/мл клеточного гомогената. Процедуру осуществляют при перемешивании в течение времени, необходимого для полного растворения осадителя (15÷30 мин).

Затем в реакционную смесь, представляющую собой суспензию ферментных агрегатов, содержащую хитозан, вносят водный раствор глутарового альдегида в количестве, необходимом для создания его концентрации в реакционной смеси 0,25÷3,0%, и проводят сшивку белков в течение 1 часа при слабом перемешивании. Полученный таким образом гетерогенный биокатализатор в форме CLEAs отделяют от реакционной смеси вакуумной фильтрацией или центрифугированием при 3000÷5000 об/мин и отмывают до бесцветных промывных вод.

Общая продолжительность процедуры получения гетерогенного биокатализатора из биомассы клеток - 2,5÷3,0 часа. Съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (клеточного гомогената) на стадии получения CLEAs - 220÷360 МЕ/мл и 25÷45 мг сух./мл, соответственно.

Характеристика заявляемых гетерогенных биокатализаторов

- Гетерогенный биокатализатор (БК) в форме содержащих хитозан поперечно-сшитых ферментных агрегатов на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-11271, несущего ген aehR из Xanthomonas rubrilineans, обладает активностью (в отношении синтеза цефалексина), 4500÷13000 МЕ/г сух. БК; содержание связанного хитозана - не более 200 мг/г сух. БК.

- Гетерогенный биокатализатор в форме содержащих хитозан поперечно-сшитых ферментных агрегатов на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ B-11246, несущего ген aehR из Xanthomonas rubrilineans, обладает активностью (в отношении синтеза цефалексина), 4500÷8500 МЕ/г сух. БК; содержание связанного хитозана - не более 170 мг/г сух. БК.

Заявляемый способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика в общем виде

С использованием заявляемого гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs, проводят ферментативный синтез аминобета-лактамного антибиотика: цефалексина или цефаклора или цефпрозила или ампициллина или амоксициллина путем ацилирования ключевого бета-лактамного соединения, взятого в концентрации 5÷40 мг/мл, соответствующим производным эфира D-аминофенилуксусной кислоты, в частности метиловым эфиром D-фенилглицина или D-пара-гидроксифенилглицина, взятым в молярном избытке 1,5÷6,0. Реакцию синтеза проводят при pH 5,9÷6,3 и температуре 20÷40°C в водной среде или в смесях воды с многоатомным спиртом этиленгликолем при содержании последнего в реакционной смеси 30÷40%. Содержание гетерогенного биокатализатора в реакционной смеси варьируют от 4 до 15 МЕ/мл (0,3÷3,3 мг сух./мл), так, чтобы длительность процесса не превышала 90 мин.

Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими примерами, в которых приведена активность ферментных препаратов по синтезу цефалексина. Ее определяют по начальной скорости образования целевого продукта в следующих условиях: pH 6,0÷6,2, температура (40±1)°C, концентрации субстратов - (0,040±0,002) моль/л 7-аминодезацетокси-цефалоспорановой кислоты и (0,080±0,004) моль/л метилового эфира D-фенилглицина. Содержание образовавшегося цефалексина в реакционной смеси определяют методом Высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Содержание белка в препаратах определяют традиционными методами [Biotechnol. Appl. Biochem. 29: 99 (1999)], а содержание сухих веществ весовым методом после высушивания препарата при (105±1)°C до постоянной массы.

Пример 1. Получение клеточного гомогената, содержащего гидролазу эфиров альфа-аминокислот, с использованием рекомбинантного штамма Е. coli ВКПМ В-11271

Исходным посевным материалом служит культура E. coli ВКПМ B-11271, выращенная на чашках Петри с агаризованной средой. Посевной материал для засева ферментационных колб выращивают при температуре 37°C в течение 17 часов в пластиковых пробирках, содержащих 6 мл жидкой питательной среды LB, следующего состава в мас.%: бактотриптон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 1, вода - остальное, в которую добавляют канамицин в количестве 17 мкг/мл.

Процесс биосинтеза ведут к колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл указанной среды. Посевной материал вносят в ферментационную среду в количестве, необходимом для создания его концентрации 0,5 об.%. Процесс культивирования продуцента ведут при температуре 37°C на круговой качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение 3 часов, после чего в культуральную жидкость добавляют индуктор биосинтеза изопропил-β-D-1-тиогалактозид до концентрации 1 мМ. Ферментацию продолжают при тех же условиях в течение еще 4 часов. Общее время культивирования продуцента - 7 часов.

Биомассу клеток отделяют центрифугированием при 5000 об/мин, промывают 0,1 М фосфатным буфером, pH 7.5 и вновь отделяют центрифугированием. Из 8 л ферментационной среды (80 колб) получают 46,4 г влажной биомассы клеток с содержанием сухих веществ 19,7%, синтетазной активностью 3770 МЕ/г влажн., 19150 МЕ/г сух., удельной активностью 41,2 МЕ/мг белка.

Биомассу клеток (26,4 г влажн.) суспендируют в 170 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 7,5 (4 мл на 1 г влажн.). Полученную клеточную суспензию охлаждают до 4°C и пропускают через French Press при рабочем давлении 207 мПа. Ячейку аппарата промывают охлажденным буфером, и промывные воды присоединяют к первой порции клеточного гомогента. Общий объем полученного клеточного гомогената - 270 мл, pH 7,1, синтетазная активность - 650 МЕ/мл, содержание белка - 15,8 мг белка/мл, удельная активность - 41,3 МЕ/мг белка. Выход активности процедуры получения клеточного гомогената - 100,3%.

Пример 2. Получение клеточного гомогената, содержащего гидролазу эфиров альфа-аминокислот, с использованием рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ В-11246

Биосинтез осуществляют по Примеру 1, но исходным посевным материалом служит культура E. coli ВКПМ В-11246, время биосинтеза после индукции - 3 часа, общее время биосинтеза - 6 часов.

Из 2 л ферментационной среды (20 колб) получают 7,37 г влажной биомассы клеток с содержанием сухих веществ 22,1%, синтетазной активностью 2990 МЕ/г влажн., 13530 МЕ/г сух., удельной активностью 30,0 МЕ/мг белка.

Получение клеточного гомогената из биомассы клеток осуществляют согласно Примеру 1. Общий объем полученного клеточного гомогената - 55 мл, pH 7,0, синтетазная активность - 405 МЕ/мл, содержание белка - 13,6 мг белка/мл, удельная активность - 29,8 МЕ/мг белка. Выход активности процедуры получения клеточного гомогената - 101,1%.

Таблица 1
Характеристика активности биомассы клеток и ферментных растворов гидролазы эфиров альфа-аминокислот при получении заявляемого гетерогенного биокатализатора
№ (Пример)	Штамм	Биомасса клеток	Исходный	Раствор для иммобилизации
Синтетазная активность, МЕ/г сух.	Удельная активность, МЕ/мг белка	Форма раствора	Синтетазная активность, МЕ/мл	Удельная активность, МЕ/мг белка
Заявляемый способ (Пример 1)	E. coli ВКПМ В-11271	19150	41,2	Клеточный гомогенат после French Press	650	41,3
Заявляемый способ (Пример 2)	E. coli ВКПМ B-11246	13530	30,0	405	29,8
Способ - ближайший аналог (Пример 1)	Xanthomonas rubrilineans ВКПМ B-9915	450	Нет данных	Бесклеточный экстракт после химического лизиса и отделения разрушенных клеток	16,0	3,8
Способ - ближайший аналог (Пример 2)	Xanthomonas rubrilineans CGMCC №2339	360	Нет данных	15,7	4,5

В Таблице 1 обобщены характеристики полученных согласно заявляемому способу образцов биомассы клеток рекомбинантных штаммов-продуцентов гидролазы эфиров альфа-аминокислот и растворов для иммобилизации фермента в форме CLEAs, а также соответствующие характеристики образцов способа - ближайшего аналога. Представленные результаты демонстрируют, что согласно заявляемому способу из биомассы клеток высокопродуктивных рекомбинантных штаммов простым одностадийным методом гомогенизации высокого давления получают высокоактивный раствор высокой степени чистоты, пригодный для дальнейшей иммобилизации без какой-либо очистки. Согласно способу - ближайшему аналогу получение раствора, пригодного для иммобилизации, является сложной многостадийной процедурой, обеспечивающей при этом значительно меньшую активность и чистоту этого раствора.

Пример 3. Получение заявляемого гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ В-11271

Осадитель - сульфат аммония; дополнительный амино-содержащий компонент - сукцинат хитозана.

В качестве исходного ферментного раствора для получения гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs используют клеточный гомогенат, полученный по Примеру 1.

Процедуру осаждения ферментных агрегатов и их сшивки осуществляют в стеклянном стакане вместимостью 50 мл, помещенном в ледяную баню на магнитную мешалку. В стакан вносят 25 мл клеточного гомогената, полученного по Примеру 1, охлаждают его до 4°C и при постоянном перемешивании добавляют 2,5 мл водного раствора сукцината хитозана с концентрацией 5 мас.%, чтобы обеспечить его концентрацию в реакционной смеси (после внесения осадителя) 0,4 мас.%. Затем при постоянном перемешивании и контроле pH в течение 20 мин порциями вносят 12,5 г сульфата аммония (0,5 г/мл клеточного гомогената), чтобы обеспечить полноту осаждения целевого фермента АЕН. Значение pH поддерживают в диапазоне 7,0±0,5.

После полного растворения последней порции осадителя в реакционную смесь, представляющую собой суспензию ферментных агрегатов, содержащих сукцинат хитозана, при перемешивании вносят сшивающий агент - глутаровый альдегид. Используют 1,38 мл 25% водного раствора глутарового альдегида, чтобы обеспечить концентрацию сшивающего агента в конечной реакционной смеси 1,0%. С учетом объема всех вносимых компонентов, а также увеличения объема реакционной смеси в 1,2 раза при добавлении осадителя, объем конечной реакционной смеси составляет 34 мл. Реакционную смесь при слабом перемешивании инкубируют на ледяной бане в течение 1 часа для осуществления сшивки белков. В результате получают гетерогенный биокатализатор в форме CLEAs, который отделяют от реакционной смеси методом вакуумной фильтрации и отмывают на пористом стеклянном фильтре до бесцветных промывных вод.

Из 25 мл клеточного гомогената получают 7,67 г влажного биокатализатора в форме CLEAs с содержание сухих веществ 10,8%. Синтетазная активность полученного биокатализатора - 1080 МЕ/г влажн., 10010 МЕ/г сух. Содержание связанного хитозана - не более 150 мг/г сух.

Съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (клеточного гомогената) на стадии получения CLEAs - 330 МЕ/мл и 33,1 мг сух./мл, соответственно.

Пример 4. Получение заявляемого гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ B-11246

Осадитель - сульфат аммония; дополнительный амино-содержащий компонент - сукцинат хитозана.

Получение гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs осуществляют по Примеру 3 с той разницей, что качестве исходного ферментного раствора используют 25 мл клеточного гомогената, полученного по Примеру 2 из биомассы клеток штамма E. coli ВКПМ B-11246.

Сшивку ферментных агрегатов осуществляют при концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси 1,0%.

Получают 8,20 г влажного биокатализатора в форме CLEAs с содержание сухих веществ 12,1%. Синтетазная активность полученного биокатализатора - 680 МЕ/г влажн., 5620 МЕ/г сух. Содержание связанного хитозана - не более 150 мг/г сух.).

Съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (клеточного гомогената) на стадии получения CLEAs - 220 МЕ/мл и 39,7 мг сух./мл, соответственно.

Пример 5. Получение гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ B-11271

Осадитель - сульфат аммония; дополнительный амино-содержащий компонент - ацетат хитозана.

Получение гетерогенного биокатализатора осуществляют по Примеру 3, исходя из 25 мл клеточного гомогената, полученного по Примеру 1, с той разницей, что в реакционную смесь перед формированием агрегатов вносят 2,5 мл водного раствора ацетата хитозана с концентрацией 5 мас.%.

Сшивку ферментных агрегатов осуществляют при концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси 0,5%.

В результате получают 6,57 г влажного биокатализатора в форме CLEAs с синтетазной активностью - 1370 МЕ/г влажн., 13050 МЕ/г сух и содержанием связанного хитозана не более 180 мг/г сух.

Съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (клеточного гомогената) на стадии получения CLEAs - 360 МЕ/мл и 27,6 мг сух./мл, соответственно.

Пример 6. Получение гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот из рекомбинантного штамма E. coli ВКПМ B-11271

Осадитель - полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 Да (ПЭГ 6000); дополнительный амино-содержащий компонент - сукцинат хитозана.

Получение гетерогенного биокатализатора осуществляют по Примеру 3, исходя из 25 мл клеточного гомогената, полученного по Примеру 1, с той разницей, что для формирования агрегатов в реакционную смесь, содержащую клеточный гомогенат и сукцинат хитозана вносят 7,0 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 Да (0,28 г/мл клеточного гомогената), чтобы обеспечить полноту осаждения целевого фермента АЕН. Поддержания pH не требуется.

Сшивку ферментных агрегатов осуществляют при концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси 1,0%.

Получают 5,67 г влажного биокатализатора в форме CLEAs с содержание сухих веществ 12,1%. Синтетазная активность полученного биокатализатора - 970 МЕ/г влажн., 8020 МЕ/г сух. Содержание связанного хитозана - не более 180 мг/г сух.).

Съем синтетазной активности и сухой массы биокатализатора с единицы объема исходного ферментного раствора (клеточного гомогената) на стадии получения CLEAs - 220 МЕ/мл и 24,7 мг сух./мл, соответственно.

Пример 7. Получение гетерогенного биокатализатора в форме CLEAs на основе гидролазы эфиро