Варианты гемагглютинина и нейраминидазы гриппа

Варианты гемагглютинина и нейраминидазы гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вакцины против различных и эволюционирующих штаммов гриппа важны с точки зрения здоровья общества, а также имеют коммерческое значение, поскольку каждый год происходит инфицирование многих индивидуумов различными штаммами и типами вируса гриппа. Дети, пожилые люди, те, кто лишен адекватной медицинской помощи, и люди с нарушенным иммунитетом подвергаются особому риску смерти от таких инфекций. Осложнение проблемы инфекций гриппа состоит в том, что новые штаммы гриппа быстро эволюционируют и могут распространяться среди различных видов, тем самым вызывая необходимость непрерывного получения новых вакцин.

Многочисленные вакцины, способные вызывать защитный иммунный ответ, специфичный к таким другим вирусам/штаммам вирусов и к вирусам/штаммам вируса гриппа, получали в течение более 50 лет и они содержали цельновирусные вакцины, вакцины из расщепленных вирусов, вакцины из поверхностных антигенов и живые аттенуированные вирусные вакцины. Однако, несмотря на то что соответствующие составы вакцин любого из этих типов способны вызывать системный иммунный ответ, живые аттенуированные вирусные вакцины обладают преимуществом в виде дополнительной способности стимулировать местный иммунитет слизистых дыхательных путей. Значительная работа по получению вирусов гриппа и их фрагментов для получения вакцин проделана авторами настоящего изобретения и коллегами; см., например, заявки США №№ 60/420708, которая подана 23 октября 2002 года; 60/574117, которая подана 24 мая 2004 года; 10/423828, которая подана 25 апреля 2003 года; 60/578962, которая подана 12 июня 2004 года; и 10/870690, которая подана 16 июня 2004 года, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки.

По причине постоянного возникновения (или повторного возникновения) различных штаммов гриппа, постоянно нужны новые противогриппозные вакцины. Такие вакцины обычно создают с использованием антигенных фрагментов вновь возникающих штаммов вируса, таким образом, крайне желательны полипептиды и полинуклеотиды новых, вновь возникающих или вновь повторно возникающих штаммов вируса (в частности, последовательности антигенных генов).

Настоящее изобретение относится к новым и/или вновь выделенным вариантам гемагглютинина и нейраминидазы гриппа, которые допускают использование в получении вакцин многочисленных типов, а также в исследованиях, диагностике и т.д. Другие многочисленные преимущества станут ясны после рассмотрения приведенного ниже.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе в некоторых аспектах изобретение содержит выделенный или рекомбинантный полипептид, который выбран из: полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, кодируемую любой из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, остатками 89-1063 SEQ ID NO:1, остатками 1064-1729 SEQ ID NO:1, остатками 88-1062 SEQ ID NO:5 и остатками 1063-1728 SEQ ID NO:5; полипептида, содержащего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 и остатков 341-562 SEQ ID NO:6; полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, кодируемую открытой рамкой считывания любой из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, остатков 89-1063 SEQ ID NO:1, остатков 1064-1729 SEQ ID NO:1, остатков 88-1062 SEQ ID NO:5 и остатков 1063-1728 SEQ ID NO:5; любой альтернативной (например, зрелой формы без сигнального пептида или полипептида, который представлен на поверхности вируса (например, гриппа)) формы полипептида, содержащего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 и остатков 341-562 SEQ ID NO:6; любого полипептида, который кодируется полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях высокой жесткости по существу по всей длине полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, остатков 89-1063 SEQ ID NO:1, остатков 1064-1729 SEQ ID NO:1, остатков 88-1062 SEQ ID NO:5 и остатков 1063-1728 SEQ ID NO:5; любого полипептида, который кодируется полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях высокой жесткости с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, остатков 89-1063 SEQ ID NO:1, остатков 1064-1729 SEQ ID NO:1, остатков 88-1062 SEQ ID NO:5 и остатков 1063-1728 SEQ ID NO:5; и фрагмента любого указанного выше, где последовательность содержит полипептид гемагглютинина или нейраминидазы или фрагмент полипептида гемагглютинина или нейраминидазы. В одном из вариантов осуществления такие полипептидные фрагменты образуют антитело, которое специфически связывает полноразмерный полипептид по изобретению. В различных вариантах осуществления выделенные или рекомбинантные полипептиды по изобретению по существу идентичны приблизительно 300 последовательным аминокислотным остаткам любого из указанных выше полипептидов. В других вариантах осуществления изобретение содержит выделенные или рекомбинантные полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность, которая по существу идентична по меньшей мере приблизительно 350 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 400 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 450 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 500 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 520 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 550 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 559 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 565 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 566 аминокислотам, последовательно расположенным в любом из указанных выше полипептидов. В некоторых вариантах осуществления полипептидная последовательность (например, которая перечислена в «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ» в настоящем документе) содержит менее чем 565, 559 и т.д. аминокислот. В таких вариантах осуществления более короткие перечисленные полипептиды необязательно содержат менее чем 565, 559 и т.д. аминокислот. В других вариантах осуществления полипептиды по изобретению (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатки 16-340 SEQ ID NO:2, остатки 341-562 SEQ ID NO:2, остатки 16-340 SEQ ID NO:6 и остатки 341-562 SEQ ID NO:6) необязательно содержат слитые белки, белки с лидерной последовательностью, полипептид-предшественник, белки с сигналом секреции или сигналом локализации или белки с эпитопными метками, меткой «E-tag» или гистидиновой (His) эпитопной меткой. В других вариантах осуществления данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательностей с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 и остатков 341-562 SEQ ID NO:6. В другом варианте осуществления полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от любого из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 или остатков 341-562 SEQ ID NO:6 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислотных остатков. Последовательности гемагглютинина по изобретению могут содержать эти последовательности как с немодифицированными, так и с модифицированными многоосновными сайтами расщепления (тем самым делая возможным рост вирусов в яйцах). Полипептидные последовательности гемагглютинина SEQ ID NO:2 и 6 содержат эндогенные аминоконцевые сигнальные пептидные последовательности, однако полипептидные последовательности гемагглютинина по изобретению также содержат зрелую (с отщепленным аминоконцевым сигнальным пептидом) форму полипептидов гемагглютинина. Сайты расщепления любой полипептидной последовательности гемагглютинина любого штамма гриппа можно обычным способом определить или предсказать, используя любое число способов из данной области.

В других аспектах изобретение относится к композиции с одним или несколькими перечисленными выше полипептидами или их фрагментами. Изобретение также включает полипептиды, которые специфически связывают поликлональные антисыворотки, индуцированные против по меньшей мере 1 антигена, который содержит по меньшей мере одну описанную выше аминокислотную последовательность или ее фрагмент. Такие антитела со специфичностью к описанным выше полипептидам также являются признаками изобретения. В одном из вариантов осуществления полипептиды по изобретению являются иммуногенными.

Изобретение также относится к иммуногенным композициям, содержащим иммунологически эффективное количество одного или нескольких любых описанных выше полипептидов (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатки 16-340 SEQ ID NO:2, остатки 341-562 SEQ ID NO:2, остатки 16-340 SEQ ID NO:6 и остатки 341-562 SEQ ID NO:6), а также к способам стимуляции иммунной системы индивидуума для получения защитного иммунного ответа против вируса гриппа посредством введения индивидууму иммунологически эффективного количества любого из указанных выше полипептидов в физиологически приемлемом носителе.

Дополнительно изобретение относится к реассортантному вирусу гриппа, который содержит один или несколько указанных выше полипептидов или полинуклеотидов в дополнение к иммуногенным композициям, содержащим иммунологически эффективное количество такого реассортантного вируса гриппа. Способы стимуляции иммунной системы индивидуума для получения защитного иммунного ответа против вируса гриппа посредством введения иммунологически эффективного количества такого реассортантного вируса гриппа в физиологически приемлемом носителе также являются частью изобретения.

В других аспектах изобретение содержит выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, который выбран из: полинуклеотида, содержащего любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, остатков 89-1063 SEQ ID NO:1, остатков 1064-1729 SEQ ID NO:1, остатков 88-1062 SEQ ID NO:5 и остатков 1063-1728 SEQ ID NO:5 или комплементарных им последовательностей, полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 и остатков 341-562 SEQ ID NO:6, или его комплементарных им нуклеотидных последовательностей, полинуклеотида, который гибридизуется в условиях высокой жесткости по существу по всей длине любого из описанных выше полинуклеотидов, и полинуклеотида, содержащего всю или фрагмент любой из таких нуклеотидных последовательностей, где последовательность кодирует полипептид гемагглютинина или нейраминидазы или фрагмент полипептида гемагглютинина или нейраминидазы. Изобретение также включает выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, которая по существу идентична по меньшей мере приблизительно 300 аминокислотам любого полипептида, кодируемого указанными выше полинуклеотидами, или по меньшей мере приблизительно 350 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 400 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 450 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 500 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 502 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 550 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 559 аминокислотам; по меньшей мере приблизительно 565 аминокислотам; или по меньшей мере приблизительно 566 аминокислотам любого полипептида, кодируемого указанными выше полинуклеотидами. Кроме того, в ситуациях, где аминокислота имеет длину менее чем, например, 566, 565, 559 и т.д. (например, см. «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ»), следует понимать, что длина необязательно составляет менее чем 566, 565, 559 и т.д. Изобретение также включает любой из указанных выше полинуклеотидов, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид гемагглютинина или нейраминидазы или один или несколько фрагментов одного или нескольких полипептидов гемагглютинина или нейраминидазы. Другие аспекты по изобретению включают выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид (например, полипептид гемагглютинина или нейраминидазы), последовательность которого обладает по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 98,5% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью, по меньшей мере 99,2% идентичностью, по меньшей мере 99,4% идентичностью, по меньшей мере 99,6% идентичностью, по меньшей мере 99,8% идентичностью или по меньшей мере 99,9% идентичностью с по меньшей мере одним из описанных выше полипептидов. Изобретение также содержит выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, полученный посредством созревания или рекомбинации одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов. В одном из вариантов осуществления полинуклеотид по изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или несколько, например, из лидерной последовательности, последовательности предшественника или последовательности эпитопной метки или подобную, и необязательно может кодировать слитый белок.

В других вариантах осуществления изобретение относится к композиции веществ, которая содержит два или более описанных выше полинуклеотидов (например, библиотеку, содержащую по меньшей мере приблизительно 2, 5, 10, 50 или более полинуклеотидов). Такие композиции необязательно можно получать расщеплением одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов (например, механически, химически, ферментативно рестрикционной эндонуклеазой/РНКазой/ДНКазой и т.д.). Другие композиции по изобретению включают, например, композиции, полученные инкубированием одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и термостабильной полинуклеотидной полимеразы.

Изобретение также относится к клеткам, содержащим по меньшей мере один из описанных выше полинуклеотидов или его расщепленный или амплифицированный фрагмент или продукт. Такие клетки необязательно могут экспрессировать полипептид, кодируемый таким полинуклеотидом. Другие варианты осуществления изобретения включают векторы (например, плазмиды, космиды, фаги, вирусы, вирусные фрагменты и т.д.), которые содержат любой из описанных выше полинуклеотидов. Такие векторы необязательно могут включать вектор экспрессии. Предпочтительные векторы экспрессии по изобретению включают, но без ограничения, векторы, которые содержат последовательности промоторов и терминатора pol I, или векторы, использующие как промоторы pol I, так и pol II, «систему промоторов pol I/pol II» (например, Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; US20020164770; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; и US20030035814). Клетки, трансдуцированные такими векторами, также входят в настоящее изобретение.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к вирусу (например, к вирусу гриппа), содержащему один или несколько описанных выше полинуклеотидов (например, кодирующих гемагглютинин и/или нейраминидазу) или один или несколько их фрагментов. Иммуногенные композиции, содержащие такой вирус, также являются частью настоящего изобретения. Такие вирусы могут включать реассортантный вирус, такой как реассортантный вирус 6:2 (например, содержащий 6 внутренних геномных сегментов из одного или нескольких вирусов-доноров и 2 геномных сегмента (например, геномные сегменты HA или NA), содержащие один или несколько описанных выше полинуклеотидов (или один или несколько их фрагментов)). В одном из вариантов осуществления геномный сегмент может кодировать полипептид гемагглютинина и/или нейраминидазы по изобретению. В одном из вариантов осуществления реассортантные вирусы по изобретению представляют собой живые вирусы. В другом варианте осуществления реассортантный вирус по изобретению представляет собой чувствительный к температуре (ts), адаптированный к холоду (ca) или аттенуированный (att) вирус. В одном из вариантов осуществления реассортантный вирус по изобретению содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или 6 внутренних геномных сегментов вируса-донора (например, A/Ann Arbor/6/60, PR8 и т.д.). В другом варианте осуществления реассортантный вирус по изобретению содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или 6 внутренних геномных сегментов вируса-донора, отличного от A/Ann Arbor/6/60. Один предпочтительный вариант осуществления изобретения представляет собой реассортантный вирус гриппа, где вирус представляет собой реассортантный вирус гриппа 6:2 и содержит 6 внутренних геномных сегментов из A/Ann Arbor/6/60 и 2 геномных сегмента, которые кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептидов SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 и остатков 341-562 SEQ ID NO:6. В альтернативном варианте осуществления реассортантный вирус гриппа по изобретению содержит реассортантный вирус гриппа 6:2, где указанный вирус содержит 6 внутренних геномных сегментов из одного или нескольких вирусов-доноров, отличных от A/Ann Arbor/6/60, и 2 геномных сегмента, которые кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептидов SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатков 16-340 SEQ ID NO:2, остатков 341-562 SEQ ID NO:2, остатков 16-340 SEQ ID NO:6 и остатков 341-562 SEQ ID NO:6. В другом альтернативном варианте осуществления реассортантный вирус гриппа по изобретению включает реассортантный вирус гриппа 6:2, где указанный вирус содержит 6 внутренних геномных сегментов из одного или нескольких вирусов-доноров, отличных от A/Ann Arbor/6/60, и 2 геномных сегмента, где 2 геномных сегмента кодируют полипептиды HA и/или NA из любого пандемического штамма гриппа. Способы получения реассортантного вируса гриппа путем культивирования клетки-хозяина, содержащей вирус гриппа, в подходящей среде для культивирования в условиях, обеспечивающих репликацию реассортантного вируса гриппа, и выделения реассортантного вируса гриппа из одной или нескольких клеток-хозяев или из среды также являются частью изобретения.

В других вариантах осуществления в настоящем документе изобретение включает иммуногенные композиции, которые содержат иммунологически эффективное количество любого из описанных выше реассортантных вирусов гриппа. Другие варианты осуществления содержат способы стимуляции иммунной системы индивидуума для получения защитного иммунного ответа против вируса гриппа посредством введения индивидууму иммунологически эффективного количества любого описанного выше реассортантного вируса гриппа (необязательно в физиологически эффективном носителе).

Другие аспекты по изобретению включают способы получения выделенного или рекомбинантного полипептида посредством культивирования любой описанной выше клетки-хозяина в подходящей среде для культивирования в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида, и выделения полипептида из одной или нескольких клеток-хозяев или из среды, в которой росли клетки.

Иммуногенные композиции также являются признаками изобретения. Например, иммуногенные композиции, содержащие один или несколько любых описанных выше полипептидов и/или полинуклеотидов и необязательно эксципиент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент, или один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов введения. Иммуногенные композиции по изобретению также могут содержать любой один или несколько описанных выше вирусов (например, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми компонентами введения).

Способы получения иммуногенных реакций у субъекта посредством введения эффективного количества любого из указанных выше вирусов (или иммуногенных композиций) субъекту также входят в настоящее изобретение. Дополнительно способы профилактического или терапевтического лечения вирусной инфекции (например, вируса гриппа) у субъекта посредством введения любого одного или нескольких описанных выше вирусов (или иммуногенных композиций) в количестве, эффективном для получения иммуногенной реакции против вирусной инфекции, также являются частью настоящего изобретения. Субъекты для такого лечения включают в качестве неограничивающих примеров птиц (например, домашних птиц) и млекопитающих (например, людей). Такие способы также могут включать введение субъекту in vivo, а также введение в одну или несколько клеток субъекта in vitro или ex vivo. Дополнительно такие способы также могут включать введение композиции вируса и фармацевтически приемлемого эксципиента, которые вводят субъекту в количестве, эффективном для профилактического или терапевтического лечения вирусной инфекции.

В других аспектах изобретение включает композиции веществ, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды гемагглютинина и/или нейраминидазы одного или нескольких пандемических штаммов гриппа, и нуклеотидные последовательности, которые кодируют один или несколько полипептидов из A/Ann Arbor/6/60. Дополнительно изобретение включает композиции веществ, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды гемагглютинина и/или нейраминидазы одного или нескольких пандемических штаммов гриппа, и нуклеотидные последовательности, которые кодируют один или несколько полипептидов из PR8, A/LENINGRAD/17 или A/Ann Arbor/6/60. Такие последовательности могут содержать те, что перечислены в «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ» в настоящем документе. Дополнительно предпочтительные варианты осуществления изобретения включают композиции веществ, содержащие последовательности, которые кодируют гемагглютинин и/или нейраминидазу одного или нескольких пандемических штаммов гриппа, и нуклеотидные последовательности, которые кодируют выбранный основной штамм в реассортанте 6:2. Такие композиции предпочтительно содержат последовательности, которые кодируют гемагглютинин и нейраминидазу, выбранные из «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ» в настоящем документе и основного штамма, где основным штаммом является PR8, A/LENINGRAD/17 или A/Ann Arbor/6/60. Изобретение также включает такие композиции, как описано выше, где гемагглютинин содержит модифицированный многоосновный сайт расщепления. Изобретение также включает живую аттенуированную противогриппозную вакцину, которая содержит такие указанные выше композиции.

Эти и другие цели и признаки изобретения более полно проявятся после прочтения следующего подробного описания в сочетании с сопроводительными фигурами и приложением.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1: репликация вирусов контрольного заражения H2 wt в легких хорьков, вакцинированных различными показанными вакцинными вирусами H2. Титр показывает среднее для правого и левого легких.

На фиг. 2: репликация вирусов контрольного заражения H2 wt в NT хорьков, вакцинированных различными показанными вакцинными вирусами H2.

На фиг. 3: репликация вирусов контрольного заражения H2 wt в легких мышей, вакцинированных различными показанными вакцинными вирусами H2.

На фиг. 4: репликация вирусов контрольного заражения H2 wt в NT мышей, вакцинированных различными показанными вакцинными вирусами H2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к полипептидам и полинуклеотидам гемагглютинина и нейраминидазы гриппа, а также к векторам, композициям, реассортантным вирусам гриппа и т.п., которые содержат такие полипептиды и полинуклеотиды, и к способам их использования. В настоящем документе более подробно описаны дополнительные признаки изобретения.

Определения

Пока не определено иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют такое же значение, в котором их обычно понимает специалист в той области, к которой относится изобретение. Следующие определения дополняют известное в данной области и ориентированы на данную заявку и их необязательно следует приписывать к любому связанному или несвязанному случаю, например, к любому обычно допускаемому патентом или заявкой. Несмотря на то, что любые способы и вещества, схожие или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать на практике для тестирования по настоящему изобретению, предпочтительные вещества и способы описаны в настоящем документе. Таким образом, использованная в настоящем документе терминология приведена только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

Как используют в этом описании и приложенной формуле изобретения, форма единственного числа включает множественную форму обозначаемого до тех пор, пока контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, указание на «вирус» включает множество вирусов; указание на «клетку-хозяина» включает смеси клеток-хозяев и т.п.

Термин «реассортант», когда он указывает на вирус, говорит о том, что вирус содержит генетические и/или полипептидные компоненты, полученные из более чем одного родительского вирусного штамма или источника. Например, реассортант 7:1 содержит 7 вирусных геномных сегментов (или генных сегментов) от первого вируса и один дополняющий вирусный геномный сегмент, например, кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу по изобретению. Реассортант 6:2 содержит 6 геномных сегментов, например, 6 внутренних геномных сегментов от первого вируса и два дополняющих геномных сегмента, т.е. геномные сегменты, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, от второго вируса или от второго и третьего вируса.

Термин «клетка-хозяин» обозначает клетку, которая содержит гетерологичный полинуклеотид, такой как вектор, и поддерживает репликацию и/или экспрессию полинуклеотида. Клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки, такие как E. coli, или эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, насекомых, амфибий, птиц или млекопитающих, включая клетки человека. В одном из вариантов осуществления клетки-хозяева могут представлять собой, но без ограничения, клетки Vero (почка африканской зеленой мартышки), клетки BHK (почка детеныша хомяка), первичные клетки почки курицы (PCK), клетки почки собаки Мадин-Дарби (MDCK), клетки почки коровы Мадин-Дарби (MDBK), клетки 293 (например, клетки 293T) и клетки COS (например, клетки COS1, COS7).

«Иммунологически эффективное количество» вируса гриппа представляет собой количество, достаточное для усиления собственного иммунного ответа индивидуума (например, человека) при последующем контакте с вирусом гриппа. Уровни индуцированного иммунитета можно отслеживать, например, посредством измерения количеств нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, посредством нейтрализации бляшек, фиксации комплемента, иммуносорбента, меченного ферментом, или анализа микронейтрализации.

«Защитный иммунный ответ» против вируса гриппа относится к иммунному ответу, который проявляет индивидуум (например, человек), который защищает от заболевания, когда впоследствии у индивидуума происходит контакт и/или инфицирование таким вирусом гриппа. В некоторых случаях вирус гриппа (например, циркулирующий в природе) все еще может вызывать инфекцию, но не может вызывать тяжелую инфекцию. В типичном случае защитный иммунный ответ приводит к обнаружимым уровням образуемых хозяином сывороточных и секреторных антител, которые способны нейтрализовать вирус того же штамма и/или подгруппы (а также, возможно, другой не вакцинный штамм и/или подгруппу) in vitro и in vivo.

В настоящем документе «антитело» представляет собой белок, который содержит один или несколько полипептидов, по существу или частично кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, ипсилон и мю, а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа или ипсилон, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулин IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, которые несут основную ответственность за распознавание антигена. Термины «вариабельная легкая цепь» (VL) и «вариабельная тяжелая цепь» (VH) относятся к этим легким и тяжелым цепям, соответственно. Антитела существуют в виде интактных иммуноглобулинов или в виде множества хорошо описанных фрагментов, которые получают расщеплением с использованием различных пептидаз. Таким образом, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области с получением F(ab)'2, димера Fab, который сам по себе представляет легкую цепь, соединенную с VH-CH1 дисульфидной связью. F(ab)'2 можно разделить в мягких условиях с разрушением дисульфидной связи в шарнирной области, тем самым превращая димер (Fab')2 в мономер Fab'. По существу мономер Fab' представляет собой Fab с частью шарнирной области (более подробное описание других фрагментов антител см. в Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)). Несмотря на то, что различные фрагменты антител определены в отношении расщепления интактного антитела, профессионал признает, что такие фрагменты Fab' можно синтезировать de novo или химически или используя способы рекомбинации ДНК. Таким образом, термин антитело, как применяют в настоящем документе, содержит антитела или фрагменты, полученные или модификацией целого антитела, или синтезированные de novo с использованием способов рекомбинации ДНК. Антитела содержат, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, много- или одноцепочечные антитела, включая одноцепочечные Fv (sFv или scFv) антитела, в которых вариабельная тяжелая и вариабельная легкая цепи соединены вместе (напрямую или через пептидный линкер) с образованием непрерывного полипептида, и гуманизированные или химерные антитела.

Вирус гриппа

Полипептиды и полинуклеотиды по изобретению, например, SEQ ID NO:1-8, представляют собой варианты последовательностей HA и NA гриппа. В основном, вирусы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового ядра, содержащего сегментированный одноцепочечный РНК геном, и внешней липопротеиновой оболочки, выложенной матриксным белком. Геном вирусов гриппа состоит из восьми геномных сегментов линейной (-) цепи рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая кодирует иммуногенные белки гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), и шесть внутренних полипептидов ядра: нуклеопротеин нуклеокапсида (NP); матриксные белки (M); неструктурные белки (NS); и 3 белка РНК полимераз (PA, PB1, PB2). Во время репликации происходит транскрипция геномной вирусной РНК в (+) цепь информационной РНК и (-) цепь геномной кРНК в ядре клетки-хозяина. Каждый из восьми геномных сегментов упакован в рибонуклеопротеиновые комплексы, которые в дополнение к РНК содержат NP и полимеразный комплекс (PB1, PB2 и PA).

Обычно грипп разделяют на категории грипп A и грипп B. Вирусы гриппа A и гриппа B содержат по восемь сегментов одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью. Геном гриппа A кодирует одиннадцать полипептидов. Сегменты 1-3 кодируют три полипептида, образующие РНК-зависимую РНК полимеразу. Сегмент 1 кодирует белок полимеразного комплекса PB2. Остальные белки полимераз PB1 и PA кодируют сегмент 2 и сегмент 3, соответственно. Кроме того, сегмент 1 некоторых штаммов гриппа кодирует малый белок, PB1-F2, который образуется из альтернативной рамки считывания в кодирующей PB1 области. Сегмент 4 кодирует поверхностный гликопротеин гемагглютинин (HA), который участвует в прикреплении и проникновении в клетку во время инфекции. Сегмент 5 кодирует полипептид нуклеопротеина нуклеокапсида (NP), основной структурный компонент, связанный с вирусной РНК. Сегмент 6 кодирует оболочечный гликопротеин нейраминидазу (NA). Сегмент 7 кодирует два матриксных белка, обозначенные М1 и M2, которые транслируются с дифференциально сплайсированной мРНК. Сегмент 8 кодирует NS1 и NS2, два неструктурных белка, которые транслируются с альтернативно сплайсированных вариантов мРНК. Восемь геномных сегментов гриппа B кодируют 11 белков. Три самых больших гена кодируют компоненты РНК полимеразы, PB1, PB2 и PA. Сегмент 4 кодирует белок HA. Сегмент 5 кодирует NP. Сегмент 6 кодирует белок NA и белок NB. Оба белка, NB и NA, транслируются с перекрывающихся рамок считывания двухцистронной мРНК. Сегмент 7 гриппа B также кодирует два белка: М1 и BM2. Самый маленький сегмент кодирует два продукта: NS1 транслируется с полноразмерной РНК, тогда как NS2 транслируется со сплайсированного варианта мРНК.

Вакцина против вируса гриппа

Последовательности, композиции и способы в настоящем документе главным образом, но не исключительно, связаны с получением вирусов гриппа для вакцин. Исторически вакцины против вируса гриппа главным образом получали в куриных яйцах с зародышами с использованием штаммов вируса, выбранных или основанных на эмпирических предсказаниях ожидаемых штаммов. Затем получали реассортантные вирусы, которые содержат выбранные антигены гемагглютинин и/или нейраминидазу с учетом одобренного аттенуированного, чувствительного к температуре исходного штамма. После культивирования вируса посредством нескольких пассирований в куриных яйцах, вирусы гриппа выделяли и необязательно инактивировали, например, используя формальдегид и/или β-пропиолактон (или альтернативно использовали в живых аттенуированных вакцинах). Таким образом, следует принимать во внимание, что последовательности HA и NA (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, остатки 16-340 SEQ ID NO:2, остатки 341-562 SEQ ID NO:2, остатки 16-340 SEQ ID NO:6 и остатки 341-562 SEQ ID NO:6) достаточно эффективны в конструировании противогриппозных вакцин. Настоящее изобретение включает вирусы/вакцины, содержащие полипептиды HA и/или NA и полинуклеотиды из A/Japan/57 и A/swine/MO/2006 (включая те полипептиды и полинуклеотиды HA, которые содержат модифицированные многоосновные сайты расщепления, такие как модификации, описываемые в настоящем документе); и включая те вирусы/вакцины, которые содержат остов (т.е. 6 внутренних геномных сегментов), такой как остов ca A/AA/6/60, A/Leningrad/17 или PR8.

Попытки получения рекомбинантных и реассортантных вакцин в культуре клеток были осложнены неспособностью некоторых штаммов, одобренных для получения вакцины, к эффективному росту в стандартных условиях культивирования клеток. Однако перед работой авторы настоящего изобретения и их коллеги предоставили векторную систему и способы для получения рекомбинантных и реассортантных вирусов в культуре и, таким образом, сделали возможным быстрое получение вакцин, соответствующих одному или нескольким выбранным антигенным штаммам вируса, например, любому из штаммов A или B, различным субтипам или субштаммам и т.д., например, содержащим последовательности HA и/или NA, приведенным в настоящем документе. См., Multi-Plasmid System for the production of influenza virus, заявку США № 60/420708, которая подана 23 октября 2002 года, заявку США № 10/423828, которая подана 25 апреля 2003 года, и заявку США № 60/574117, которая подана 24 мая 2004 года. Обычно культуры поддерживают в системе, такой как инкубатор культуры клеток, под контролем влажности и CO₂, при постоянной температуре с использованием регулятора температуры, такого как термостат, для того чтобы гарантировать, что температура не превысит 35°C. Реассортантные вирусы гриппа можно быстро получить введением поднабора векторов, соответствующих геномным сегментам исходного вируса гриппа, в сочетании с дополняющими сегментами, полученными из штаммов, представляющих интерес (например, антигенные варианты HA и/или NA, приведенные в настоящем документе). Обычно исходные штаммы выбирают на основе желаемых свойств, относящихся к введению вакцины. Например, для получения вакцины, например, для получения живой аттенуированной вакцины, исходный штамм вируса-донора можно выбирать по аттенуированному фенотипу, холодовой адаптации и/или чувствительности к температуре. В одном из вариантов осуществления сходный вирус-донор содержит 6 внутренних геномных сегментов (т.е. остов), который дает одно или несколько следующих свойств: чувствительный к температуре, адаптированный к холоду или аттенуированный. Как объясняется в другой ча