2535898 - Профилактика, лечение и диагностика инфекции, вызванной бактериями p.gingivalis

Профилактика, лечение и диагностика инфекции, вызванной бактериями p.gingivalis

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области биохимии, в частности к химерным или гибридным белкам для индуцирования иммунного ответа против Р. gingivalis. Раскрыта композиция для индуцирования иммунного ответа против Р. gingivalis, содержащая эффективное количество одного из вышеуказанных химерных или гибридных белков, способ профилактики состояния или заболевания, связанного с Р. Gingivalis, и способ снижения частоты или тяжести состояния или заболевания, связанного с Р. gingivalis с их использованием. Также раскрыто применение вышеуказанных химерных или гибридных белков для определения антител к Р. gingivalis в биологическом образце. Изобретение позволяет эффективно индуцировать иммунный ответ против Р. gingivalis. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 22 пр.

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к пептидам и химерным или гибридным белкам и применению указанных белков для получения клеточного и гуморального ответа для профилактики и лечения состояний и заболеваний, вызываемых бактерией Р. Gingivalis.

Уровень техники

Хронический периодонтит представляет собой воспалительное заболевание опорных тканей зубов, приводящее к резорбции альвеолярных отростков и потере зубов. Это заболевание представляет собой острую проблему в области здравоохранения во всех странах и, по оценкам, затрагивает до 15% взрослого населения, при этом в 5-6% случаев оно принимает тяжелые формы.

Развитие и прогрессирование хронического периодонтита связывают с конкретными грамотрицательными бактериями поддесневой бляшки. Присутствие бактерий Porphyromonas gingivalis в поддесневой бляшке тесно связано с заболеванием.

Сообщалось, что продолжительное присутствие бактерии Р. gingivalis в поддесневой бляшке у пациентов с периодонтитом после лечения (удаления поддесневых отложений и полировки корней зуба) тесно связано с прогрессирующим разрушением альвеолярных отростков. Более того, было показано, что увеличение количества клеток бактерии Р. gingivalis в поддесневой бляшке коррелирует с тяжестью заболевания, которую определяют по потере прикрепления зуба, глубине периодонтитного кармана и кровотечению при зондировании.

Показано, что инфекция ротовой полости Р. gingivalis вызывает разрушение костей периодонта у мышей, крыс и приматов, отличных от человека. Также появляется все больше подтверждений взаимосвязи между периодонтитом и инфекцией Р. gingivalis и сердечно-сосудистыми заболеваниями и некоторыми типами рака.

Сообщалось, что ряд факторов вирулентности способствует патогенности Р. gingivalis, включая LPS, фимбрии, гемагглютинин, гемолизин и внеклеточные гидролитические ферменты (особенно Аrq-Х и Lys-X - специфичные протеиназы), известные как "трипсиноподобные ферменты Р. gingivalis".

Указанная проблема здравоохранения настолько велика, что существует потребность в разработке иммунной сыворотки, в частности специфических антител, которые обеспечивают сильный протективный ответ на инфекцию Р. Gingivalis, и средствах для ее обеспечения.

Одна из проблем состоит в том, что неясно, как получить сильный протективный ответ на инфекцию Р. gingivalis при том, что существует множество факторов вирулентности, из которых можно выбирать.

Остаются не до конца понятными и сравнительная иммуногенность эпитопов факторов вирулентности, а также сравнительная иммуногенность эпитопов конкретного фактора, в частности, когда неясно остаются ли еще неизвестные эпитопы.

Одна из конкретных проблем заключается в том, что многие факторы вирулентности состоят из множества доменов, и их трудно экспрессировать таким образом, чтобы факторы имели ту же конформацию, которую имеют факторы Р. gingivalis. Кроме того, при экспрессии этих доменов в виде отдельных единиц, т.е. по отдельности от других доменов факторов вирулентности, они склонны приобретать конформацию, отличную от той, которую имеют факторы Р. gingivalis.

Также неизвестно, какой из множества различных способов модификации иммуногенности фактора вирулентности с наибольшей вероятностью будет обеспечивать протективный иммунный ответ.

В ходе исследований, положенных в основу настоящего изобретения, авторы изобретения обнаружили пептиды, аминокислотная последовательность которых идентична или гомологична аминокислотной последовательности, которая образует участок трипсиноподобного фермента Р. gingivalis, где указанный участок определяет сайт указанного фермента для расщепления пептидной связи, расположенной на С-конце по отношению к остаткам Lys или Аrq в пептиде, содержащем Lys или Аrq, и встроили подобный пептид в химерный или гибридный белок, который при применении в качестве вакцины обеспечивает лучшую защиту тканей периодонта от разрушения, чем очищенный комплекс протеиназы и адгезина, образованный природным трипсиноподобным ферментом Р. Gingivalis, или убитые цельные клетки.

Краткое описание изобретения

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен химерый или гибридный белок для индуцирования иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis, при этом указанный белок содержит первый пептид, соединенный непосредственно или с помощью линкера со вторым пептидом, при этом:

(A) указанный первый пептид содержит:

(i) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID No:1;

или

(ii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID No:2;

(B) указанный второй пептид содержит:

(i) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Lys-X-протеиназы бактерии Р. gingivalis; или

(ii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Lys-X-протеиназы бактерии Р. Gingivalis; или

(iii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена НаqA бактерии Р. gingivalis.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает химерный или гибридный белок для индуцирования иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis, причем указанный белок содержит первый пептид, соединенный непосредственно или с помощью линкера с полипептидом, при этом:

(A) указанный пептид содержит:

(i) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной SEQ ID No:1;

или

(B) указанный полипептид содержит:

(ii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Аrq-Х-протеиназы бактерии Р. Gingivalis; или

(iii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена НаqА бактерии Р. gingivalis.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение обеспечивает пептид для стимулирования иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis, при этом пептид содержит последовательность:

(i) которая является идентичной или гомологичной одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No: 64-66; и

(ii) которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID No: 67 или 68.

Согласно одному аспекту пептид, содержащий последовательность, которая является идентичной или гомологичной одной из последовательностей, представленных в SEQ ID No: 64-68, может быть обеспечен в форме химерного или гибридного белка, в котором пептид соединен непосредственно или с помощью линкера со вторым пептидом, при этом второй пептид содержит:

(i) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезивного; домена Lys-X- протеиназы бактерии Р. gingivalis; или

(ii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Аrg-Х-протеиназы бактерии Р. Gingivalis; или

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает композицию, такую как антигенная композиция, в частности вакцинную композицию, содержащую химерный или гибридный белок или пептид, подробно описанный выше, возможно в комбинации со вспомогательным веществом.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает способ профилактики или снижения частоты или тяжести состояний или заболеваний, вызываемых инфекцией Р. gingivalis, у субъекта, который включает введение указанному субъекту химерного или гибридного белка согласно описанию выше или композиции согласно описанию выше.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает применение химерного или гибридного белка согласно описанию выше или композиции согласно описанию выше в составе лекарственного средства или для приготовления лекарственного средства для профилактики или снижения частоты или тяжести состояний или заболеваний, вызываемых инфекцией Р. gingivalis, у субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает антитело, в частности моноклональное антитело, полученное против химерного или гибридного белка или пептида, подробно описанного выше.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает способ профилактики или снижения тяжести состояний или заболеваний, вызываемых инфекцией Р. gingivalis, у субъекта, который включает введение указанному субъекту антитела согласно описанию выше.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает применение антитела согласно описанию выше в составе лекарственного и средства или для приготовления лекарственного средства для профилактики или снижения частоты или тяжести заболеваний или состояний, вызываемых инфекцией Р. Gingivalis, у субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую химерный или гибридный белок, как подробно описано выше, возможно, функционально соединенную с по меньшей мере одним регуляторным элементом.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, а также клетку прокариот или эукариот, содержащую указанную молекулу нуклеиновой кислоты.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает способ профилактики или снижения тяжести состояний или заболеваний вызываемых инфекцией Р. Gingivalis, у субъекта, который включает введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты согласно описанию выше, вектора согласно описанию выше или клетки, прокариот или эукариот согласно описанию выше.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает применение молекулы нуклеиновой кислоты согласно описанию выше, вектора согласно описанию выше или клетки прокариот или эукариот согласно описанию выше в составе лекарственного средства или для приготовления лекарственного средства для профилактики или снижении тяжести заболеваний или состояний, вызываемых инфекцией Р. Gingivalis, у субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики или наблюдения за состоянием или заболеванием, вызываемым инфекцией Р. Gingivalis, у субъекта, который включает применение химерного или гибридного белка согласно описанию выше для определения антител к Р. gingivalis в образце биологического материала, полученном от указанного субъекта.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает применение химерного или гибридного белка согласно описанию выше для определения антител к Р. gingivalis в образце биологического материала, полученном от указанного субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики или наблюдения за состоянием или заболеванием, вызываемым инфекцией Р. Gingivalis, у субъекта, который включает применение антитела согласно описанию выше для определения присутствия Р. gingivalis в образце биологического материала, полученном от указанного субъекта.

Согласно данному аспекту настоящее изобретение также обеспечивает применение антитела согласно описанию выше для определения присутствия Р. gingivalis в образце биологического материала, полученном от указанного субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает применение пептида, содержащего часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности Lys-X или Аrg-Х-протеиназы бактерии Р. gingivalis, или нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид, для получения химерного или гибридного белка для стимулирования иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis. Согласно данному аспекту указанный пептид может содержать последовательность, представленную в одной из SEQ ID No: 17, 18, 25 или 26.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показаны результаты окрашивания Кумасси геля после SDS-PAGE с рекомбинантными белками Кдр. Полоса 1=KAS2-KLA1, полоса 2=KLA1, полоса 3=KsA1, полоса 4=KAS1-KsA1. Маркеры молекулярного веса указаны в кДа.

На Фигуре 2 показано распознавание антителом пептида KAS2 и убитых формальдегидом клеток Р. gingivalis W50. (А) Пептид KAS2 исследовали в реакции с сывороткой, выработанной на убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 (FK-W50), рекомбинантными белками KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, и синтетическим конъюгатом KAS2-DT и PBS методом ELISA. (В) убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 исследовали в реакции с сывороткой, выработанной на убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 (FK-W5D) рекомбинантными белками KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, KLA1 PBS методом ELISA. Ответ антител выражали в полученном титре ELISA при OD415 за вычетомдвойного фонового уровня, каждое значение титра представляет собой среднее ± стандартное отклонение трех значений.

На Фигуре 3 показана резорбция костей моляров верхней челюсти в горизонтальной плоскости, вызванная инфекцией Р. Gingivalis, у мышей, иммунизированных по отдельности рекомбинантными белками и рекомбинантными химерными белками, убитыми формалином клетками Р. gingivalis и вспомогательным веществом (PBS, IFA), или неинфицированных перорально (неиммунизированных) мышей. На фигуре 3 KAS2-KLA1 изображен в виде AS2-LA1, KLA1 изображен в виде LA1, KAS1-KsA1 изображен в виде AS1-sA1, KsA1 изображен в виде sA1. Резорбцию костей выражали в квадратных миллиметрах (мм²) от цементно-эмалевого соединения (CEJ) до гребня альвеолярной кости (АВС) щечной стороны каждого моляра верхней челюсти с левой и правой стороны челюсти. Данные имели нормальное распределение согласно критерию однородности дисперсии Левена, и представлены в виде среднего (n=12) в мм²; их анализировали с помощью одностороннего анализа дисперсии и Т3-критерия Даннета. (* обозначает группу, в которой наблюдалась значительно (Р<0.001) меньшая резорбция кости по сравнению с контрольной (инфицированной) группой; t обозначает группу, в которой наблюдалась значительно (Р<0,001) большая резорбция кости по сравнению с группой AS2-LA1).

На Фигуре 4 показаны ответы подклассов антител сыворотки иммунизированных мышей в модели периодонтита. Сыворотки мышей: А (до пероральной иммунизации) и В (после пероральной иммунизации), иммунизированных рекомбинантными белками KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1 и убитыми формалином клетками Р. gingivalis штамма W50, использовали для постановки анализа ELISA с убитыми формалином Р. gingivalis штамма W50 в качестве иммобилизированного антигена. Ответы антител IgG (черные полоски), lgG1 (серые полоски), lgG2a (белые полоски), lgG2b (полоски с горизонтальной исчерченностью), lgG3 (полоски с диагональной исчерченностью) выражали в виде полученного титра ELISA (log 2) за вычетом фонового уровня, каждое значение титра представляет собой среднее ± стандартное отклонение трех значений.

На Фигуре 5 показаны результаты анализа PEPSCAN пептид-специфичной реактивности антитела на перекрывающиеся пептиды, представляющие последовательность 433-468 пептида KAS2. (A) KAS2 перекрывающиеся пептиды (перекрывающиеся пептиды) в реакции с сыворотками KAS1-KsA1 (белые полоски), KAS2- KLA1 (черные полоски). (В) KAS2 перекрывающиеся пептиды (перекрывающиеся пептиды) в реакции с сывороткой к конъюгату KAS2-DT. Каждая полоска показывает реактивность антитела (оптическая плотность [OD] при 415 нм).

На Фигуре 6 показано, что гибрид AS2-LA1 вызывает иммунный ответ у аутбредных мышей, при котором распознаются целые клетки Р. Gingivalis и комплекс RgpA-Kgp.CD1 аутбредных мышей иммунизировали гибридом AS2-LA1 (50 мг/мышь) и полученные сыворотки использовали для постановки анализ ELISA с AS2-LA1 (А), убитыми формалином клетками Р. gingivalis штамма W50 (B) и комплексом RgpA-Kgp (С) в качестве иммобилизированных антигенов. На данной Фигуре KAS2-KLA1 изображен в виде AS2-LA1. Определяли титр каждого изотипа иммуноглобулина и полученные данные выражали в виде полученного титра ELISA ('000) за вычетом двойного фонового уровня, где каждое значение титра представляет собой среднее ± стандартное отклонение трех значений.

На Фигуре 7 изображена модель Кдр протеиназы. KAS2 [Asn433-Lys468], (A) KAS4 [Asp388-Val395] (В), KAS5 [Asn510-Asp516] (С) и KAS6 [lle570-Tyr580] (D).

Подробное описание изобретения

Следует понимать, что изобретение, раскрытое и определенное в данном описании, распространяется на все альтернативные комбинации двух или более отдельных признаков, упоминаемых или очевидных из текста или чертежей. Все указанные различные комбинации составляют различные альтернативные аспекты изобретения.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что участки трипсиноподобных ферментов бактерии Р. gingivalis, которые располагаются по обе стороны или иным образом определяют каталитический или активный сайт расщепления пептидной связи, обладают большой иммуногенностью и действительно достаточны для обеспечения гуморального ответа на инфекцию Р. gingivalis. В частности, было обнаружено, что химерный или гибридный белок, содержащий один или более подобных участков, обеспечивает защиту от разрушения альвеолярного отростка челюсти, большую, чем иммунная сыворотка, полученная против цельных клеток, и другие иммуногены. Это открытие является особенно неожиданным, т.к. до настоящего момента считали, что каталитический домен трипсиноподобных ферментов бактерии Р. gingivalis является сравнительно слабо иммуногенным.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает химерный или гибридный белок для стимулирования ответа на инфекцию Р. gingivalis, причем указанный белок содержит первый пептид, соединенный непосредственно или с помощью линкера со вторым пептидом, при этом:

(A) указанный первый пептид содержит:

или

(B) указанный второй пептид содержит:

(ii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Агд-Х-протеиназы бактерии Р. gingivalis; или

(iii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена НаgА бактерии Р. gingivalis. В настоящем описании термин «пептид» обозначает последовательность, содержащую до 40 аминокислотных остатков, предпочтительно 5-40 аминокислотных остатков.

Согласно одному варианту реализации вместо термина «второй пептид» используется термин «полипептид». Термин «полипептид» обозначает аминокислотную последовательность, составляющую в длину по меньшей мере приблизительно 40 аминокислотных остатков.

Таким образом, согласно другому аспекту обеспечивается химерный или гибридный белок для стимулирования иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis, при этом указанный белок содержит пептид, соединенный непосредственно или с помощью линкера с полипептидом, при этом:

(A) указанный пептид содержит:

или

(B) указанный полипептид содержит:

(ii) часть последовательности или полнуюпоследовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Агд-Х-протеиназы бактерии Р. gingivalis; или

(iii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена НаgA бактерии Р. gingivalis.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает пептид для стимулирования иммунного ответа на инфекцию Р. Gingivalis, выбранный из группы, состоящей из:

(i) последовательности, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в одной из SEQ ID No: 64-66; и

(ii) последовательности, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID No: 67 или 68.

Согласно одному аспекту изобретения, в котором пептид содержит последовательность SEQ ID No: 64-68, указанный пептид может быть обеспечен в виде химерного или гибридного белка, в котором пептид соединен непосредственно или с помощью линкера со вторым пептидом. Согласно этому варианту реализации второй пептид химерного или гибридного белка содержит:

(iii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинрвого домена Наq бактерии Р. gingivalis.

Согласно описанному выше варианту реализации термин «полипептид» используется вместо термина «второй пептид». Таким образом, согласно другому аспекту обеспечивается химерный или гибридный белок для стимулирования иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis, при этом указанный белок содержит пептид, соединенный непосредственно или с помощью линкера с полипептидом, при этом:

(А) указанный пептид содержит:

(i) последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в одной из SEQ ID No: 64-66; или

(ii) последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID No: 67 или 68; и

(В) указанный полипептид содержит:

В настоящем описании термин «гомолог» пептида или полипептида обозначает пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является гомологичной или имеет сходство с аминокислотной последовательностью указанного первого пептида или полипептида, предпочтительно по меньше мере на 90% последовательности предпочтительно по меньшей мере на 95% последовательности более предпочтительно по меньшей мере на 98% последовательности, при сравнении методом алгоритма BLAST, при этом параметры алгоритма подбирают таким образом, чтобы получить максимальное соответствие анализируемой последовательности по всей длине последовательности сравнения. Термин «сходство последовательности» обозначает точное соответствие между аминокислотами сравниваемых последовательностей. Подобные гомологи можно получать из природных вариантов или изолятов Lys-X- протеиназы или Аrg-Х-протеиназы Р. gingivalis. В другом случае гомолог может представлять собой вариант пептида или полипептида Lys-X-протеиназы или Аrg-Х-протеиназы Р. gingivalis, имеющий «консервативную замену», в котором один или более аминокислотный остаток заменен без изменения общей конформации функции пептида или полипептида, включая, но не ограничиваясь ими, замену аминокислоты на аминокислоту с похожими свойствами. Аминокислоты с похожими свойствами известны в данной области техники. Например, полярные/гидрофильные аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемыми, включают аспарагин, глутамин, серин, цистеин, треонин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; неполярные/гидрофобные аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемыми, включают глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан и метионин; кислые аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемыми, включают аспарагиновую и глутаминовую кислоты, и основные аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемыми, включают гистидин, лизин и аргинин. Предпочтительно такие варианты с консервативными заменами имеют менее 20, более предпочтительно менее 15, более предпочтительно менее 10 и наиболее предпочтительно менее 5 замен аминокислот.

Участок трипсиноподобного фермента бактерии Р. Gingivalis, в частности Lys-X-протеиназы (Кgр) или Аrg-Х-протеиназы (RgpA), который определяет сайт для расщепления пептидной связи, можно определить согласно настоящему описанию, в частности относительно Фигуры 7 и Примера 9, в которых приводится пример методики для предсказания трехмерной конформации каталитического сайта в том виде, в котором он присутствует на Р. Gingivalis для Lys-X протеиназы. Пример 10 обеспечивает способ моделирования трехмерной, конформации Аrq-Х-протеиназы.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, химерный или гибридный белок, или первая и вторая части пептида, могут быть образованы из пептидомиметика. Пептидомиметик представляет собой молекулу, которая имитирует одно или более свойство пептида, например конформацию, и которая состоит из аминокислотных остатков, некоторые из которых могут отсутствовать в природе.

Определив иммуногенные участки каталитического сайта, авторы изобретения определили последовательность различных пептидных иммуногенов, против которых может быть получен иммунный ответ. В частности, были определены следующие 6 участков, которые располагаются по обе стороны или иным образом, определяют каталитический сайт: KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 и KAS6 (см. Таблицу 1). С учетом полученной информации, авторы изобретения проанализировали базы данных последовательностей белков для определения пептидов, которые имеют гомологию с аминокислотными последовательностями, которые образуют участки, расположенные по обе стороны от каталитического сайта, и поэтому представляют собой иммуногенные эпитопы, встречающиеся у Р. gingivalis. Последовательности этих пептидов определяются структурными формулами.

Таблица 1. Последовательности, которые расположены по обе стороны от активного сайта Кgp и RgpA.

Участок	Кgp Lys - Х (нумерация согласно SEQ ID No.62)	Кqр Lys - X консенсус	RgpA Arg-X (нумерация согласно SEQ ID No.61)	RgRA Arg-X консенсус
PAS1K/ PAS1R	PAS 1 К (432-453)	LNTGVSFANYT AHGSETAWAD Р (SEQ ID NO: 30)	PAS1R (426-446)	FNGGISLANYTG HGSETAWGT (SEQ ID NO: 34)
KAS1/ RAS1	KAS1 (432-454)	LNTGV[G/S]FAN YTAHGSET[S/A] WADP[S/L] (SEQ ID NO: 27)	RAS1 (426-448)	FNGGISL[V/A]NY TGHGSETAWGT SH (SEQ ID NO: 31)
KAS2/ RAS2	KAS2 (433-468)	NTGV[G/S]FANY TAHGSET[S/A] WADP[S/L][L/V]T [A/T][T/S]Q[V/L]K ALTNK[D/N]K (SEQ ID NO: 28)	RAS2 (427-462)	NGGISL[V/A]NYT GHGSETAWGTS HFGTTHVKQLTN SNQ (SEQ ID NO: 32).
KAS3/RAS3	KAS3 (436-455)	V[G/S]FANYTAH GSET[S/A]WAD P[S/L][L/V] (SEQ ID NO: 29)	RAS3 (430-449)	ISL[V/A]NYTQH© SETAWGTSHF (SEQ ID NO: 33)
KAS4/RAS4	KAS4 (388-395)	D[S/Y][Y/S]WN[P /S][K/Q][I/V] (SEQ ID NO: 64)	RAS4 (379-386)	EGGPSADN (SEQ ID NO: 67^
KAS5/RAS5	KAS5 (510-516)	NSYWGED (SEQ ID NO: 65)	RAS5 (508-514)	[N/D]Q[S/Y]WA[S/ P]P (SEQ ID NO: 68)
KAS6	KAS6 (570-580)	IGN[V/I]THIGAH Y (SEQ ID NO: 66)

Авторы изобретения обнаружили, что химерные белки, содержащие указанные пептиды, можно использовать различным образом. Например, согласно настоящему описанию, некоторые из них вызывают гуморальный ответ, который обеспечивает высокую защиту при лечении или профилактике разрушения костей, которое наблюдается при периодонтите. Эти пептиды также можно применять для проведения диагностических анализов, в которых они позволяют обнаружить или наблюдать за особенностями сыворотки пациента, что позволяет определить инфицирован ли пациент и, если он инфицирован, требуется ли лечение и, если лечение было проведено, - оказалось ли оно эффективным.

Следует понимать, что участок трипсиноподобного фермента Р. gingivalis, который определяет сайт фермента, ответственный за расщепление пептидной связи, расположенной на С-конце от остатков Lys или Аrq, не содержит полную последовательность Lys-X-протеиназы или Аrq-Х-протеиназы.

В настоящем описании термины «гетерологичный белок» или «химерный или гибридный белок» обозначают белок, который состоит из функциональных единиц, доменов, последовательностей или участков аминокислот, полученных из различных источников, или полученных из одного источника и собранных таким образом, что их организация отличается от организации молекулы, из котопой единица, домен, последовательность или участок были получены. Общей чертой химерных или гибридных белков согласно настоящему изобретению является то, что они содержат по меньшей мере один пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая совпадает или обладает гомологией с последовательностью трипсиноподобного фермента Р. gingivalis, которая определяет каталитический сайт, ответственный за расщепление пептидной связи.

Согласно предпочтительному варианту реализации, если первый пептид содержит пептид из участка Кgp [432-468], он предпочтительно представляет собой (i) пептид, который содержит последовательность, выбранную из: VSFANYT и VGFANYT, более предпочтительно, последовательность, выбранную из GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA и VGFANYTA; или (i, i) пептид, который содержит последовательность, выбранную из:1 ETAWAD, ETSWAD, TAWADP и TSWADP, предпочтительно, последовательность, выбранную из: SETAWAO, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL и TSWADPL, более предпочтительно, последовательность, выбранную из: GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWAD PL, TAWADP LL и TSWADPLL. Более предпочтительно, данный пептид выбирают среди пептидов KAS1 [432-454]; KAS2[433-468] и KAS3[436-455], показанных в Таблице 1. В другом случае, данный пептид может представлять собой пептид PAS1K[432-453], также известный, как PAS1(K48), описанный в международной заявке на патент PCT/AU 98/00311 (WO 98/049192). Указатели последовательностей, соответствующие данным пептидам, приведены в Таблице 3.

Аналогично, согласно другому предпочтительному варианту реализации, в котором первый пептид содержит пептид из участка RgpA [426-462], данный пептид предпочтительно выбирают среди пептидов RAS1[426-448], RAS2[427-462] и RAS3[430-449], показанных в Таблице 1. В другом случае первый пептид может представлять собой пептид PAS1 R[426-446], также известный как PAS1(R45), описанный в международной заявке на патент PCT/AU 98/00311 (WO 98/049192).

В химерном или гибридном белке согласно настоящему описанию второй пептид может представлять собой пептид адгезинового домена трипсиноподобного фермента бактерии Р. gingivalis, такого как Lys-X- протеиназа (Кgр) или Аrg-Х-протеиназа (RgpA) или НаgА (см. Таблицу 2). В некоторых случаях указанные домены известны под названием гемагглютинины. В Lys-X-протеиназе предпочтительными доменами являются КА1, КА2, КАЗ, КА4, КА5, показанные в Таблице 2. В Arg-X-протеиназе предпочтительными доменами являются RA1, RA2, RА3 и RA4, показанные в Таблице 2. В НаgА предпочтительными доменами являются НаqА1, НаqА1* и НаqА1**.

Таблица 2. Адгезиновые домены протеиназ Кgр и RgpA.

	A1	sA1	LA1	A2	A3	A4	A5
Кgр Lys-X протеиназа SEQ ID No. 62	KA1 (738-1099) SEQ ID NO: 35	KsA1 (759-989) SEQ ID NO:36	KLA1 (751-1056) SEQ ID NO:37	KA2 (1157-1275) SEQ ID NO:40	КА3 (1292-1424) SEQ ID NO:41	KA4 (1427-1546) SEQ ID NO:42	KA5 1 (1548-1732) SEQ ID NO:43
RgpA Arg-X протеиназа SEQ ID No. 61	RA1 (720-1081) SEQ ID NO:38	RsA1 (831-971) SEQ ID NO:39	-	RA2 (1139-1257) SEQ ID NO: 44	RA3 (1274-1404) SEQ ID NO: 45	RA4 (1432-1706) SEQ ID NO: 46	-
HagA SEQ ID NO. 63	HagA1 (26-351) (SEQID NO: 80), HagA1* (366-625) (SEQID NO:81), HagA1 (820-1077) (SEQID NO:82) or HagA1 (1272-1529) (SEQID NO:82)

Кроме улучшения гуморального ответа на пептид согласно настоящему изобретению, такой как KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 и KAS6 или RAS1, RAS2 и RAS3, RAS4 и RAS5, при условии включения совместно с пептидом в состав химерного или гибридного белка, адгезиновый домен также содержит иммуногенные эпитопы, что создает различные особенности для запуска протективного иммунного ответа. Обнаружение того, что иммуногенные эпитопы адгезинового домена сохраняются в форме, соответствующей трипсиноподобному ферменту бактерии Р. gingivalis при обеспечении в составе химерного или гибридного белка, является неожиданным.

Следует понимать, что в данных вариантах реализации изобретения химерный или гибридный белок может содержать любой один или более пептид, выбранный среди KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 и KAS6/RAS6, совместно с любым одним или более адгезиновым доменом трипсиноподобного фермента бактерии Р. gingivalis, в частности, с любым одним или более адгезиновым доменом Lys-X-протеиназы (КА1, КА2, КА3, КА4 и КА5) или Аrg-Х-протеиназы (RA1, RA2, RA3 и RA4) или доменами НаgА, НаgА1, НаgА1* и НаgА1**.

Также следует иметь в виду, что адгезиновый домен не обязательно должен быть полностью доменом трипсиноподобного фермента бактерии Р. Gingivalis. Например, адгезиновый домен может представлять собой фрагмент подобного домена, в частности, предпочтительными фрагментами являются фрагменты KsA1 и KLA1 домена А1 Lys-X-протеиназы (см. Таблицу 2). Если домен представляет собой фрагмент адгезинового домена, он обычно содержит один или более специфичный для адгезинового домена эпитоп. Указатели последовательностей, соответствующих адгезино связанным пептидам, приведены в Таблице 3.

Согласно одному варианту реализации второй пептид или полипептид содержит последовательность, представленную в одной или более из SEQ ID No: 69-79 или одной или более из SEQ ID No 83-85.

Химерный или гибридный белок согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные пептиды, выбранные из участка Кgp [432-468]Lys-X- протеиназы, и/или один или более дополнительный пептид, выбранный из участка RgpA[426-462] Аrq-Х-протеиназы.

Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения химерный или гибридный белок содержит один или более из KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 и KAS6, или один или более из RAS1, RAS2, RAS3, RAS4 и RAS5 совместно с KsA1 или KLA1.

Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации химерный или гибридный белок может содержать по меньшей мере один дополнительный пептид, при этом указанный дополнительный пептид содержит:

(i) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной SEQ ID No:1; или

(ii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID No:2; или

(iii) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Lys-X-протеиназы бактерии Р. gingivalis, или

(iv) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена Аrg-Х-протеиназы бактерии Р. gingivalis; или

(v) часть последовательности или полную последовательность, которая является идентичной или гомологичной последовательности адгезинового домена НаqА бактерии Р. gingivalis.

Другие примеры доменов, единиц, последовательностей или участков, которые можно включать в состав х

Профилактика, лечение и диагностика инфекции, вызванной бактериями p.gingivalis

Патент 2535898